李 根，何 斌，張 成，王 強，朱文杰，楊永波，陳媛媛，肖欣娟

(成都市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川 成都 610041)

微芽嫁接又稱莖尖嫁接，是組織培養(yǎng)與嫁接相結(jié)合的一種培育無毒嫁接苗的技術(shù)[1]。即在無菌條件下切取樣品的微小莖尖嫁接到組培繁育出的砧木苗上，給予適宜的培養(yǎng)條件，最終愈合發(fā)育成完整植株，以達到脫毒的效果。由于病毒在植物體中是通過維管束和胞間連絲傳播，而植物莖尖分生區(qū)細胞活躍，細胞分裂速度極快，且沒有維管束，病毒傳播受限且速度跟不上細胞分裂速度，因此，莖尖中病毒含量極低，可通過微芽嫁接技術(shù)獲得脫毒植株。

Murashige等在1972年建立微體嫁接技術(shù)，并在1975年得到Navarro等的改進[2]，近年來，由于微芽嫁接技術(shù)較高的脫毒率，且嫁接植株環(huán)境條件可控，該技術(shù)已在柑橘、獼猴桃、桃等果樹研究中廣泛應(yīng)用，例如Navarro等在1981年采用此法成功培育出無病毒的柑橘母本樹，并建立柑橘母本園，廣泛應(yīng)用在西班牙柑橘產(chǎn)業(yè)中，極大的提高了當?shù)馗涕俚漠a(chǎn)量和質(zhì)量。由于大多果樹均為多年生，且通過嫁接進行繁育，田間材料獲取周期長，且環(huán)境不可控，接穗材料大多在實驗室組培條件下又難以直接生根繁育，因此，微芽嫁接技術(shù)還能解決果樹研究中嫁接材料獲取難的問題，在較短的周期內(nèi)，獲得條件可控的組培嫁接材料，應(yīng)用于某些研究中。

1 微芽嫁接技術(shù)在果樹研究中的應(yīng)用

1.1 嫁接親和性的鑒定

近年來，由于果樹接穗及砧木新品種選育進程加快，嫁接親和性研究對于新品種在生產(chǎn)中應(yīng)用極為重要，通過田間常規(guī)嫁接進行親和性研究，周期長，環(huán)境因素影響較大，且部分嫁接組合的不親和需要幾個月乃至幾年時間才能完全表現(xiàn)出來。因此，微芽嫁接技術(shù)可作為嫁接親和性研究的儲備技術(shù)，解決環(huán)境因素不可控、研究周期長等問題。

1.2 植物病毒快速檢測

目前，在果樹上常用的病毒檢測方法一般為木本指示檢測法，由于果樹多年生的特性，部分果樹童期較長，因此，該方法檢測周期較長，一般達到2年以上，才能成功鑒定出無病毒苗木，限制了無毒苗木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和擴大。近年來，由于微芽嫁接技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，結(jié)合該技術(shù)的植物病毒快速檢測法在無毒苗木的鑒定與繁育中廣泛應(yīng)用，既縮短了檢測周期，又加快了果樹無毒苗木的繁育。例如在葡萄上已有研究并成功應(yīng)用，研究者以微芽嫁接技術(shù)結(jié)合組培的方式培育帶葡萄扇葉病毒的嫁接植株，培育2～3個月后葡萄嫁接苗即出現(xiàn)病癥，且病毒檢出率近80%，通過進一步的條件優(yōu)化和改良，檢出率會進一步提高。

1.3 無毒苗木的快速繁育

目前，各類果樹中優(yōu)質(zhì)主栽品種中，存在較多難以生根的品種，只能通過嫁接繁育。在生產(chǎn)中繁育苗木一般通過播種砧木種子，獲得實生砧木苗，嫁接優(yōu)質(zhì)品種的接穗，達到繁育的目的。該方法對接穗和砧木苗的質(zhì)量要求較高，同時嫁接時間具有一定的局限性。微芽嫁接技術(shù)中，優(yōu)質(zhì)無毒莖尖及暗培養(yǎng)的砧木黃化苗較易獲得，以微芽嫁接的方式可以獲得大量的無毒嫁接苗木，不僅更好的解決了優(yōu)質(zhì)品種難以生根的問題，且隨時可以獲得適宜的嫁接環(huán)境進行嫁接，可加快無毒苗木的繁育速度。

1.4 砧穗互作研究

近年來，砧穗互作研究成為了果樹領(lǐng)域的熱門，通過砧穗互作的研究，可以直觀的揭示果樹在嫁接親和性、生理生長、信號傳導及調(diào)控、長距離運輸?shù)确矫嫦嚓P(guān)的相關(guān)機理。通過微芽嫁接技術(shù)能夠較快的獲得嫁接植株材料，且不受外界環(huán)境的影響，植株材料也可根據(jù)不同的研究方向進行相應(yīng)的處理。除傳統(tǒng)的田間試驗外，實驗室內(nèi)可控的外部環(huán)境以及較短的培養(yǎng)周期，讓微芽嫁接技術(shù)成為了砧穗互作研究的“敲門磚”。

2 影響嫁接成活率的因素

2.1 砧木和接穗

不同的砧木和接穗及其親和性對于微芽嫁接成活率有較大影響，親緣關(guān)系較近、親和性較好的嫁接組合嫁接成活率一般較高。Lahoty等[3]使用卡里佐枳橙等3種砧木嫁接“那格浦爾”柑橘進行微芽嫁接技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)各嫁接組合成活率差異較大，以卡里佐枳橙為砧木嫁接成活率最高。此外，砧木的生長狀態(tài)也會影響嫁接成活率。目前多數(shù)研究認為砧木苗齡為10～18d時，微芽嫁接的成活率最高。但也有研究[4]認為砧木苗齡只代表砧木的生長時間，并不能體現(xiàn)出砧木的生長狀態(tài)，且會受到種子質(zhì)量、消毒方式和溫度等的影響。所以也有研究認為砧木苗齡與微芽嫁接成活率的關(guān)系不大。

2.2 莖尖大小

微芽嫁接的成活率與莖尖的大小成正相關(guān)，而病毒的脫除率與莖尖的大小成負相關(guān)。Singh等[5]研究發(fā)現(xiàn)莖尖大小由0.2mm增加到0.5mm，嫁接成活率由30.55%增加到41.66%。莖尖大小0.2mm時脫毒率為100%，而0.3mm時脫毒率僅為20%，大于0.3mm則不能脫除印度柑橘環(huán)斑病毒(ICRSV)。莖尖大小除了以長度衡量外，葉原基數(shù)量也是重要的衡量指標。有研究發(fā)現(xiàn)莖尖小于2個葉原基，微芽嫁接成活率極低。當莖尖大于4個葉原基，則難以脫除病毒，因此微芽嫁接時莖尖切取的大小應(yīng)為2～3個葉原基[6]。

2.3 嫁接方法

微芽嫁接的常見方法有7種，包括倒T形法、頂接法、嵌芽腹接法、點接法、△形法、⊥壓法和橫壓法。研究表明不同的嫁接方法對于微芽嫁接成活率具有較大的影響，有些方法成活率高但操作較為復雜，而有些方法成活率稍低但操作簡單、快捷，因此需針對不同的實驗情況選擇適宜的方法[7]。

2.4 培養(yǎng)條件

研究表明微芽嫁接所用的砧木材料為暗培養(yǎng)的黃化苗時，能提高微芽嫁接的成活率，且嫁接后的試管苗需在特定環(huán)境中進行培養(yǎng)[8]。砧木試管苗先暗培養(yǎng)14d，此時的砧木黃化苗能與接穗更好地結(jié)合，從而提高嫁接成活率。此外，植物激素的使用同樣影響嫁接成活率。劉柏玲等[9]在微芽嫁接實驗中使用不同濃度的6-BA和GA3對德爾塔夏橙、紐荷爾臍橙等8個品種柑橘進行了處理，結(jié)果顯示不同激素對不同品種的嫁接成活率差異明顯，且使用植物激素進行預處理的嫁接成活率均高于使用蒸餾水進行預處理的對照。

3 總結(jié)與展望

微芽嫁接技術(shù)自1972年建立以來，經(jīng)過研究者們多年的探索與改進，目前該項技術(shù)已經(jīng)較為成熟和完善，應(yīng)用程度較高，特別是在果樹上。微芽嫁接技術(shù)主要應(yīng)用于嫁接親和性的鑒定、植物病毒快速檢測、無毒苗木的快速繁育，此外，還可應(yīng)用于細胞學、分子生物學的某些研究體系中。通過一些生物技術(shù)結(jié)合微芽嫁接技術(shù)，可以解決果樹育種及生產(chǎn)問題，同時還可能實現(xiàn)果樹優(yōu)良種質(zhì)的創(chuàng)造，如通過對柑橘微芽嫁接材料進行輻射誘變育種，可以極大的提高基因突變頻率，通過篩選出其中的小量突變，在改良品種的同時又可保證原有品種的優(yōu)良性狀。影響嫁接成活率的因素除文中所述的四點外，還包括砧木和接穗的親和性、莖尖采集的季節(jié)及氣候條件等[10]。如在夏季7-8月，由于氣候高溫干燥，抑制了細菌的繁殖，因此，進行微芽嫁接時污染率較低。柑橘在春季由于花芽迅速萌發(fā)，與新梢形成了營養(yǎng)競爭關(guān)系，莖尖生理活性下降；秋季溫差變化加大，接穗生理活性降低，因此嫁接成活率也會降低。綜上，在夏季取柑橘莖尖，嫁接成活率最高，污染率也較低。

目前，微芽嫁接技術(shù)已較為成熟，但因其材料、嫁接操作和培養(yǎng)條件要求較為嚴格，因此該技術(shù)培養(yǎng)嫁接離體材料的效率相比于傳統(tǒng)的離體培養(yǎng)技術(shù)仍偏低，除已知的影響因素外，研究者們可進一步針對其他影響因素進行控制性實驗，以期進一步優(yōu)化該技術(shù)。此外，除了應(yīng)用在傳統(tǒng)的大宗果樹外，還可適當應(yīng)用于部分小宗果樹，拓展研究領(lǐng)域，針對其生理生化特性進行探索和嘗試。