房水外泌體在眼科疾病中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

陶慧 蘇勝 唐先玲

外泌體(exosomes)為細(xì)胞分泌的直徑為30～100 nm 的脂質(zhì)雙分子包裹體結(jié)構(gòu)，是一種重要的細(xì)胞外囊泡。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有細(xì)胞均可分泌外泌體，外泌體能夠穩(wěn)定存在于各種體液中。在眼部，外泌體存在于淚液、房水、玻璃體中，比較容易獲得。外泌體在眼部疾病的診斷、治療及評(píng)價(jià)藥物功效方面，均顯示很強(qiáng)的研究與應(yīng)用潛力[1]。房水是眼部重要的組成部分，在人前房水中已發(fā)現(xiàn)了攜帶生物活性物質(zhì)的外泌體，且房水的許多生物學(xué)功能可能與外泌體相關(guān)[2]。目前對(duì)房水外泌體的研究已逐步展開(kāi)并顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

一、房水外泌體的生物來(lái)源及特性

Dismuke 等[2]首次證明外泌體是房水中主要的細(xì)胞外囊泡群，并且這些外泌體含有特征性 exosomal RNA(esRNA)。外泌體攜帶大量功能性的miRNA，少量的mRNA、lncRNA，以及特異性的蛋白質(zhì)(如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子)等生物活性物質(zhì)，分泌外泌體的細(xì)胞將外泌體釋放于體液內(nèi)并被靶細(xì)胞捕獲，將攜帶的生物活性物質(zhì)(如miRNA)遞送到靶細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞之間信息傳遞和功能調(diào)控[3]。已報(bào)告的外泌體功能包括調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡、促血管生成、參與炎癥反應(yīng)、調(diào)控腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的信息傳遞[3]。

房水通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制由睫狀突毛細(xì)血管網(wǎng)中血漿的過(guò)濾而獲得，所以房水的成分與血漿成分相似。但是，房水中的成分不完全等同于血漿，房水還有許多從眼內(nèi)細(xì)胞分泌的其它生物活性物質(zhì)[4]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，在角膜上皮細(xì)胞[5]、小梁網(wǎng)細(xì)胞[6，7]、非色素睫狀體上皮細(xì)胞[8]、視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞[9]、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]、Müller細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)[11]均能夠分泌外泌體。另外，在眼調(diào)節(jié)過(guò)程中，懸韌帶和晶狀體運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致玻璃體液和房水混合。理論上來(lái)說(shuō)，這些細(xì)胞分泌的外泌體有可能進(jìn)入前房成為房水外泌體的一部分。因此，房水外泌體檢測(cè)能更加特異地反應(yīng)眼部疾病特征，已逐步成為眼科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

二、房水外泌體的分離

房水可以使用30號(hào)針頭通過(guò)前房穿刺術(shù)獲得，預(yù)進(jìn)行外泌體分離的房水應(yīng)立即存放于-80 ℃保存直至分析。通過(guò)這種方法單眼僅能夠獲取100 μl左右房水，因此，如何高效、高純度地分離房水外泌體是實(shí)現(xiàn)其組學(xué)分析和功能研究的前提。目前，房水外泌體主要使用連續(xù)差速離心法及外泌體分離試劑盒進(jìn)行分離。

連續(xù)差速離心法是目前最常使用的方法，被認(rèn)為是分離外泌體的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Dismuke 等[2]使用連續(xù)差速離心法收集白內(nèi)障手術(shù)患者房水中均質(zhì)的顆粒物，通過(guò)納米顆粒追蹤技術(shù)(nanoparticletrackinganalysis,NTA)對(duì)其中的微囊泡進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)為直徑121±11 nm的微囊泡，即房水外泌體。該方法通過(guò)低速離心沉淀細(xì)胞碎片和其他大分子物質(zhì)，再將上清液高速離心沉淀細(xì)胞外囊泡，此時(shí)獲得外泌體可能含有污染的蛋白質(zhì)等物質(zhì)，需要將囊泡沉淀物重新懸浮在 PBS 中，并再次高速離心以得到純度更高的外泌體。連續(xù)差速離心法分離外泌體的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)便、不被分離試劑污染、應(yīng)用范圍廣泛，但該方法分離房水外泌體有其不可避免的劣勢(shì)：(1)使用設(shè)備昂貴，不易廣泛推廣；(2)需要樣本量較大，單眼獲取的房水量不能滿足連續(xù)差速離心提取外泌體的需要，通常將多個(gè)房水樣本混合；(3)反復(fù)離心會(huì)引起外泌體的破壞和損失[12]。數(shù)據(jù)表明，高速或低速離心步驟都不會(huì)顯著影響房水外泌體的平均粒徑，但是每次純化步驟都會(huì)影響外泌體的最終產(chǎn)量。與原始房水樣品中的外泌體總量相比，低速離心后外泌體損失60%，高速離心后，房水外泌體損失率高達(dá) 87%[2]。

近年出現(xiàn)了許多用于分離純化外泌體的商品化試劑盒，如基于沉淀法原理的試劑盒、磁珠試劑盒、ELISA試劑盒、色譜法試劑盒、超濾法試劑盒等[13]。目前最常用的是由System Biosciences(SBI)根據(jù)聚合物共沉淀原理研發(fā)的ExoQuick-TC外泌體抽提試劑盒。房水樣本經(jīng)低速離心去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片后，將聚合物沉淀劑 ExoQuick試劑與上清液4 ℃共孵育，使外泌體聚集。次日低速離心、PBS重懸沉淀即可獲得房水外泌體[11]。試劑盒法操作簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，僅需進(jìn)行低速離心等操作即可從少量樣本中獲得豐富的外泌體。但是利用此方法提取的外泌體中仍可能混有蛋白質(zhì)及其他細(xì)胞外微囊泡物質(zhì)，有學(xué)者證實(shí)，增加ExoQuick試劑的用量及提高離心力，可使外泌體的純度明顯提高[14]。

為了突破房水量少、外泌體得率低這一瓶頸，學(xué)者們不斷探索新的分離房水外泌體的方法。Green等[15]研發(fā)了用于房水檢測(cè)的簡(jiǎn)單夾心免疫熒光分析微流體裝置。然而，這種基于聚二甲基硅氧烷(polydimethyl siloxane, PDMS)的微流體裝置需要精密的設(shè)計(jì)和紫外遮蔽構(gòu)造，因此不能被廣泛推廣應(yīng)用。針對(duì)這一缺點(diǎn)，Chen等[16]研發(fā)了一種基于纖維素膜的微流體平臺(tái)，它是采用微流控芯片技術(shù)的免疫親和裝置。這一裝置大大降低了房水樣本量(只需25 μI房水樣本)，簡(jiǎn)化了從房水中分離外泌體的程序。

其他分離外泌體的方法如超濾法、蔗糖密度梯度法、免疫親和層析法和沉淀法，由于獲得的外泌體數(shù)量少，限制了在房水外泌體分離中的應(yīng)用。

三、房水外泌體在眼科疾病中的應(yīng)用

由于獲取房水倫理因素的制約、分離高純度房水外泌體技術(shù)的限制，房水外泌體在眼科領(lǐng)域的研究較少，目前主要局限于以下幾種疾病的研究。

1.青光眼 青光眼是一種以進(jìn)行性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡、視盤萎縮和凹陷以及視野缺損為特征的疾病，是全球第二位致盲疾病。房水在青光眼的病理生理學(xué)中發(fā)揮著重要功能，許多生物活性因子、信號(hào)分子、免疫介質(zhì)和類固醇激素均參與調(diào)控房水的動(dòng)態(tài)循環(huán)[17]。與青光眼疾病相關(guān)的特異性房水外泌體來(lái)源是什么？目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，房水外泌體可由睫狀體非色素上皮細(xì)胞釋放，其內(nèi)的核糖核酸片段靶向小梁網(wǎng)細(xì)胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯[18]。此外，外泌體也可從小梁網(wǎng)細(xì)胞分泌[19]并返回睫狀體，通過(guò)這種相互的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控維持房水的穩(wěn)態(tài)，即正常眼內(nèi)壓。最近的研究表明，非色素性睫狀體上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以靶向小梁網(wǎng)細(xì)胞，通過(guò)影響 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓，其中外泌體miR-29b可通過(guò)降低Wnt/β-catenin通路水平，調(diào)控Ⅲ型膠原蛋白COL3A1等細(xì)胞外基質(zhì)的功能[18]。房水外泌體中富含的肌纖維蛋白(myocilin)是由小梁網(wǎng)細(xì)胞以外泌體樣囊泡形式釋放至細(xì)胞胞外，在促進(jìn)細(xì)胞碎片從小梁網(wǎng)排出、維持正常房水循環(huán)中發(fā)揮重要作用[19]。Myocilin的突變?nèi)狈?dǎo)致小梁網(wǎng)阻塞，房水循環(huán)受阻，最終導(dǎo)致眼壓升高[20]。

在開(kāi)角型青光眼和糖皮質(zhì)激素性青光眼中，房水外泌體發(fā)揮重要作用。細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑是維持小梁網(wǎng)功能的一個(gè)重要因素[7]。外泌體是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的重要介質(zhì)，在地塞米松處理的小梁網(wǎng)細(xì)胞釋放的外泌體中，肝素/肝素硫酸結(jié)合膜聯(lián)蛋白A2(heparin/heparan sulfate binding annexins A2)和A6顯著減少，外泌體-纖維連接蛋白(fibronectin)結(jié)合依賴肝素硫酸鹽(heparan sulfate)，導(dǎo)致外泌體-Fibronectin結(jié)合量顯著減少。該研究結(jié)果從機(jī)制上證明了外泌體黏附物和特性的改變導(dǎo)致小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)病理性積累，房水流出通道受阻從而導(dǎo)致青光眼[7]。

目前，沒(méi)有特定的生物標(biāo)志物可以作為早期青光眼可靠的預(yù)測(cè)指標(biāo)。Tanaka等[21]通過(guò)對(duì)青光眼患者房水miRNAs的高通量分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的miRNAs(如Hsa-let-7b-3p)有助于提高青光眼診斷的敏感性。外泌體在青光眼疾病中的研究已初步開(kāi)展，房水外泌體及其攜帶的蛋白及miRNA在青光眼早期診斷、判定疾病進(jìn)展、監(jiān)控藥物不良反應(yīng)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.年齡相關(guān)性黃斑變性 年齡相關(guān)性黃斑變性(aged-related macular degeneration，AMD)包括干性型AMD及濕性型AMD，是以玻璃疣及脈絡(luò)膜新生血管為特征的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[22]。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激、缺氧、慢性炎癥、脂褐素的積累均是誘發(fā)AMD的病理因素。RPE對(duì)光感受器外段吞噬活性下降、細(xì)胞外基質(zhì)在基底膜異常積累形成玻璃疣，繼而導(dǎo)致神經(jīng)視網(wǎng)膜中的感光細(xì)胞和視神經(jīng)損傷而喪失視力[23]。最近，Wang 及其同事[24]描述了玻璃疣形成的新機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)玻璃疣細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組圖譜與外泌體的蛋白質(zhì)組圖譜非常相似，并證實(shí)玻璃疣的形成是由RPE細(xì)胞通過(guò)外泌體釋放，將細(xì)胞內(nèi)蛋白變成胞外蛋白而引發(fā)的。理論上來(lái)說(shuō)，AMD患者的RPE細(xì)胞、Müller細(xì)胞或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞都有可能分泌特異性外泌體，外泌體再?gòu)牟Ａw向前擴(kuò)散到AMD患者的房水中。Kang 等[11]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激刺激下，ARPE-19 細(xì)胞釋放的外泌體數(shù)量顯著增加。而且，在房水外泌體中只檢測(cè)到RPE65蛋白(RPE細(xì)胞特異性標(biāo)記物)，未檢測(cè)到谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS，Müller 細(xì)胞標(biāo)記物)或 Thy-1蛋白(視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記物)表達(dá)，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)RPE可能是AMD患者房水中特異性外泌體的主要來(lái)源。

Kang等[11]利用液相色譜與質(zhì)譜技術(shù)(LC-MRM)對(duì) AMD 患者房水外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示組織蛋白酶 D(cathepsin D)、細(xì)胞角蛋白 8 (cytokeratin 8)、cytokeratin 14等6種標(biāo)志性蛋白表達(dá)明顯增加。Cathepsin D 水平升高反映了 AMD 患者可能通過(guò)自噬溶酶體途徑抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。同樣，Wang 等[24]在AMD患者捐贈(zèng)眼的玻璃膜疣中發(fā)現(xiàn)了自噬和外泌體標(biāo)志物，并證實(shí)了老化的RPE細(xì)胞釋放的外泌體可以通過(guò)自噬作用參與玻璃膜疣的形成。另一方面，cytokeratin 8、14在AMD患者房水外泌體中表達(dá)增高可能是自噬和氧化應(yīng)激缺陷的組織學(xué)標(biāo)志，也可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的原因[25]。但是，新生血管性 AMD 患者中細(xì)胞角蛋白的上調(diào)是機(jī)體適應(yīng)性的結(jié)果，還是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的原因，目前還不明確。

3.糖尿病相關(guān)性白內(nèi)障 糖尿病患者中白內(nèi)障的患病率顯著增高，雖然其臨床表現(xiàn)與年齡相關(guān)的白內(nèi)障相似，但發(fā)病機(jī)制更為復(fù)雜。在白內(nèi)障手術(shù)過(guò)程中獲取房水組織相對(duì)容易，近年來(lái)房水外泌體在白內(nèi)障領(lǐng)域得到了初步的研究。Gao等[26]使用連續(xù)差速離心法分離了合并糖尿病白內(nèi)障患者的房水外泌體，并將其與年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)的miRNAs(295個(gè)表達(dá)上調(diào)miRNAs和138個(gè)表達(dá)下調(diào)miRNAs)，并利用生物信息學(xué)分析了它們的相關(guān)功能，其中miR-551b表達(dá)增高并靶向αA-晶狀體蛋白，調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞的活力、增殖和凋亡，推測(cè)房水外泌體miR-551b可能參與糖尿病患者晶狀體混濁發(fā)生機(jī)制。同樣，在其他類型白內(nèi)障中，確定房水外泌體的來(lái)源、靶組織、了解房水外泌體攜帶的生物活性物質(zhì)(如小RNA及蛋白)的功能，將會(huì)為各種類型白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供重要信息，為預(yù)防和治療白內(nèi)障提供新方向。

4.近視 近視是東南亞地區(qū)最常見(jiàn)的屈光異常，近視的危害性已經(jīng)日益受到人們的重視，現(xiàn)已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。Chen等[27]通過(guò)房水外泌體研究篩選出15個(gè)近視特異性miRNAs和4個(gè)近視缺失性miRNAs，通過(guò)使用創(chuàng)新途徑分析(ingenuity pathway analysis，IPA)的mir-mRNA配對(duì)工具，鑒定了可能與近視相關(guān)的六個(gè)潛在靶基因(CHRM2、CNGB3、VEGFA、ADORA2A、IGF1、LUM)，CHRM2基因可能是近視缺失has-miR-378a-5p 的靶點(diǎn)。這些結(jié)果表明，房水外泌體miRNAs可能在近視的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Tsai等[28]通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)證實(shí)，與對(duì)照組比較，近視患者房水外泌體蛋白總含量顯著增加，表明近視患者房水中含有更多的外泌體蛋白。另外，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)和血色素結(jié)合蛋白(hemopexin，HPX)等25種近視特異性外泌體蛋白被證實(shí)。在以往的研究中，高度近視患者的血清中檢測(cè)到高表達(dá)的TTR和HPX[29，30]。此外，在高近視患者的房水中也發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的TTR[31]。目前，近視患者房水外泌體的研究剛剛起步，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以探討近視特異性的外泌體miRNAs及蛋白在近視眼中的作用。

四、展望

目前，房水外泌體在眼科領(lǐng)域的研究取得了一定進(jìn)展，但還處于初級(jí)階段。在不同種類的眼部疾病中，房水外泌體及其攜帶的生物活性物質(zhì)的來(lái)源細(xì)胞是什么，靶細(xì)胞是什么，怎樣實(shí)現(xiàn)細(xì)胞之間信息傳遞和功能調(diào)控，未來(lái)的研究將不得不回答這些問(wèn)題。隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的深入、分離房水外泌體技術(shù)的提高，房水外泌體在眼科病理生理機(jī)制研究(如細(xì)胞間通訊及調(diào)控)、診斷(如生物標(biāo)志物篩選)及治療(如藥物載體研發(fā))方面均展示了廣闊的應(yīng)用前景。