固定化青霉素酰化酶對熒光假單胞菌群體感應(yīng)的抑制作用

申 悅，勞敏軍，王當(dāng)豐，崔方超*，林 洪，李婷婷，勵建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司 浙江舟山 316120 3 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266100 4 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116600）

微生物的生長代謝是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主要原因之一。在水產(chǎn)品腐敗過程中，通常只有1 種或幾種微生物起主要作用，這些細(xì)菌就是優(yōu)勢腐敗菌（Specific spoilage organisms，SSOs）[1]。隨著微生物的繁殖，細(xì)菌密度逐漸增大，細(xì)菌通過自身合成并釋放自誘導(dǎo)物——信號分子，來調(diào)控其生物行為（如生物發(fā)光、生物被膜形成、毒力因子表達(dá)及浮游等），這一過程稱為群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）[2]。López-Martín 等[3]發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌的QS 系統(tǒng)在調(diào)節(jié)表面運動、生物膜形成和毒力方面起著重要作用。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是水產(chǎn)品貯藏過程中常見的嗜冷菌，屬于好氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性細(xì)菌。因其適應(yīng)性強、生長周期短、胞外酶活性高，故被公認(rèn)為動物和水產(chǎn)品中的SSOs[4]。熒光假單胞菌能分泌N-?；呓z氨酸內(nèi)酯 （N-acyl-homoserine lactones，AHLs）作為信號分子，來調(diào)控水產(chǎn)品的腐敗[5]。對QS 系統(tǒng)的干擾或破壞有助于控制許多致腐菌腐敗表型的表達(dá)，從而延長水產(chǎn)品貨架期。

通常將能夠以QS 為靶標(biāo)，干擾信號通路的物質(zhì)稱為群體感應(yīng)抑制劑 （Quorum sensing inhibitors，QSIs）[6]。它們能在不殺死或不干擾細(xì)菌正常生命活動的前提下有效調(diào)控菌群的結(jié)構(gòu)和功能[7]。目前QSIs 主要從3 個方面抑制QS：①通過阻斷LuxI 型合酶中斷AHL 信號合成；②通過群體感應(yīng)淬滅酶（Quorum quenching enzymes）降解AHLs 信號傳播，減少AHLs 的積累；③干擾信號受體或阻斷AHL/LuxR 復(fù)合物[8]。這些方法旨在減少群體感應(yīng)介導(dǎo)的表型表達(dá)，而不會對細(xì)菌產(chǎn)生其它破壞性的影響。群體感應(yīng)淬滅酶中，研究最廣泛的是AHL 乳糖酶和AHL ?；?，這兩類的酶均以AHLs 為底物。AHL 乳糖酶通過水解內(nèi)酯環(huán)上的酯鍵產(chǎn)生?；呓z氨酸，使短鏈和長鏈AHLs失活。相比之下，AHL ?；竿ǔ?cè)鏈長度超過10 個碳的AHLs 最有效[9]。AHL ?；缚梢苑纸釧HLs 的酰胺鍵，產(chǎn)生相應(yīng)的脂肪酸和高絲氨酸內(nèi)酯（HSL），其作用方式與青霉素酰化酶的作用方式非常相似。通過詳細(xì)的結(jié)構(gòu)研究，已證實AHL?；概c其它青霉素?；笇儆谕籒tn 水解酶超家族。由此可推測：青霉素酰化酶和其它Ntn 水解酶超家族酶可能具有切割A(yù)HLs 的能力[10]。2014年，Mukherji 等[11]首次報道了產(chǎn)自檸檬克魯維酵母（Kluyvera citrophila）的青霉素G ?；福↘cPGA）活性，通過生化分析和分子對接驗證了無論是否經(jīng)過3-氧基修飾，KcPGA 對含6～8 個碳原子的AHLs 都具有活性。

產(chǎn)自巨大芽孢桿菌的青霉素?；钢饕脕砗铣汕嗝顾鼗蝾^孢霉素類抗生素，為了方便工業(yè)應(yīng)用[12]，越來越多的研究集中于酶的性質(zhì)方面。由于固定化酶靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單、成本低，因此被廣泛應(yīng)用于在食品工業(yè)中，降低了食品生產(chǎn)成本，也減少了生產(chǎn)過程中造成的污染[13]。迄今為止，尚未有文獻(xiàn)報道固定化青霉素酰化酶對QS 的淬滅作用。本文以市售青霉素?；笧閷ο?，研究其對水產(chǎn)腐敗菌的QS 淬滅作用，以期為其在抑制水產(chǎn)品腐敗方面的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紫色桿菌 （Chromobacterium violaceum 026，CV026） 為紫色桿菌ATCC 31532 的mini-Tn5 突變體，卡那霉素抗性，僅當(dāng)存在外源短鏈AHLs（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL）時，菌株CV026 產(chǎn)生特征性紫色色素。供試菌株熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）從腐敗大菱鲆中分離、鑒定。兩種菌株均保藏于渤海大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)品貯藏與加工研究所。

固定化青霉素?；福a(chǎn)自巨大芽孢桿菌（酶活力：≥240 U/g），上海笛柏生物科技有限公司；卡那霉素、冰醋酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯，天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶紫，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；載玻片，江蘇飛舟玻塑有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基、LB 營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Skim Milk 脫脂奶粉，北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇景集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Biofuge Stratos 臺式高速離心機，美國Thermo Fisher 公司；LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；MS105UD電子分析天平，瑞士梅特勒-托利儀器有限公司；imark 酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD；Nikon80i 顯微鏡，日本尼康公司；Agilent 7890N/5975 氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）儀，美國Agilent 公司；LRH 系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 固定化青霉素酰化酶抑菌活性確定及QSIs活性檢測 參考梅永超等[14]的方法略加修改，將CV026 和熒光假單胞菌過夜培養(yǎng)對數(shù)期（106CFU/mL），按1 ∶100 的體積比接種于LB 肉湯中（培養(yǎng)CV026 的LB 肉湯中需含有20 μg/mL 卡那霉素；培養(yǎng)熒光假單胞菌的肉湯中分別含有0，2.5，5，10，15，20，25 mg/mL 的固定化青霉素酰化酶），28 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)16～18 h。吸取200 μL 加入不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；概囵B(yǎng)的熒光假單胞菌菌液添加到96 孔板中，用酶標(biāo)儀于波長595 nm 測定OD 值，觀察酶對菌株生長的影響。將用牛津杯提前放入平板中的10 mL CV026 與100 mL LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，倒平板，孔中加入不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；概囵B(yǎng)過的熒光假單胞菌上清液，以沒有加固定化青霉素酰化酶培養(yǎng)的熒光假單胞菌上清液為空白對照，28 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h 后，觀察紫色菌素的產(chǎn)生情況。

1.3.2 固定化青霉素?；笇ψ仙禺a(chǎn)生的影響 根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]，菌株CV026 過夜活化后，按1∶100 的體積比接種于含有不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；?（0，2.5，5，10，15，20，25 mg/mL）的LB 肉湯中，并加入200 μL 的AHLs 粗提液，160 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。而后依次吸取300 μL 培養(yǎng)液于1.5 mL 離心管中，加入150 μL 10%十二烷基硫酸鈉，振蕩10 s，加入600 μL 正丁醇，振蕩5 s，10 000 r/min 離心5 min，吸取200 μL 紫色上清液添加到96 孔板中，用酶標(biāo)儀測定OD595nm，以不加信號分子的試驗組作為對照。

1.3.3 固定化青霉素?；笇晒饧賳伟锉荒さ挠绊?/p>

1） 酶標(biāo)板法測定生物被膜 將過夜培養(yǎng)的熒光假單胞菌，按1∶100 的體積比接種于LB 肉湯中，分裝至無菌離心管，每管4 mL，加入終質(zhì)量濃度為0，2.5，5，10，15，20，25 mg/mL 的固定化青霉素酰化酶，培養(yǎng)36 h，以沒有加酶為對照，每組3次重復(fù)，具體參照孫曉佳等[16]的方法。取菌液測定波長595 nm 處的菌液密度后，棄去菌液，用無菌水清洗3 次，無菌風(fēng)干燥30 min，使生物被膜固定在離心管內(nèi)壁后，取1 mL 0.2%的結(jié)晶紫染色15 min。棄去染色液，無菌水清洗3～5 次至干凈透明。用33%（φ）冰乙酸溶解固定著的染色液。用酶標(biāo)儀測定波長595 nm 下的吸光度，每處理組取3 個平行。生物被膜的相對生成率按公式（1）計算：

2） 光學(xué)顯微鏡觀察固定化青霉素酰化酶對生物被膜形態(tài)的影響 載玻片（普通載玻片，25.4 mm×76.2 mm，厚度1～2 mm）預(yù)處理：置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中浸泡24 h 后，用蒸餾水洗凈、烘干，滅菌備用。

在無菌培養(yǎng)皿中加入10 mL 含有1%熒光假單胞菌的LB 肉湯，并分別加入終質(zhì)量濃度為0，2.5，5，10，15，20，25 mg/mL 的固定化青霉素酰化酶，混合均勻后放入處理后的載玻片，28 ℃靜置培養(yǎng)36 h。同時，設(shè)立沒有添加酶的陰性對照組。36 h 后取出載玻片，無菌水沖洗，除去浮游菌及黏液，置于無菌培養(yǎng)皿中，加入適量甲醇固定15 min，再加入適量2%結(jié)晶紫溶液染色5 min 后，用無菌水沖洗干凈，室溫下干燥，干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照記錄。

3） 掃描電鏡觀察固定化青霉素?；笇ι锉荒ば螒B(tài)的影響 將載玻片換成鋅片，前期操作同1.3.3（2），培養(yǎng)36～48 h。結(jié)束后用無菌水反復(fù)沖洗，洗去表面的浮菌。將鋅片放入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，取出用50%，70%，80%，90%，100%的乙醇梯度脫水，自然干燥后噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.4 固定化青霉素酰化酶對熒光假單胞菌胞外蛋白酶活力的影響 參照趙陽潔[17]的方法稍作改動，制作牛奶平板，用牛津杯打孔，加入用不同質(zhì)量濃度（2.5，5，10，15，20，25 mg/mL）的固定化青霉素?；高^夜培養(yǎng)的熒光假單胞菌上清液，28℃靜置培養(yǎng)18～24 h。蛋白酶水解酪蛋白后，在孔周圍出現(xiàn)明顯的水解圈，水解圈越大，說明胞外蛋白酶活力越高。以不加固定化青霉素酰化酶的上清液為陰性對照。

1.3.5 GC-MS 測定固定化青霉素?；笇晒饧賳伟a(chǎn)AHLs 的影響 參照張清霞等[18]的方法稍作修改，熒光假單胞菌用400 mL LB 肉湯培養(yǎng)。在28 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心30 min 去沉淀，等體積乙酸乙酯（含體積分?jǐn)?shù)0.1%冰乙酸溶液） 萃取，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機相后，用2 mL 甲醇溶解，粗提液保存于-20 ℃?zhèn)溆?。向上述粗提液中加入固定化青霉素酰化酶使其終質(zhì)量濃度為25 mg/mL，以不添加固定化青霉素?；笧閷φ铡?8 ℃作用40 min 后，將樣品用有機濾膜過濾于GC-MS 檢測確定加酶前、后AHLs 的變化情況。參照孫曉佳[19]的方法設(shè)置GC-MS條件。

1.3.6 分子對接分析青霉素?；概cAHLs 的相互作用 將PDB 數(shù)據(jù)庫中獲得的青霉素?；福óa(chǎn)自巨大芽孢桿菌）6nvy 的3D 結(jié)構(gòu)，使用Discovery Studio（DS）軟件進(jìn)行3D 蛋白結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。從ZINC 數(shù)據(jù)庫 （http：//zinc.docking.org/） 中得到C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL 的3D 結(jié)構(gòu)，在DS 軟件中優(yōu)化結(jié)構(gòu)后，采用半柔性對接分析酶和配體之間的作用方式，以及酶對不同碳鏈的AHLs 的作用差異[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化青霉素?；窺S 抑制活性的確定

經(jīng)過測定培養(yǎng)結(jié)束后的菌液密度，發(fā)現(xiàn)添加不同質(zhì)量濃度的固定化青霉素酰化酶對熒光假單胞菌的生長沒有影響。因此直接選取培養(yǎng)后的上清液加入孔中與培養(yǎng)基中的CV026 作用，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)熒光假單胞菌同25 mg/mL 的固定化青霉素?；概囵B(yǎng)后，使得CV026 產(chǎn)生紫色菌素不明顯，說明固定化青霉素?；缚赡軠p少了熒光假單胞菌中的信號分子的產(chǎn)量。

圖1 固定化青霉素?；笇V026 紫色菌素的抑制作用Fig.1 Inhibition of immobilized penicillin acylase on CV026

2.2 固定化青霉素?；笇V026 紫色菌素產(chǎn)生的影響及最小抑紫濃度的確定

通過觀察CV026 產(chǎn)紫色菌素的差異性能夠看出不同酶濃度對QS 的干擾程度不同，從圖2a中能夠直觀看出酶添加量越多紫色越淺，說明固定化酰化酶的QSI 活性呈劑量依賴性。從顏色變化來看，與不加酶的對照組相比，5 mg/mL 固定化青霉素?；柑幚砜梢悦黠@降低紫色菌素的產(chǎn)量。從圖2b 可知，隨著酶質(zhì)量濃度的增大，紫色菌素逐漸減少，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時，對紫色菌素的抑制率達(dá)到38.63%，由此推斷固定化青霉素?；缚赏ㄟ^干擾QS 現(xiàn)象，使得在外源AHLs 存在的情況下，抑制CV026 紫色菌素的產(chǎn)生?？梢酝茰y固定化青霉素?；缚赏ㄟ^降解AHLs 達(dá)到抑制腐敗菌間信息交流的目的，從而減少致腐因子的產(chǎn)生以達(dá)到水產(chǎn)品保鮮的效果。

圖2 固定化青霉素酰化酶對CV026 的QSI 效應(yīng)Fig.2 QSI effect of immobilized penicillin acylase on CV026

2.3 固定化青霉素?；笇晒饧賳伟锉荒さ挠绊?/h3>

2.3.1 固定化青霉素?；笇晒饧賳伟锉荒ば纬闪康挠绊?生物被膜的形成是水產(chǎn)品污染的常見來源。研究發(fā)現(xiàn)有氧冷凍條件下貯藏時，QS 會參與新鮮肉制品的腐敗以及其表面生物被膜的形成[21]。從腐敗食品中分離到的熒光假單胞菌具有快速產(chǎn)生生物膜的特性[22]。從圖3中可看出，固定化青霉素?；傅奶砑硬]有對熒光假單胞菌的生長造成影響，隨著酶質(zhì)量濃度的升高，生物膜的生成率逐漸減小，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時，對生物被膜形成的抑制率達(dá)到57.41%。由此可知固定化酰化酶能夠有效抑制熒光假單胞菌生物膜的形成，減少其在水產(chǎn)品表面定殖。

圖3 不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；笇晒饧賳伟锉荒ば纬陕实挠绊慒ig.3 Effects of different mass concentrations of immobilized penicillin acylase on biofilm formation rate of P.fluorescens

2.3.2 固定化青霉素酰化酶對熒光假單胞菌生物被膜形態(tài)的影響 通過光學(xué)顯微鏡可以觀察到不同質(zhì)量濃度的固定化青霉素?；概囵B(yǎng)后的熒光假單胞菌生物被膜形態(tài)的微觀結(jié)構(gòu)。從圖4a 可看出隨著固定化青霉素?；纲|(zhì)量濃度的升高，生物膜的形成量逐漸減少。未加固定化青霉素?；傅臒晒饧賳伟纳锉荒ぶ忻懿嫉木w連接成緊密的膜狀物。隨著酶濃度的升高，菌體越來越稀疏，生物被膜的產(chǎn)量難以在載體上牢固附著，因此菌體無法聚集形成膜狀物。由此推斷固定化青霉素?；改軌蚪档蜔晒饧賳伟锉荒さ男纬闪?，從而減少其在水產(chǎn)品表面的附著，從而達(dá)到延緩腐敗的效果。

圖4 固定化青霉素?；笇晒饧賳伟锉荒さ挠绊慒ig.4 Light microscope observation of the effect of immobilized penicillin acylase on P.fluorescens biofilm

通過掃描電鏡能夠更加直觀的觀察到生物膜表面的結(jié)構(gòu)情況。從圖4b 中可看出沒有加酶的對照組菌體形態(tài)最為致密，結(jié)構(gòu)均勻，具有一定的層次感，無法看到單一菌體。添加不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；概囵B(yǎng)后，隨著酶質(zhì)量濃度增大，生物被膜出現(xiàn)了破裂，失去原有的立體網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，單一菌體周圍的膜包圍狀物逐漸消失，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時，出現(xiàn)了明顯單菌，表明固定化青霉素酰化酶能夠有效減弱熒光假單胞菌的成膜能力。與生物被膜形成量的測定結(jié)果一致，證實了固定化青霉素?；笇晒饧賳伟锉荒さ挠绊懀茰y其可能通過調(diào)控了QS 相關(guān)基因的表達(dá)，有效減少了胞外聚合物的生成。

2.4 固定化青霉素?；笇晒饧賳伟獾鞍酌富钚缘挠绊?/h3>

假單胞菌具有較強的水解蛋白質(zhì)和脂肪的能力，可以產(chǎn)生吲哚、苯酚、腐胺、尸胺、硫化氫等有毒物質(zhì)，并導(dǎo)致水產(chǎn)品產(chǎn)生感官不可接受性的黏液、異味[23]。通過測定胞外蛋白酶的變化，能夠了解固定化青霉素?；笇晒饧賳伟饷傅鞍酌副磉_(dá)量的影響。試驗結(jié)果如圖5所示，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，透明圈逐漸減小，且當(dāng)添加15 mg/mL 酶后，可以完全抑制胞外蛋白酶的活性。由于QS 是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，可能通過調(diào)控編碼胞外蛋白酶的基因轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)對胞外蛋白酶表達(dá)的干預(yù)[24]。Li 等[25]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中的QS 系統(tǒng)會干預(yù)其3 種胞外蛋白酶的表達(dá)，通過構(gòu)建QS 突變體研究，表明QS 系統(tǒng)不只是通過轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)這些蛋白酶的活性，即使這些蛋白酶從細(xì)胞中分泌出來，QS 系統(tǒng)仍然控制著它們的活性?；诠潭ɑ嗝顾仵；傅墓δ?，可以推測通過淬滅AHLs可抑制胞外蛋白酶的表達(dá)，而不影響其活性。

圖5 固定化青霉素?；笇晒饧賳伟獾鞍酌富钚缘挠绊慒ig.5 The effect of immobilized penicillin acylase on the extracellular protease activity of P.fluorescens

2.5 GC-MS 測定固定化酰化酶對熒光假單胞菌分泌AHLs 的影響

通過GC-MS 可以直觀看出樣品中AHLs 的變化。從圖6a 中可以看出供試菌株熒光假單胞菌主要產(chǎn)3 種信號分子，根據(jù)課題組前期的研究結(jié)果表明，出峰時間在6，8，11 min 左右所對應(yīng)的AHL 分別為C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL。由圖6b 中可看出3 種AHLs 都有下降趨勢，其中C8-HSL 下降最多，說明固定化青霉素?；笇8-HSL 的降解活性最強。張爭等[26]從植物病原菌青枯菌中鑒定出了的1 種AHL ?；窤ac 淬滅細(xì)菌的群體感應(yīng)信號，控制細(xì)菌性病害，對C8-HSL 有較強的淬滅活性。

圖6 GC-MS 檢測固定化青霉素?；笇晒饧賳伟a(chǎn)AHLs 的影響Fig.6 Effect of immobilized penicillin acylase on AHLs production by P.fluorescens detected by GC-MS

2.6 分子對接分析青霉素酰化酶與AHLs 的相互作用

分子對接是借助計算機模擬酶與底物之間的相互作用，預(yù)測其結(jié)合位點和結(jié)合強度。通過將酶與不同的底物對接可預(yù)測出與酶有相互作用的底物，為下一步試驗驗證提供理論依據(jù)。從表1可看出不同碳鏈的AHLs 與酶對接的打分情況，其中C14-HSL 的打分最高。有研究表明已知的大多數(shù)細(xì)菌AHL ?；甘荖 端親核酶（Ntn）-水解酶的成員，這類酶由多種酶組成，它們識別不同種類的底物，然而具有共同的性質(zhì)，如自動催化活化、N 端催化親核（蘇氨酸、絲氨酸或半胱氨酸）的存在和酰胺鍵的斷裂，青霉素酰化酶也是其中的一員[28]。具有AHL ?；腹δ艿那嗝顾仵；笇﹂L鏈的AHLs 作用效果較好，一般都是含有α 和β 2 個亞基的二聚體，在α 亞基上都含有1 個保守的絲氨酸活性位點，該位點與周圍的氨基酸殘基盤曲折疊成一個疏水結(jié)合囊，更適合與長鏈AHLs 結(jié)合，因此與短鏈的AHLs 作用力較弱[28]。從表1可知隨著碳鏈長度的增加，分值越來越大，說明該酶的最佳底物更偏向于長鏈AHLs。

圖7 固定化青霉素?；笇晒饧賳伟鶤HLs 的影響Fig.7 Effect of immobilized penicillin acylase on AHLs of P.fluorescens

表1 青霉素?；福óa(chǎn)自巨大芽孢桿菌）與AHLs 分子對接打分Table 1 Molecular docking score of penicillin acylase （from Bacillus megaterium） and AHLs

從上述打分結(jié)果中選擇短鏈、中長鏈、長鏈3種AHLs 進(jìn)行作用力分析，結(jié)果見圖8。圖中呈現(xiàn)了青霉素?；?nvy 與C4-HSL、C8-HSL、C14-HSL 對接的活性位點2D 圖?？梢钥闯鯝HLs 與酶之間的相互作用力，C4-HSL 與活性位點中A 鏈的天冬酰胺形成2 個氫鍵；C8-HSL 與活性位點中A鏈上的絲氨酸和天冬酰胺形成3 個氫鍵，與纈氨酸形成1 個碳?xì)滏I；C14-HSL 與活性位點中A 鏈上的蘇氨酸、酪氨酸和絲氨酸形成3 個碳?xì)滏I。僅依靠2D 圖無法確定酶與底物間的空間構(gòu)象，也無法確定酶對長鏈AHLs 偏好的原因，故又對C4-HSL 和C14-HSL 與酶結(jié)合的3D 圖進(jìn)行分析。

圖8b 分別顯示了短鏈和長鏈AHL 與青霉素?；阜肿訉拥?D 圖，從中可看出C4-HSL 與酶的結(jié)合沒有C14-HSL 緊密。C14-HSL 被結(jié)合囊周圍的氨基酸殘基全部包裹，相互以氫鍵連接，與C4-HSL 相比，氫鍵的數(shù)量較多。可能是由于C14-HSL 具有更長的碳鏈，能夠形成更多氫鍵。

圖8 青霉素?；?nvy 與AHLs 結(jié)合活性位點示意圖Fig.8 Schematic diagram of binding active sites of penicillin acylase 6nvy with AHLs

3 結(jié)論

本文研究了固定化青霉素?；福óa(chǎn)自巨大芽孢桿菌）對熒光假單胞菌的QS 抑制作用。通過紫色桿菌CV026 驗證了不同質(zhì)量濃度固定化青霉素?；笇晒饧賳伟鶤HLs 的抑制作用，表明酶的加入能夠使紫色菌素的產(chǎn)量減少，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時，抑制率達(dá)到38.63%。在酶的作用下，熒光假單胞菌的生物被膜和胞外蛋白酶活力均受到影響，且呈濃度依賴性，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時，對生物被膜形成的抑制率達(dá)到57.41%；當(dāng)酶質(zhì)量濃度為15 mg/mL 時，完全抑制了胞外蛋白酶的活性，推測是由于酶的加入干擾了熒光假單胞菌的QS 系統(tǒng)，使得蛋白酶的表達(dá)受到影響。GC-MS 結(jié)果表明，酶能夠降低熒光假單胞菌的AHLs，從而進(jìn)一步證明酶是通過與AHLs作用來干擾QS。分子對接結(jié)果表明酶對長鏈和短鏈AHLs 都有作用，然而更偏好長鏈AHLs。3D 對接圖顯示酶的活性中心會與C14-HSL 形成更多的氫鍵，從而增大兩者間的相互作用。前人已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)多種青霉素?；付加写銣鏏HLs 的作用，并且已經(jīng)利用蛋白質(zhì)工程的方法來生產(chǎn)更加穩(wěn)定、特異性和活性更強的AHLs 淬滅酶[29]，本文中酶與熒光假單胞菌的AHLs 作用后的產(chǎn)物還未清晰，需要進(jìn)一步驗證其作用機理。