王金 蔣慧 鄭建明

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，上海 200433

【提要】 循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)作為一種基于血液的生物標(biāo)志物，在胰腺癌早期診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測和預(yù)后判斷等方面具有一定優(yōu)勢，但也存在樣本前處理、提取方法等缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)及缺少特異性標(biāo)志物等難題。未來還需要要進(jìn)行更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)和技術(shù)改進(jìn)來推進(jìn)ctDNA在胰腺癌診療中的應(yīng)用。

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤，在男性和女性中的死亡率分別為4.9%和4.2%[1]，并呈逐年增加趨勢，這與胰腺癌早期診斷難、易轉(zhuǎn)移、對當(dāng)前治療方案的敏感性較差及自身的組織學(xué)特征有關(guān)。近年來隨著精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的快速發(fā)展，基因組圖譜結(jié)果指導(dǎo)了越來越多癌癥類型的個(gè)體化治療。盡管高度異質(zhì)的胰腺癌表現(xiàn)出獨(dú)特的體細(xì)胞改變和特征性的驅(qū)動(dòng)基因及突變，但由于胰腺解剖位置較深，組織活檢及取材困難，且患者依從性低而無法進(jìn)行檢測[2]。與胰腺癌組織活檢相比，循環(huán)腫瘤 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)作為一種非侵入性生物標(biāo)志物用以揭示腫瘤特異性、個(gè)體突變及甲基化譜等遺傳和表觀遺傳學(xué)改變，在胰腺癌的早期診斷、治療評估、動(dòng)態(tài)監(jiān)測及預(yù)后評價(jià)方面顯示出一定優(yōu)勢，因而近年來備受關(guān)注。本文就ctDNA在胰腺癌診療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、ctDNA 的特征

體液中的循環(huán)游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)指在血液無細(xì)胞成分中發(fā)現(xiàn)的降解DNA片段。cfDNA在細(xì)胞正常狀態(tài)少量分泌，在細(xì)胞損傷或壞死時(shí)分泌增加[3]。ctDNA在血液中的含量極低，僅占血液cfDNA的0.01%，長度范圍為90～250 bp，比常規(guī)cfDNA片段短[4]。與腫瘤組織相比，血漿樣本中腫瘤DNA的豐度相對較低，這對基于血漿的檢測靈敏度提出了一定挑戰(zhàn)[5]。ctDNA既可以由壞死或凋亡的原發(fā)性、轉(zhuǎn)移及循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)釋放，也可以通過正常腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌外泌體和前體胞外小泡等途徑釋放[6]。由于腫瘤相關(guān)基因突變的存在，ctDNA可以有效地與正常cfDNA區(qū)分開來。與單個(gè)腫瘤組織樣本相比，ctDNA水平受腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的影響較小，能夠提供患者腫瘤細(xì)胞更全面的基因組信息，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)、微衛(wèi)星位點(diǎn)、雜合缺失、突變、多態(tài)性、甲基化和拷貝數(shù)變異[7]。此外有研究發(fā)現(xiàn)ctDNA可以作為驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移的信號分子參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[8]。一項(xiàng)研究將鼠NIH3-T3細(xì)胞與含有KRAS基因突變ctDNA片段的大腸腫瘤患者的血漿一起溫育，隨后注射到小鼠體內(nèi)，可以觀察到小鼠大腸腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并在小鼠血漿中檢測到KRAS基因突變ctDNA片段[8]。這表明通過監(jiān)測ctDNA不僅可以監(jiān)控腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并有作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)的可能性?；谶@些特征，ctDNA成為目前液體活檢中常用的血源性標(biāo)志物之一。

與胰腺癌組織活檢相比，ctDNA測序具有明顯的優(yōu)勢。(1)采集外周血液獲得ctDNA是微創(chuàng)操作，可以降低患者痛苦和并發(fā)癥發(fā)生率，而且不受部位的影響；(2)可以在治療過程中的任何時(shí)候采集血液，實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)地監(jiān)測腫瘤的分子變化，不依賴于侵入性組織活檢和影像學(xué)檢查；(3)通過對ctDNA的監(jiān)測可以發(fā)現(xiàn)影像上不明顯或不確定的胰腺癌組織，例如切除后殘留的胰腺癌組織；(4)ctDNA可能代表了胰腺癌腫瘤的整個(gè)分子圖像，可以揭示腫瘤特異性、個(gè)體突變及甲基化譜等遺傳和表觀遺傳學(xué)改變。

與胰腺癌常見血液腫瘤標(biāo)志物及液體活檢指標(biāo)相比，ctDNA測序具有很好的靈敏度和特異度。CA19-9作為最常見的胰腺癌腫瘤標(biāo)志物，靈敏度僅為70%～89%，特異度為68%～91%[9]。有研究發(fā)現(xiàn)CA19-9在Lewis血型陰性表型患者容易出現(xiàn)假陰性，而在阻塞性黃疸患者中常表現(xiàn)為假陽性。此外，良性腫瘤、炎癥性腫塊和糖尿病患者CA19-9的水平也會(huì)增加[10]，因此目前對于CA19-9水平變化的解釋及其在胰腺癌患者治療中的作用還未達(dá)成共識(shí)。而利用二代測序技術(shù)檢測ctDNA 基因突變靈敏度可以達(dá)到91%，特異度為100%[11]。CTC作為另外一種正在發(fā)展的液體活檢技術(shù)，在胰腺癌的診斷和檢測效果并不理想，究其原因，一方面胰腺癌具有致密的間質(zhì)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞占比僅為30%，常常在疾病晚期才會(huì)有更多的CTC；另一方面CTC在釋放后失去了原始免疫抑制微環(huán)境的保護(hù)，更容易受到免疫細(xì)胞的攻擊[12]，故靈敏度低于ctDNA。

二、ctDNA的檢測方法

由于ctDNA在血液中的含量低，且片段小，高度可變，因此對其檢測要求較高，特別是在ctDNA含量更少的腫瘤發(fā)展早期階段[13]。通過液體活組織檢測腫瘤發(fā)生通常有兩類方法，一類方法是檢測原發(fā)腫瘤中已知的單個(gè)或少數(shù)腫瘤特異性突變來監(jiān)測外周血液中的殘留疾病，這類技術(shù)以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)為基礎(chǔ)，包括定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)、癌癥個(gè)體化深度測序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)和等位基因特異性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)等[14]。這類方法的缺點(diǎn)是需要關(guān)于腫瘤基因組的詳細(xì)信息，但優(yōu)點(diǎn)在于有針對性的監(jiān)測可能是極其敏感的，可以在等位基因頻率低至0.01%時(shí)仍具有高特異性，以較低成本快速檢測到突變。第二類方法為非靶向篩選，即以第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)為基礎(chǔ)，通過全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)或全外顯子測序(wholeexome sequencing,WES)對全基因組范圍內(nèi)的拷貝數(shù)畸變或點(diǎn)突變進(jìn)行分析[15]，并逐漸衍生出深度測序、快速測序系統(tǒng)(fast sequencing,FAST-SeqS)、標(biāo)記擴(kuò)增深度測序(tagged-amplicon deepsequencing, TAM-SeqS)、安全測序系統(tǒng)(safe sequencing,SAFE-SeqS)等技術(shù)[16]。這類方法的缺點(diǎn)是需要高濃度的ctDNA才能可靠地重建腫瘤特異的全基因組改變,但優(yōu)點(diǎn)在于它能夠識(shí)別腫瘤治療過程中發(fā)生的新變化。

總體而言，相對于NGS，基于PCR的分析具有低成本和有效性的優(yōu)勢，是一種很有前景的檢測胰腺癌基因突變的方法，在常規(guī)臨床實(shí)踐中具有可行性。NGS作為一項(xiàng)相對昂貴和耗時(shí)的技術(shù)，需要熟練的生物信息學(xué)專家進(jìn)行分析和解釋單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)畸變、插入和缺失、表觀遺傳學(xué)變化或組裝新的基因組[17]，因此更適合于檢測廣泛的癌癥相關(guān)基因突變。

三、ctDNA在胰腺癌診治中的作用

近年來雖出現(xiàn)了較多新的胰腺癌治療方案，但胰腺癌患者的預(yù)后情況依然嚴(yán)峻。新輔助化療、代謝療法、低氧及免疫療法等新興療法的應(yīng)用亟需要更精準(zhǔn)的早期篩查、動(dòng)態(tài)檢測及預(yù)后評價(jià)指標(biāo)作為治療反應(yīng)監(jiān)測工具，以便臨床醫(yī)師制定更有效的個(gè)體化治療方案。ctDNA目前在以下領(lǐng)域顯示出一定的潛力。

1.ctDNA在胰腺癌篩查中的作用：早期胰腺癌通常在臨床上沒有癥狀，只有在腫瘤侵犯周圍組織或轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官后才會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀，臨床診斷過程中超過60%的胰腺癌患者已為晚期[18]。胰腺癌基因組測序表明，基因突變到腫瘤轉(zhuǎn)移至少需要15年時(shí)間[19]。全基因組和外顯子組測序分析表明，胰腺癌腫瘤細(xì)胞中常見的4個(gè)起始突變基因分別為KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4[20-22]。如何用更好的篩查手段來發(fā)現(xiàn)這些起始基因突變，是胰腺癌臨床診療面臨的一個(gè)難題。

Zill等[23]對26例胰腺癌患者的腫瘤組織和ctDNA中的5個(gè)基因(KRAS、TP53、APC、FBXW7和SMAD4)進(jìn)行前瞻性分析，在17例測序成功的患者中，90.3%(95%CI73.1%～97.5%)的腫瘤組織檢測到的突變也在ctDNA中檢測到，ctDNA測序診斷準(zhǔn)確率為97.7%，5個(gè)基因的平均靈敏度為92.3%，特異度為100%，ctDNA的變化與腫瘤標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化具有良好的相關(guān)性(r=0.93)。這項(xiàng)研究證明在事先不知道腫瘤基因型或ctDNA豐度的情況下，ctDNA測序在識(shí)別腫瘤衍生基因突變方面是可行、準(zhǔn)確和靈敏的。liu等[24]利用開發(fā)的單鏈文庫制備和基于雜交捕獲測序技術(shù)(single-strand library preparation and hybrid-capture-based cfDNA sequencing，SLHC-seq)檢測KRAS基因突變有效地區(qū)分了胰腺癌患者與健康對照者(AUC=0.863，95%CI0.830～0.898)，且KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4基因的組合檢測對胰腺癌具有更高的診斷準(zhǔn)確率(AUC=0.921，95%CI0.890～0.956)，靈敏度為80%，特異度為100%。此外這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)顯性峰值為75～85 bp突變片段在Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者中普遍存在，這有助于提出一種基于基因突變片段大小的早期胰腺癌檢測方法。DNA甲基化發(fā)生在腫瘤發(fā)生的最早階段，檢測ctDNA的DNA甲基化有利于腫瘤早期篩查。Eissa等[25]將一種新開發(fā)的珠子甲基化技術(shù)用于胰腺癌診斷，發(fā)現(xiàn)分別用含Ⅰ型血小板反應(yīng)蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶、鋅指蛋白巴松素1以及兩者聯(lián)合檢測ctDNA甲基化的靈敏度分別為87.2%、64.1%和97.4%，對于Ⅰ～Ⅱ期適合手術(shù)切除并具有治愈潛力的胰腺癌患者，雙基因聯(lián)合的靈敏度為94.8%，特異度為91.6%。目前ctDNA在早期胰腺癌患者的檢出率仍然明顯低于晚期患者，因此提高檢出技術(shù)或采用聯(lián)合蛋白標(biāo)志物或多個(gè)突變位點(diǎn)等策略可能有助于胰腺癌的早期篩查。

2.ctDNA在胰腺癌治療療效監(jiān)測中的作用：目前臨床上胰腺癌治療療效的評價(jià)多通過CT、MRI、超聲內(nèi)鏡及磁共振胰膽管成像等影像技術(shù)對術(shù)后殘留腫瘤或放化療、免疫治療后腫瘤大小的測量來進(jìn)行簡單的分級。這些方法一方面不能進(jìn)行動(dòng)態(tài)性的檢測，檢測次數(shù)在短期內(nèi)受到限制，另一方面靈敏度低于80%，微小病灶及轉(zhuǎn)移病灶難以及時(shí)檢測到。而胰腺癌的異質(zhì)性及轉(zhuǎn)化影響并決定著治療手段的選擇和最終的治療效果。因此需要特異度和靈敏度更強(qiáng)且易于檢測的腫瘤生物學(xué)指標(biāo)來監(jiān)測治療效果。

一項(xiàng)通過KRAS突變反映晚期胰腺癌患者ctDNA檢測的臨床相關(guān)性研究[26]，從14例預(yù)期招募的患者在接受吉西他濱或FOLFIRINOX化療之前和隨后的每個(gè)月治療期間分別采集血樣，然后用肽-核酸鉗PCR檢測KRAS突變(在>90%的胰腺癌中存在)，作為ctDNA的替代標(biāo)志物，并以29名健康者的血漿樣本作為對照組，中位隨訪時(shí)間為3.7個(gè)月。結(jié)果顯示10例患者化療前采集的血漿樣本中有KRAS陽性，表明了ctDNA的存在，其中9例在隨訪期間經(jīng)歷了疾病進(jìn)展，同時(shí)多例患者在化療過程中ctDNA水平發(fā)生變化，與其放射學(xué)隨訪數(shù)據(jù)和CA19-9水平相一致；而4例ctDNA陰性患者中只有1例經(jīng)歷了疾病進(jìn)展(P=0.01)。治療前ctDNA水平是無進(jìn)展和總存活率的顯著預(yù)測因子(P值分別為0.014和0.010)。這項(xiàng)初步研究支持這樣一種假設(shè)，即ctDNA可以作為監(jiān)測胰腺癌患者治療效果和疾病進(jìn)展的標(biāo)志物。目前這項(xiàng)研究正在招募更多患者以證實(shí)上述發(fā)現(xiàn)。

3.ctDNA在評估胰腺癌患者預(yù)后中的作用：胰腺癌惡性程度高，5年生存率低于10%[27-28]，手術(shù)及放化療等傳統(tǒng)療法對提高患者生存率的作用有限，目前缺乏準(zhǔn)確的臨床指標(biāo)來判斷胰腺癌患者的預(yù)后。

一項(xiàng)研究采用液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)檢測罕見突變的腫瘤源性KRAS基因。105例在同一機(jī)構(gòu)接受胰十二指腸切除術(shù)的PDAC患者中，33例(31%)血漿ctDNA陽性，患者中位生存期為13.6個(gè)月，而ctDNA陰性患者的中位生存期為27.6個(gè)月，顯示ctDNA陽性患者較ctDNA陰性患者預(yù)后差(P<0.0001)[29]。這一結(jié)果表明，血漿樣本中ctDNA的存在可能是PDAC患者生存不良的一個(gè)預(yù)測因子。另一項(xiàng)研究收集17例轉(zhuǎn)移性PDAC患者，從血漿中提取ctDNA，使用NGS進(jìn)行KRAS基因突變分析，并與血清CA19-9水平、影像學(xué)和生存期進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示17例患者中有5例(29.4%)檢測到KRAS基因突變，且與患者較短的生存期相關(guān)，在ctDNA陽性患者中，ctDNA作為監(jiān)測治療反應(yīng)的標(biāo)志物與CA19-9相當(dāng)，ctDNA的變化與患者生存期呈負(fù)相關(guān)[30]。這一結(jié)果表明ctDNA中突變的KRAS基因可以作為胰腺癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志物，用于評估患者生存期。

四、目前存在的難題

2016年美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug admini-stration, FDA)批準(zhǔn)了第1個(gè)通過分析ctDNA來檢測非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變的試驗(yàn)[31]。胰腺癌的相關(guān)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)至今還未提出。許多臨床醫(yī)師使用更全面但未經(jīng)FDA批準(zhǔn)的ctDNA液體活檢技術(shù)診療胰腺癌及其他實(shí)體瘤，這些技術(shù)方案多由公司提供并用于指導(dǎo)應(yīng)用。如何對胰腺癌患者進(jìn)行ctDNA采集缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此需要進(jìn)行更多的研究來證明臨床有效性和實(shí)用性。此外，在處理血液樣本的技術(shù)層面上也具有很大困難，ctDNA半衰期短，保存困難，容易降解且豐度較低，樣本處理方式的不同，有可能將顯著的可變性引入ctDNA分析中。有研究表明采集血管的類型、處理樣本所需的時(shí)間、白細(xì)胞溶解等因素會(huì)導(dǎo)致ctDNA被正常細(xì)胞DNA稀釋進(jìn)而會(huì)影響ctDNA的檢測[32-33]。不同平臺(tái)檢測技術(shù)的靈敏度及特異度也存在較大差異。因此關(guān)于血液的ctDNA應(yīng)該如何提取、處理、儲(chǔ)存及分析，都需要大量的臨床試驗(yàn)和數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證以證實(shí)其臨床實(shí)用性。未來有必要進(jìn)行更大規(guī)模的前瞻性獨(dú)立隊(duì)列研究并推動(dòng)技術(shù)改進(jìn)，以驗(yàn)證基于ctDNA的液體活檢標(biāo)志物對胰腺癌患者的非侵入性診療作用。

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