HPLC-Q-Orbitrap-HRMS方法檢測廣式燒鵝中7種非極性雜環(huán)胺

董 浩，黃俊源，何昀桐，冼燕萍，白衛(wèi)東，曾曉房*

（1 仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院 廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室 現(xiàn)代農業(yè)工程創(chuàng)新研究院農業(yè)農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室 廣州 510225 2 廣州質量監(jiān)督檢測研究院 食品安全預警研發(fā)中心 廣州 510447）

雜環(huán)胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）主要是由含有豐富蛋白的食品在較高溫度及長時間的加工過程中產(chǎn)生的一種潛在的致癌物[1-3]。人體若長期或過量攝入，易增加患癌風險[4-5]。近年來雜環(huán)胺對人體的危害已成為一個備受關注的問題[6-7]。雜環(huán)胺分為氨基咪唑氮雜芳烴 （Aminoimidazoazaarenes，AIAs）和氨基咔啉（Amino-carbolines）兩大類型[8-10]。7 種常見的氨基咔琳類雜環(huán)胺（非極性雜環(huán)胺）化學結構見圖1。

圖1 7 種非極性雜環(huán)胺的化學結構式Fig.1 Chemical structural formula of 7 nonpolar HAAs

廣式燒鵝是廣東的傳統(tǒng)美食之一，其烹飪過程極易產(chǎn)生雜環(huán)胺，因此，對其雜環(huán)胺檢測方法的研究就顯得尤為必要。目前雜環(huán)胺的檢測方法雖有很多，但都存在一些的缺點和不足[11]。比如：當采用氣相色譜法和氣相色譜-質譜法時，雜環(huán)胺容易因呈極性和不易揮發(fā)的特性而吸附在色譜柱和進樣器上，導致出現(xiàn)峰展寬和拖尾等峰形惡化問題，雖然氣相色譜-質譜法解決了低濃度雜環(huán)胺不易檢出的問題[12]，但是仍需將樣品衍生化，使前處理更加復雜。液相色譜法是最常見的分析方法，它的缺點是選擇性差，靈敏度低。高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道肼高分辨質譜 （HPLC-Q-Orbitrap HRMS）的Orbitrap MS 質量分辨率、靈敏度都較好，并且能夠測定精確的相對分子質量[13]，可以根據(jù)檢測要求，反復調用在全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)，經(jīng)依賴性掃描（Data-dependent scan）可以獲得高質量的二級碎片質譜圖，實現(xiàn)對未知風險物質的非定向篩查和對已知風險物質的準確定性，彌補了傳統(tǒng)低分辨質譜方法（液相色譜-質譜/質譜法）只能測定已知化合物的局限性。近年來，食品安全檢測、蛋白組學等方面的應用研究方興未艾[14-16]。

本文利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術，建立7 種非極性雜環(huán)胺基于正離子模式下的一級母離子的精確質量數(shù)、高質量二級碎片質譜圖和保留時間等相關數(shù)據(jù)，以及7 種非極性雜環(huán)胺的MS/MS 譜庫。針對廣式燒鵝的特性，優(yōu)化樣品提取和凈化等前處理條件，采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS 正離子全掃描模式，通過提取的二級質譜圖，與上述MS/MS 譜庫比較定性，以一級質譜的精確相對分子質量峰面積與標準品比較定量，建立廣式燒鵝中非極性雜環(huán)胺的篩查定性及定量檢測方法。應用此檢測方法，抽取市場上部分廣式燒鵝的不同部位，進行非極性雜環(huán)胺的檢測，發(fā)現(xiàn)存在非極性雜環(huán)胺化合物的暴露風險。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準物質：7 種非極性雜環(huán)胺的中文名稱和英文縮寫見表1，購自上海ANPEL 公司；乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純級，德國CNW Technologies GmbH。

1.2 主要儀器及設備

超高效液相色譜-質譜聯(lián)用系統(tǒng)（該系統(tǒng)包含4 個主要部分，即自動進樣器、柱溫箱以及德國Thermofisher Scientific 的Orbitrap 高分辨質譜）；利用XCalibur 4.0 軟件控制質譜儀，以及后期的數(shù)據(jù)處理。色譜柱Thermo Accucore aQ C18（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）。MS3 digital 渦旋混合器，艾卡（廣州）儀器設備有限公司；KDC-40 低速離心機，安徽中科中佳儀器有限公司；N-EVAP 112 水浴氮吹儀，Organomation 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準品制備 參考文獻[17]的方法配制標準品。

1.3.2 樣品制備 試驗所用的燒鵝產(chǎn)品（A～D）全部購自廣州當?shù)鼐哂幸欢ㄖ鹊娘埖旰蜔D店。分別采集鵝胸、鵝翅、鵝腩、鵝腿4 個部位，將皮和肉分開處理，分別用絞肉機絞碎，在-18 ℃下貯存待用。

1.3.3 樣品提取 參考文獻[17]的方法進行樣品提取。

1.3.4 樣品凈化 參考文獻[17]的方法進行樣品凈化。

1.3.5 液相色譜-質譜聯(lián)用測定條件 液相色譜-質譜聯(lián)用測定條件參考文獻[17]的方法。

2 結果與分析

2.1 色譜條件和質譜定性、定量分析

7 種非極性雜環(huán)胺在ESI+模式下，均得到[M+H]+的準分子離子峰；乙腈和甲醇是2 種優(yōu)良的極性有機溶劑，常用作反相液相色譜的流動相，而乙腈的黏度更低，壓力更小，洗脫效率更高；在水相流動相中加入乙酸銨和甲酸分別達到了改善峰形和提高離子化效率的目的[16]；梯度洗脫可以實現(xiàn)7種目標雜環(huán)胺的良好分離。因此經(jīng)反復試驗，優(yōu)化出材料與方法中的色譜條件。根據(jù)獲得的7 種非極性雜環(huán)胺的一級高分辨質譜圖（均為[M+H]+），以及從提取一級母離子中獲取的提取離子流色譜圖，得到如表1所示結果。

表1 7 種雜環(huán)胺的保留時間和準確質量數(shù)測定數(shù)據(jù)Table 1 Determination data of retention time and accurate mass number of 7 HAAs

另外，試驗還得到了7 種非極性雜環(huán)胺的二級高分辨質譜圖（圖2），根據(jù)譜圖中顯示的主要特征碎片，構建標準譜庫。在實際樣品檢測中，該標準譜庫可進行匹配、檢索，從而達到篩查的目的，更有利于定性分析的進一步確定。同時，在篩查非靶向雜環(huán)胺時，利用擁有較高精度的質量數(shù)和特征碎片的離子，大大減少了可能的分子式組成數(shù)，從而能夠更好的推測化合物的分子式或結構，提升篩查效率。通過進一步收集雜環(huán)胺標準物質，逐步完善雜環(huán)胺的液質質譜庫，為肉制品中雜環(huán)胺的篩查和安全風險水平評估提供技術支撐。

圖2 7 種非極性雜環(huán)胺的質譜圖Fig.2 Mass spectrogram of 7 nonpolar HAAs

2.2 提取方法的優(yōu)化

常見的提取溶劑包括乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇[18]。在這些提取溶劑中，乙腈的優(yōu)點是極性范圍大，相對分子質量較小，因而具有較強的組織穿透能力，擁有良好的沉淀效果[18]。

加入堿性溶液能加快樣品的分散速度，使目標化合物更充分地被提取[19]。同時為了有效抑制雜環(huán)胺的電離，調整了目標物在水相-有機相之間鹽析時的分配比，提高了其向乙腈層轉移的效率。本文考察了不同濃度的NaOH 溶液對目標雜環(huán)胺提取效率的影響。在不同NaOH 濃度下，7 種非極性雜環(huán)胺的提取回收率見圖3a。在堿性條件下，隨著NaOH 濃度的升高，7 種非極性雜環(huán)胺的回收率整體呈上升趨勢，在1 mol/L 時的回收率最佳。當NaOH 溶液濃度為1 mol/L 時，在氮吹過程中，提取溶液并不渾濁，表明油脂提取出的量少，原因可能是NaOH 使部分油脂發(fā)生了皂化水解反應，起到了一定的除脂效果。故最終采用1 mol/L的NaOH 溶液搭配乙腈作為提取溶劑。

由于NaCl 鹽析效應在固相萃取過程中對萃取效率有顯著影響，因此研究了0，1.0，1.5，2.0，3.0 g 的NaCl 添加量對7 種非極性雜環(huán)胺提取效果的影響，結果如圖3b 所示?？梢钥闯?，在不添加NaCl 的情況下，雜環(huán)胺AαC、Trp-P-1、Trp-P-2 的回收率較差（＜60%）。當NaCl 添加量為1.0 g 時，雜環(huán)胺的提取回收率均有一定程度提高，而AαC與Trp-P-1 的回收率仍在70%以下；當NaCl 添加量增加到1.5 g 時，7 種雜環(huán)胺的提取回收率均在80%～120%之間。當NaCl 添加量繼續(xù)增加時，對雜環(huán)胺的提取回收率的變化無太大影響。因此，為獲得較優(yōu)的雜環(huán)胺提取回收率，最終選擇NaCl 添加量為1.5 g。

圖3 不同NaOH 濃度（a）和不同NaCl 添加量（b）對7 種非極性雜環(huán)胺提取回收率的影響Fig.3 Effect of different concentration of NaOH solution （a） and different NaCl addition （b） on extraction recoveries of 7 nonpolar HAAs

2.3 凈化條件的優(yōu)化

研究了2 種固相萃取柱 （StrataTM-X-C，60 mg/3 mL；PCX，60 mg/3 mL）和不使用固相萃取柱的情況，進行比較和測試。7 種雜環(huán)胺的提取回收率結果如圖4a 所示。從圖4a 可以看出，采用StrataTM-X-C 和PCX 凈化，各種非極性雜環(huán)胺均可獲得較好的回收率。StrataTM-X-C 是一種強陽離子交換柱，其鍵合了苯磺酸官能團與雜環(huán)胺上的-N+可形成較強的離子鍵，通過水和甲醇的充分淋洗除雜，Harman、AαC、MeAαC 3 種非極性雜環(huán)胺的回收率優(yōu)于使用PCX 固相萃取柱。綜上，采用StrataTM-X-C 固相萃取柱對提取溶液進行凈化，能提高待測雜環(huán)的提取回收率。

本文還研究了甲醇-氨水混合洗脫液的體積比對7 種非極性雜環(huán)胺提取回收率的影響，結果如圖4b 所示。當氨水的體積分數(shù)從5%增加到10%時，大多數(shù)非極性雜環(huán)胺的提取回收率均有一定程度的上升，而當氨水的體積分數(shù)持續(xù)增加時，部分雜環(huán)胺的回收率有不同程度的降低。在體積比為90∶10 的甲醇-氨水洗脫液下，雜環(huán)胺的整體回收率最優(yōu)。因此，本研究的固相萃取柱洗脫溶液最終確定甲醇-氨水的體積比為90∶10。

圖4 不同固相萃取柱（a）和洗脫液中甲醇與氨水的體積比（b）對7 種非極性雜環(huán)胺提取回收率的影響Fig.4 Effects of different solid phase extraction columns （a） and volume ratio of methanol to ammonia （b）in eluent on extraction recoveries of 7 nonpolar HAAs

2.4 方法學考察

用甲醇將標準儲備溶液連續(xù)稀釋至0.05，0.5，1.0，2.0，5.0，10，20，50，100 μg/L 的混合標準工作液，每個質量濃度測定3 次，以參考文獻[17]的方法進行分析，得到線性回歸方程、檢出限和定量限。如表2所示，Trp-P-2 和Phe-p-1 在0.5～100 μg/L 質量濃度范圍內，AαC 在0.1～50 μg/L質量濃度范圍內，其余5 種雜環(huán)胺在0.1～100 μg/L 質量濃度范圍內，具有較好的線性關系，其相關系數(shù)分布在0.996～0.9997 之間。方法檢出限確定在0.02～0.15 μg/kg 之間，而方法定量限在0.05～0.5 μg/kg 之間，因此說明本方法具有良好的線性關系和較高的靈敏度。

表2 7 種雜環(huán)胺的相關檢測數(shù)據(jù)Table 2 Related detection data of 7 HAAs

均勻混合3 種部位的燒鵝肉樣品，進行加標回收試驗，LOQ 添加水平倍數(shù)為1，2 和10，對3個添加水平進行6 次平行試驗（n=6），選取中間添加水平連續(xù)試驗5 d（n=5），外標法定量，其回收率和精密度的結果如表3所示，可以得出7 種極性雜環(huán)胺的回收率在71.3%～111.5%之間，日內精密度RSD（n=6）在2.2%～6.8%之間，日間精密度RSD（n=5）在2.9%～5.8%之間，表明本方法的回收率和精密度良好。

表3 雜環(huán)胺的回收率、日內和日間精密度Table 3 Recoveries，intra-day precision and inter-day precision of HAAs

2.5 實際樣品檢測

分別取A、B、C、D 4 家飯店燒鵝的鵝胸、鵝翅、鵝腩、鵝腿的皮和肉，采用本文建立的HPLCQ-Orbitrap HRMS 方法對廣式燒鵝中的7 種雜環(huán)胺進行檢測，結果見圖5。從圖5可以看出，廣式燒鵝各個部位樣品中均能檢測出HAAs。由圖5可知，HAAs 污染水平順序為鵝腩＞鵝腿＞鵝胸＞鵝翅，原因可能與各個部位的油脂含量不同有關。由圖5還可知，HAAs 污染水平呈現(xiàn)皮＞肉的現(xiàn)象，原因可能是，鵝皮比鵝肉脂肪含量更多，而且在加工過程中，皮直接接觸外界高溫更容易產(chǎn)生雜環(huán)胺，因此皮中HAAs 的含量遠遠大于肉。

圖5 廣式燒鵝中不同部位的7 種雜環(huán)胺總含量Fig.5 Total contents of 7 HAAs in different parts of Cantonese roast goose

3 結論

本文采用高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道肼高分辨質譜技術，建立了廣式燒鵝中7 種非極性HAAs 的檢測方法。確立了樣品前處理的最優(yōu)方案：樣品中添加1.5 g 的NaCl，用1 mol/L 的NaOH 溶液和乙腈進行提取和均質后，再使用StartaTM-X-C 固相萃取柱進行凈化，最后使用體積比90∶10 的甲醇-氨水作為洗脫液洗脫，最后采用C18 色譜柱對雜環(huán)胺進行分離，以乙腈-1 mol/L 乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）為流動相，在電噴霧正離子、全掃描和數(shù)據(jù)依賴性掃描模式下檢測，以保留時間、一級離子質量準確度、二級碎片與庫匹配準確定性，以一級離子峰面積結合內標法定量。7種HAAs 在0.1～100 μg/L 的線性范圍內線性關系良好，該方法靈敏度高，回收率和精密度良好，適用于在中國傳統(tǒng)美食廣式燒鵝中7 種HAAs 的篩選和定量檢測。實際樣品檢測結果表明，鵝皮的HAAs 含量遠遠大于鵝肉，可能由于皮中所含蛋白質、油脂等較多所致，符合形成雜環(huán)胺前體物質的內容物含量。同時，該方法可以進一步應用于其它加工肉類產(chǎn)品中HAAs 的檢測，可為肉類產(chǎn)品中HAAs 的形成和抑制研究提供方法學基礎。