外泌體在原發(fā)性膽汁性膽管炎中作用的研究進(jìn)展

馬海濤， 唐映梅

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 昆明 650101

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以女性發(fā)病為主的慢性進(jìn)行性自身免疫性肝病，其特點(diǎn)是慢性進(jìn)行性小膽管破壞和肉芽腫性淋巴細(xì)胞性膽管炎，具有典型的抗線(xiàn)粒體抗體(AMA)血清反應(yīng)陽(yáng)性[1]。PBC發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，更有效的治療方法還有待研究[2]。如未經(jīng)規(guī)范治療，PBC可進(jìn)展為終末期肝病如肝硬化和肝衰竭，需要進(jìn)行肝移植[3-4]。目前的研究表明，外泌體參與了PBC的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)多種干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)PBC疾病可能起到保護(hù)和治療的作用。本文回顧了近年來(lái)外泌體及其攜帶的多種分子在PBC中的作用并作一總結(jié)，以此為PBC的發(fā)病機(jī)制研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 外泌體概述

外泌體(exosomes)是一類(lèi)直徑在30～200 nm大小不均的細(xì)胞外囊泡，幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞都可以生成和分泌外泌體，其廣泛存在于人體血液、母乳、膽汁和尿液等多種體液中[5-6]。外泌體是由細(xì)胞中的多囊泡內(nèi)體發(fā)育成熟時(shí)內(nèi)膜向內(nèi)萌發(fā)而形成，當(dāng)多囊泡內(nèi)體與細(xì)胞膜融合時(shí)分泌到細(xì)胞外的一種腔內(nèi)囊泡[7]。外泌體內(nèi)含有多種生物活性分子如蛋白質(zhì)(過(guò)氧化物酶、丙酮酸激酶、跨膜蛋白、脂質(zhì)錨定內(nèi)膜蛋白、內(nèi)周膜蛋白等)、DNA(單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、線(xiàn)粒體DNA和反轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA等)以及RNA[mRNA、microRNA、環(huán)狀RNA(circRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA)等]和脂質(zhì)，它們參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)各種生理活動(dòng)[5]。

目前已知外泌體最主要的功能是在鄰近和遠(yuǎn)處的細(xì)胞間穿梭以傳遞不同的信號(hào)分子，參與細(xì)胞間信號(hào)通訊。外泌體通過(guò)巨胞飲、吞噬作用、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等多種方式被受體細(xì)胞攝取后，其內(nèi)攜帶的多種生物分子可調(diào)控受體細(xì)胞內(nèi)下游的多個(gè)信號(hào)通路而在調(diào)節(jié)細(xì)胞活化和增殖、代謝、免疫反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[5,7-8]。此外，外泌體還可以轉(zhuǎn)移Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體和抗原，具有抗原呈遞功能[9]。

作為一種細(xì)胞間的通訊媒介，外泌體不僅在機(jī)體正常的生理穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，而且在感染性疾病、代謝性疾病和癌癥等多種疾病的發(fā)病和進(jìn)展中也飾演著重要的角色[8,10]。隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)探索的不斷深入，外泌體在自身免疫性疾病中的相關(guān)研究逐漸成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，其在PBC疾病中的研究也有了一些重要的進(jìn)展。

2 外泌體在PBC疾病中的作用

大量研究[11-12]表明，外泌體具有誘導(dǎo)抗原特異性免疫和引發(fā)炎癥反應(yīng)的功能。來(lái)自不同細(xì)胞群體的外泌體可以在不同個(gè)體的免疫微環(huán)境中介導(dǎo)免疫激活或免疫抑制從而在自身免疫性疾病的免疫反應(yīng)中發(fā)揮不同的作用。PBC是一種典型的以肝臟發(fā)生病理生理改變?yōu)橹鞯钠鞴偬禺愋宰陨砻庖咝约膊?對(duì)PBC相關(guān)外泌體的深入研究可能有助于PBC發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步闡明。

2.1 循環(huán)外泌體可調(diào)節(jié)APC共刺激分子的表達(dá) 已有多項(xiàng)研究[13]證實(shí)，抗原遞呈細(xì)胞(APC)可誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞分泌多種炎癥因子維持PBC肝臟炎癥，并可介導(dǎo)PBC膽管損傷。Tomiyama等[14]在對(duì)PBC患者和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分析中發(fā)現(xiàn)，血液循環(huán)中存在的外泌體可顯著增加CD14+單核細(xì)胞表面CD86分子的表達(dá)，同時(shí)，CD40分子在CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞上的表達(dá)增加，而在B淋巴細(xì)胞上的表達(dá)降低(圖1a)，但PBC患者體內(nèi)的循環(huán)外泌體并不能誘導(dǎo)外周血中的單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子。CD40和CD86是循環(huán)外泌體誘導(dǎo)的PBC免疫應(yīng)答過(guò)程中APC活化的兩個(gè)關(guān)鍵共刺激分子，循環(huán)外泌體通過(guò)調(diào)節(jié)這兩個(gè)分子在APC亞群中的表達(dá)而影響APC活化。這些結(jié)果表明，循環(huán)中的外泌體對(duì)單核細(xì)胞功能的調(diào)控作用是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞共刺激分子表達(dá)的改變而不是誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎性因子產(chǎn)生的。此外，研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有PBC疾病的主要自身抗原PDC-E2，可能隨外泌體進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞加工進(jìn)一步參與PBC中APC的活化。

研究者還在PBC患者和健康對(duì)照者的循環(huán)外泌體中篩選出了18個(gè)差異表達(dá)較為顯著的miRNA，其中miRNA-451a和miRNA-642a-3p的水平明顯升高，表明外泌體中的miRNA可能參與PBC疾病進(jìn)程中調(diào)節(jié)APC上共刺激分子的表達(dá)[14]。近年來(lái)研究[15-16]提示miRNA-451a與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但目前尚未見(jiàn)miRNA-642a-3p在自身免疫性疾病中的相關(guān)報(bào)道。然而，這兩個(gè)miRNA水平上調(diào)的程度與PBC病情的進(jìn)展無(wú)關(guān)，可能與該項(xiàng)研究的患者正在接受熊去氧膽酸的治療有關(guān)，需要更多的研究來(lái)確定外泌體miRNA水平是否與PBC疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。

2.2 膽管細(xì)胞來(lái)源的外泌體可介導(dǎo)生物分子向肝內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移

越來(lái)越多的研究[6,17]表明，外泌體介導(dǎo)的各種生物大分子的轉(zhuǎn)移與多種肝臟疾病有著密切的關(guān)系。此前一項(xiàng)研究[18]表明衰老的膽管細(xì)胞可釋放大量的外泌體，這些含有多種生長(zhǎng)因子的外泌體進(jìn)入正常膽管細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞后可改變這些靶細(xì)胞表型而影響膽汁淤積性肝損傷。

lncRNA H19(簡(jiǎn)稱(chēng)H19)是目前研究最廣泛的lncRNA，位于人類(lèi)第11號(hào)染色體上。生理?xiàng)l件下，H19在除骨骼肌外的幾乎所有組織中均下調(diào)，H19的異常表達(dá)常常與包括PBC在內(nèi)的多種肝臟疾病密切相關(guān)[19]。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在膽汁淤積條件下，雌激素和牛磺膽酸通過(guò)其同源受體誘導(dǎo)ERK1/2信號(hào)通路的激活而上調(diào)膽管細(xì)胞中H19的表達(dá)并促進(jìn)攜帶了H19的外泌體的釋放，攜帶H19的外泌體直接或通過(guò)血液循環(huán)被肝臟內(nèi)的細(xì)胞攝取后抑制肝臟細(xì)胞中小分子異二聚體伴侶的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致膽汁酸合成增加，最終加重淤膽性肝損傷。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞(HSC)和HSC來(lái)源的成纖維細(xì)胞是膽管細(xì)胞來(lái)源外泌體最主要的靶細(xì)胞。PBC小鼠模型中的所有肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，HSC攝取的膽管細(xì)胞來(lái)源的外泌體最多，進(jìn)入細(xì)胞的外泌體H19可調(diào)節(jié)HSC的G1/S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，對(duì)HSC的激活和增殖起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用(圖1b)，進(jìn)而參與PBC疾病肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[21]。然而，外泌體H19介導(dǎo)的HSC激活的潛在機(jī)制仍有大部分未知，需要更深入的研究以闡明。

眾所周知，Kupffer細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞激活后會(huì)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，在PBC的膽管損傷和肝臟炎癥中起著重要作用[13,22]。膽管細(xì)胞來(lái)源的外泌體H19可被駐留在肝臟內(nèi)的Kupffer細(xì)胞攝取，誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞激活并向M1方向極化，刺激Kupffer細(xì)胞分泌趨化因子配體2(CCL-2)和IL-6并通過(guò)CCL-2/CCR-2信號(hào)通路促進(jìn)單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞活化、遷移及M1極化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1b)，促進(jìn)PBC疾病肝臟炎癥的發(fā)展[23]。

3 外泌體在PBC臨床診療中的作用

PBC病因未明，缺乏明確的早期非侵入性診斷和預(yù)后判斷的手段，同時(shí)也缺乏足夠的治療靶點(diǎn)和特異性的治療藥物。因此，尋找診斷和治療PBC的新方法仍是未來(lái)臨床和基礎(chǔ)研究的首要任務(wù)。隨著外泌體提取、保存及檢測(cè)技術(shù)的日益更新，外泌體在各種疾病中的應(yīng)用前景也越來(lái)越廣闊[24-25]。外泌體存在于幾乎所有體液中，因其有脂質(zhì)雙分子層可在血清中處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，且外泌體含有來(lái)源于細(xì)胞的組織特異性蛋白和核酸，其數(shù)量和含量可隨著疾病狀態(tài)的不同而變化，有望成為一種新型診療方法[26]。

3.1 外泌體可能是PBC潛在的診斷標(biāo)志物

建立準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、安全性好的早期診斷方法是防治PBC的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前臨床中診斷PBC的特異血清學(xué)指標(biāo)為AMA，然而，多項(xiàng)研究[27]指出AMA陽(yáng)性與PBC疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后無(wú)關(guān)，且5%～10%的PBC患者血清AMA陰性，此類(lèi)患者無(wú)核心診斷指標(biāo)。一些外泌體本身以及外泌體含有的多種ncRNA已被確定為多種肝病潛在的診斷標(biāo)志物，如病毒性肝炎、藥物性肝損傷、酒精性肝病、肝細(xì)胞癌和膽管癌[8]。也有一些研究提示外泌體及其攜帶的多種核酸分子可能在PBC診斷和預(yù)后中有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3.1.1 外泌體microRNA(miRNA) miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸組成的高度保守的非編碼小RNA，參與多種基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，在細(xì)胞的增殖分化、代謝和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的激活或抑制作用[28]。外泌體固有的脂質(zhì)雙分子層具有較好的穩(wěn)定性可使外泌體中攜帶的miRNA分子不易被降解，因此常常被認(rèn)為是理想的疾病活動(dòng)性和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[29]。

大量研究[30]證實(shí)了外泌體和miRNA可以作為潛在的非侵入性生物標(biāo)志物準(zhǔn)確地識(shí)別、預(yù)測(cè)和治療包括PBC在內(nèi)的多種膽道疾病。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè) miRNA 在 PBC患者和正常人的血清以及PBMC中差異表達(dá)，呈現(xiàn)出PBC特異的血清學(xué)miRNA 表達(dá)譜，在眾多差異表達(dá)的外泌體miRNA中，外泌體miRNA-506可能對(duì)PBC患者的診斷和預(yù)后有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[2,9]。近期有研究[31]發(fā)現(xiàn)在AMA陰性PBC患者血清中miR-21和miR-150的表達(dá)顯著增強(qiáng)，并且與患者的血清AMA抗體滴度呈負(fù)相關(guān)，miR-21和miR-150及其下游靶基因的顯著改變可能是AMA陰性PBC患者的特征性表現(xiàn)。這些研究結(jié)果顯示，多種外泌體miRNA可能參與PBC進(jìn)程，檢測(cè)PBC患者血清和尿液中的外泌體miRNA有可能成為PBC疾病的早期非侵入性診斷和預(yù)后判斷的一種方法。然而，外泌體miRNA在PBC疾病診斷中的研究仍處于早期的臨床前階段，與真正應(yīng)用到臨床診斷中還有很大的差距。

3.1.2 外泌體lncRNA lncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸而不具備編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，可在不同水平上調(diào)控基因表達(dá)，在機(jī)體的生理和病理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[32]。然而，lncRNA的穩(wěn)定性較差，很容易被血液中的RNase降解，因此很難直接檢測(cè)到血液中的lncRNA，循環(huán)中的外泌體可以保護(hù)lncRNA不被降解進(jìn)而放大lncRNA作為診斷標(biāo)志物的潛能[33-34]。

不同來(lái)源的外泌體lncRNA與各個(gè)系統(tǒng)的多種良性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為一種無(wú)創(chuàng)的臨床診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的標(biāo)志物[35-37]。一項(xiàng)基因組研究[38]發(fā)現(xiàn)lncRNA共有38個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與PBC密切相關(guān)，其中21個(gè)位點(diǎn)也與其他自身免疫性疾病相關(guān)。另有研究[39]發(fā)現(xiàn)lncRNA AK053349在PBC患者PBMC中表達(dá)增加，并與Mayo風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)，可能在PBC發(fā)病中有潛在作用。最近的研究[21]發(fā)現(xiàn)，PBC患者血清外泌體lncRNA H19水平在晚期肝硬化患者中顯著上調(diào)并與肝臟H19水平和膽汁淤積性肝損傷的肝纖維化程度密切相關(guān)，提示循環(huán)外泌體H19水平可能是PBC臨床診斷的潛在血清標(biāo)志物和預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)，但其敏感性和特異性還需進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。這些研究結(jié)果表明外泌體lncRNA可能是PBC疾病的潛在生物標(biāo)志物，為外泌體lncRNA在臨床診斷中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

3.2 外泌體在PBC治療中的研究 熊去氧膽酸(UDCA)是目前治療PBC疾病的一線(xiàn)用藥，但仍有約40%的患者服用UDCA的療效不佳，迫切需要尋找一些新的治療方法來(lái)控制此類(lèi)患者的病情[2]。由于外泌體在人體內(nèi)的生物相容性較好且體液中的外泌體具有天然的穩(wěn)定性和靶向性，其本身或作為靶向治療藥物的載體在疾病治療中的研究也越來(lái)越廣泛[10,40]。

間充質(zhì)干細(xì)胞具備獨(dú)特的自我更新能力和多向分化潛能受到研究者的廣泛關(guān)注，但因其安全性備受爭(zhēng)議而限制了它在臨床中的應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體富含生物活性分子，更易生產(chǎn)和儲(chǔ)存，沒(méi)有活細(xì)胞而不具有成瘤風(fēng)險(xiǎn),可作為一種理想的無(wú)細(xì)胞療法提供一些新的治療策略[41]。肝纖維化被認(rèn)為是包含PBC在內(nèi)的各種肝病中晚期共同出現(xiàn)的病理變化，有研究[42]發(fā)現(xiàn)，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)控制HSC的活化增殖進(jìn)而減輕肝纖維化小鼠模型的纖維化程度，此外，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體還可抑制肝臟炎癥和促進(jìn)肝細(xì)胞再生。大量研究證實(shí)膽管上皮細(xì)胞衰老是PBC疾病重要的病理改變之一， Chen等[43]采用氧化應(yīng)激(H2O2)誘導(dǎo)膽管細(xì)胞衰老后與人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(Hpmsc)來(lái)源的外泌體共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，Hpmsc來(lái)源的外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)抑制衰老的蛋白p21WAF1/-Cip1和p16INK4a以及減少衰老相關(guān)分泌表型組分和趨化因子的表達(dá)從而延緩膽管細(xì)胞衰老的進(jìn)程并促進(jìn)膽管細(xì)胞增殖衰老而產(chǎn)生保護(hù)作用。這些研究結(jié)果對(duì)尋找PBC疾病治療的新方法具有重要意義，雖然目前外泌體尚未應(yīng)用于臨床診療，但是隨著探索的不斷深入，外泌體可能在不久的將來(lái)成為治療PBC疾病的理想工具。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，各種來(lái)源的外泌體及其攜帶的不同生物分子在PBC疾病的各個(gè)階段中有著不同的作用并有望發(fā)展為PBC早期診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)和精準(zhǔn)治療的無(wú)創(chuàng)性工具。雖然近幾年關(guān)于外泌體與PBC疾病的研究取得了許多進(jìn)展，但外泌體在PBC發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索，外泌體的分泌和定向細(xì)胞攝取的機(jī)制尚不明了。此外，標(biāo)準(zhǔn)化、高通量分離和提取外泌體的方法仍處于探索階段，這些問(wèn)題給外泌體在PBC疾病中的臨床應(yīng)用帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。目前有關(guān)外泌體在PBC疾病中的研究還有許多問(wèn)題有待闡明，但隨著研究的不斷發(fā)展和技術(shù)的日益更新，外泌體將會(huì)為PBC疾病的發(fā)病機(jī)制探索和臨床診療帶來(lái)更多的新思路和新方法。

利益沖突聲明：所有作者均不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：馬海濤負(fù)責(zé)起草文章，對(duì)行文的思路和設(shè)計(jì)有關(guān)鍵貢獻(xiàn)；唐映梅參與了修改文章關(guān)鍵內(nèi)容。