牙髓干細胞的生物學性能及臨床應用研究進展

李陽陽，張茂林，楊 馳，鄒多宏，張志愿

Stomatology,2022,42(1):1-7

臨床上，由各種原因導致的牙頜面硬組織缺損發(fā)病率高，大量神經(jīng)性、血管性等軟組織疾病也在尋求效果更為突出的治療方法。牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是一類存在于恒牙/乳牙牙髓內具有自我更新、多向分化、高度增殖能力的外胚間充質干細胞，它易于獲得，免疫原性低，易保存，無倫理爭議，不易形成腫瘤，較人體其他間充質干細胞更具優(yōu)勢。在適宜條件下，DPSCs可分化為多種人體細胞，為組織器官修復和多種疾病治療提供細胞來源，被認為是很有前景的間充質干細胞。本文通過對DPSCs相關文獻的總結，對DPSCs的分離與培養(yǎng)、儲存與鑒定、增殖分化與遷移、代謝等一般生物學特性進行論述，并探討其成骨/成牙本質、成肌/成血管、神經(jīng)再生的機制及其在糖尿病和眼部疾患的臨床前應用。同時，本文結合了國內外有關DPSCs的最新臨床應用進展，給未來DPSCs實現(xiàn)更廣闊的臨床轉化應用提供理論及臨床實踐參考。

1 牙髓干細胞的生物學性能

1.1 分離培養(yǎng)、儲存與鑒定

分離DPSCs最常用的是聯(lián)合酶消化法，一般從阻生智齒、正畸減數(shù)牙的牙髓組織中獲取。齲壞的牙齒一般不作為“提牙”的細胞來源，但是用1%聚維酮碘處理后，再提取的DPSCs增殖速度更快，符合國際細胞治療學會對間充質干細胞的三個要求，擴大了再生醫(yī)學的細胞來源[1]。牙庫是收集直接用于臨床一線的DPSCs的部門。許多國家的牙庫已經(jīng)建立起完善的DPSCs存取流程，包括收集、運輸、干細胞分離、低溫儲藏等[2]。DPSCs本質上是一個細胞群體，它們在增殖能力、分化潛力、基因表達和表面標記物表達方面存在著差異。用流式分析儀對DPSCs進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其陽性表達CD73、CD90、CD105 等間充質干細胞特異性表面標志物，不表達CD34、CD45等造血干細胞標記物[3]。

1.2 多向分化

干細胞的一個突出能力是多向分化，這也是DPSCs在組織再生中作為種子細胞的獨特優(yōu)勢。通過適當?shù)恼T導，DPSCs能獲得更為優(yōu)越的分化效率。無血清凍存液懸浮狀態(tài)下，將DPSCs置于-80 ℃冰箱凍存1年，復蘇后仍具有多向分化的能力。將適宜濃度氯化鋰溶液加入基礎培養(yǎng)基中，DPSCs成骨分化明顯，Wnt/β-catenin蛋白高表達。在誘導液中添加抗生素類制劑雷帕霉素，它能抑制mTOR通路，下調ERK及JNK基因表達水平，最終促進DPSCs成骨向分化[4]。研究發(fā)現(xiàn)DPSCs的染色體端粒長度以及CD271表達水平與其分化能力有著密切聯(lián)系[5]。Michot等[6]發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關肽會降低DPSCs的代謝活性和增殖，但對其成骨分化的過程不造成影響。

1.3 增殖和遷移

Gronthos等[7]發(fā)現(xiàn)DPSCs的克隆增生率顯著高于骨髓間充質干細胞，并在傳代中依然保持著較高的增殖能力。DPSCs增殖和遷移能力涉及眾多信號通路，有學者利用DPSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)DPSCs,發(fā)現(xiàn)其遷移能力的提高是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與受體TrkB結合以及神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5與細胞遷移相關因子ERK結合的結果； Hippo信號通路下游轉錄因子TAZ亦通過介導TGF-β信號通路調節(jié)結締組織生長因子和富半胱氨酸生長誘導物Cyr61，促進DPSCs的增殖和遷移；膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進DPSCs的遷移，涉及PI3K/AKT 及 MEK/ERK信號通道，未來將研究其是否可作為蓋髓材料的輔因子；血管內皮生長因子作用于受體，激活FAK/PI3K/AKt和p38/MAPK通路，促進DPSCs的遷移[8-11]。有學者將抗生素MET、CIP分別加在纖維支架上與溶液中，并進行細胞增殖對比，發(fā)現(xiàn)纖維支架狀態(tài)更有利于DPSCs增殖[12]。在辛伐他汀的臨床應用背景下，有學者將其用于DPSCs的研究，發(fā)現(xiàn)它能顯著促進DPSCs的增殖，有望用于臨床上牙髓切斷術后的牙髓再生[13]。

1.4 代謝

與其他間充質干細胞一樣，雖然DPSCs自身代謝較穩(wěn)定，但也會受到多種因素的調控，可塑性亦很強。Duailibi等[14]對DPSCs進行細胞遺傳學分析，發(fā)現(xiàn)細胞生存環(huán)境的改變能導致細胞內染色體數(shù)量及結構的畸變，且大部分是有益于細胞的適應性變異。對DPSCs進行糖代謝分析，發(fā)現(xiàn)在DPSCs分化的早期，糖代謝不受氧壓和個體差異的影響，但會從早期未分化狀態(tài)的糖酵解變成分化狀態(tài)的糖酵解和三羧酸循環(huán)同時存在[15]。Al-Habib等[16]發(fā)現(xiàn)小分子物質如Pluripotin、雷帕霉素能降低DPSCs干性，而6-溴靛玉紅-3-肟則可以維持DPSCs的干性。抑制DPSCs凋亡的目標可通過腎上腺髓質素作用于PI3K/Akt信號通路和miRNA-224直接抑制Rac家族小GTP酶兩種方式，進而間接抑制絲裂原活化蛋白激酶JNK和凋亡信號通路FasL來實現(xiàn)，而miRNA-152則靶向降低SIRT7，促進DPSCs的凋亡[17-19]。

2 牙髓干細胞的臨床前探索

2.1 成骨/成牙本質

2.1.1 組織工程骨的探索 構建組織工程骨最為重要的就是構造骨的外形和釋放細胞因子的介質。Tatsuhiro等[20]在單層培養(yǎng)基上獲得DPSCs薄片，而后放在成骨培養(yǎng)基中3D立體培養(yǎng)獲得能分泌細胞外基質和鈣化基質的立體構造物，將其作為支架用于培養(yǎng)DPSCs能促進其成骨分化；Sevari等[21]用海藻酸鹽聯(lián)合基質膠，再復合生物活性玻璃水凝膠作為支架封裝DPSCs后，其成骨分化能力得到提升；Toh等通過調整PEG-Fibrinogen水凝膠的交聯(lián)度和硬度，得到人工細胞外基質，聯(lián)合DPSCs培養(yǎng)后促進其成骨/成牙本質分化；亦有學者設計了微重力下動態(tài)旋轉培養(yǎng)系統(tǒng)，通過聯(lián)合PLAG支架和經(jīng)典成骨誘導培養(yǎng)基，促進DPSCs的成骨分化；Nakashima等獲取作為支架的細胞基質，聯(lián)合BMP-4后成功地誘導了DPSCs成牙本質向分化；Yanasse等[25]利用富血小板血漿作為支架，聯(lián)合DPSCs后植入兔軟骨缺損處，兔透明軟骨全層逐漸得到修復，而滑膜內層增厚現(xiàn)象減少，防止了滑膜炎的發(fā)生；Matoug-Elwerfelli等[26]通過SDS、TritonX-100對牙髓進行循環(huán)脫細胞處理，保留了其組織特異性生長基質，聯(lián)合DPSCs培養(yǎng)后，牙髓牙本質復合體大量形成，給牙髓再生的研究提供了良好的方向[20-26]。即便如此，目前尚無具有理想代謝率的支架材料，細胞因子的釋放周期難以調控。

2.1.2 基因層次調控成骨分化的方向 染色體上特殊序列決定的牙本質涎磷蛋白能決定DPSCs分化方向，缺乏牙本質涎磷蛋白后DPSCs會向軟骨細胞方向分化[27]。Kim等[28]通過基因芯片定位顱面組織胚胎發(fā)育過程中高度表達的LIM HOMEOBOX8基因，發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶USP1能促進其底物ID1蛋白去泛素化，而USP1抑制劑ML323能抑制這個過程，促進DPSCs的成骨分化。轉錄因子SP1通過調控ERK2促進底物BMP-2的產(chǎn)生，同時抑制BMP靶點抑制劑的分泌型蛋白NOGGI的作用，促進DPSCs的成骨分化[29]。如何在基因層面進行精準調控則是未來需要聚焦的重大課題。

2.1.3 宏觀理化因素對成骨分化的影響 理化因素作為誘導因子也扮演著重要角色：低分子量魚精蛋白-超氧化物歧化酶能穿透DPSCs的細胞膜，抑制過氧化氫對細胞的氧化應激損害，促進其成骨向分化[30]；低強度激光預處理DPSCs促進其成骨分化，機制尚不明確[31]；Oliveira等[32]用適宜直流電刺激DPSCs，促進了DPSCs的成骨/成牙本質分化，極大地提高了組織工程骨的構建效果；適宜濃度的鍶亦可促進DPSCs的成骨/成牙本質分化[33]。但是應該更多地從宏觀變化來探討其具體成骨機制，為未來的宏觀精準調控奠定基礎。

2.2 成肌/成血管

自Gronthos等發(fā)現(xiàn)DPSCs以來，成肌分化亦成為研究熱點。有學者利用5-Aza-2-脫氧胞苷抑制DPSCs中miRNA-135以及miRNA-143表達，成功促進了DPSCs向肌細胞的分化[34]。亦有學者利用miRNA-126轉染人乳牙DPSCs(早期外胚葉間充質組織頭部的神經(jīng)嵴細胞遷移生出的牙髓間充質干細胞)，發(fā)現(xiàn)其血管樣結構、CD31、血管內皮生長因子R2、血管生成素-1均顯著增加[35]。用含血管內皮生長因子的培養(yǎng)基誘導人乳牙DPSCs成血管分化，出現(xiàn)血管樣結構，血管內皮細胞表面標記物免疫熒光呈陽性[36]。Sugiyama等[37]栓塞小鼠大腦中動脈制備短暫性局灶性腦缺血再灌注模型，CD31陰性和CD146陰性的牙髓干細胞側群(side population，SP)細胞植入的低血區(qū)有大量的小鼠內皮細胞抗原表達，他們認為，SP細胞可促進內皮前體細胞的遷移和分化，誘導低血區(qū)血管發(fā)生。

2.3 神經(jīng)再生

Ahmed等[38]認為DPSCs分泌的一些細胞因子對逆轉阿爾茨海默病起著關鍵性作用，它們能刺激內源性存活因子Bcl-2，降低凋亡調節(jié)因子Bax。有人用3-乙酰吡啶誘導大鼠小腦共濟失調模型，DPSCs移植入相應區(qū)域后分化為神經(jīng)膠質細胞和神經(jīng)元，體視學見小腦分子層、顆粒層和白質體積明顯增加，炎癥細胞因子水平下降，浦肯野細胞的退化也被遏制[39]。有學者利用內皮細胞和星形膠質細胞共培養(yǎng)建立血腦屏障模型研究腦卒中治療方法，他們向血管注射DPSCs后，增強了血腦屏障的通透性，促進了干細胞的粘附和遷移，對中風治療產(chǎn)生積極影響[40]。Sowa等[41]利用腺病毒載體轉染形成過表達肝細胞生長因子的DPSCs，促進腦缺血-再灌注后的血管生成，延長了急性腦卒中治療的窗口期。常規(guī)治療脊髓損傷的方法會形成膠質瘢痕，F(xiàn)eitosa等[42]構建了狗的慢性脊髓損傷模型，他們用未成熟的DPSCs移植到脊髓損傷區(qū)域后，狗的肢體功能得到明顯的改善。Gnanasegaran等[43]探究在體外炎癥微環(huán)境中DPSCs對神經(jīng)元和小膠質細胞的影響，為帕金森病治療尋找替代方法，未來可能成為個性化細胞替代療法的關鍵一步。

2.4 糖尿病

Datta等[44]用鏈脲佐菌素建立大鼠糖尿病神經(jīng)病變模型，他們將DPSCs經(jīng)肌肉重復注射后，大鼠痛覺過敏癥狀、握力、運動協(xié)調性和神經(jīng)傳導速度均有所改善，未來還需要對其脂肪代謝、胰島再生等方面進一步研究。Makino等[45]認為移植細胞很少能在移植部位存活，他們在大鼠后肢骨骼肌注射濃縮10倍的DPSCs條件培養(yǎng)基后，增加了巨噬細胞中抗炎標志性因子CD206和IL-10的表達，誘導了M2極化，延長了背跟神經(jīng)節(jié)細胞的突起生長，增加了施萬細胞的增殖和髓鞘形成，糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變得到恢復，作為治療糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變的一種無細胞治療策略，未來還需要進一步研究其注射的劑量、治療時間和療效持續(xù)時間。Kanada等[46]探究DPSCs及DPSCs分泌因子對糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)揮作用的還是細胞的分泌物。

2.5 眼

角膜移植手術給因角膜致盲的患者帶來曙光，但存在角膜供體短缺、移植物長期保存困難以及移植物排斥反應和倫理沖突等問題。DPSCs因其與角膜組織共同來源于胚胎外胚層的神經(jīng)嵴，具有分化為角膜各層組織細胞的潛力，成為研究的熱點。體外培養(yǎng)的DPSCs能夠表達與角膜緣干細胞相同的分子標記物。未分化的DPSCs亦能夠表達角膜上皮細胞特異性標志物細胞角蛋白。羊膜組織和軟性角膜接觸鏡作為角膜重建中的生物載體以及DPSCs能夠明顯改善受損角膜的透明度進而防止角膜上皮結膜化的研究已深入；以人類未成熟DPSCs結合作為生物支架的去上皮羊膜，通過特殊的誘導方式進行培養(yǎng)能重建眼表；DPSCs亦能通過恢復視網(wǎng)膜色素上皮細胞和光感受器細胞治療視網(wǎng)膜退行性疾病[47-49]。長期的效果還需要更豐富的臨床實踐進一步驗證。

3 牙髓干細胞的臨床應用進展

3.1 牙髓再生

再生移植體植入根管前需要一個相對無菌且潔凈的環(huán)境，有學者利用1 mg/mL抗生素DAP對根管進行消毒處理后，再用EDTA進行清洗，基本消除了殘留的DAP對根管產(chǎn)生的影響，DPSCs的增殖和附著得到明顯提高，這可能歸因于EDTA有能力洗去牙本質中殘留的DAP，并暴露各種牙本質基質成分和生長因子[50]。牙髓再生研究的焦點集中于可注射支架，利用支架搭載種子細胞和微環(huán)境則可以實現(xiàn)這個過程。典型的可注射聚L-乳酸微球支架和自組裝納米纖維海綿微球支架等，它們的特性包括：高表面積和納米纖維結構有利于細胞與材料的相互作用；在體內降解的過程是可控的、漸進的、緩慢的，能模擬細胞外基質相互連通的纖維多孔結構；能夠搭載DPSCs進入不規(guī)則的根管，使移植體盡可能充滿整個根管。通過低氧3D培養(yǎng)復合物，轉錄因子HIF-1表達上調，后者促進血管內皮生長因子生成，移植后組織血管密度與天然牙髓組織結構一樣，且牙本質-牙髓界面出現(xiàn)特征性的成牙本質細胞內襯。在高仿生體內模型中注射聚L-乳酸微球支架-DPSCs復合物后，根管內大量表達Ⅰ型膠原和牙本質形成蛋白，促進了牙本質再生，此技術有望替代惰性根管充填材料，促進有效的牙髓-牙本質復合體再生，使根管治療長期的效果更佳[51-52]。

3.2 骨再生

組織工程骨是通過種子細胞、生物支架、細胞因子三者聯(lián)合植入骨缺損處，用于取締自體或同種異體骨移植的一種骨再生的方法。近年來，國內外有許多將組織工程骨成功用于臨床骨缺損的報道，目前處于比較前沿的是：機械解聚牙髓獲得富含干細胞的自體微型移植物，后者與膠原支架結合后用于骨再生。機械解聚能在很小的自體牙髓樣本中產(chǎn)生數(shù)百萬個微型移植物，50 μm濾網(wǎng)過濾后，通過衰老分化細胞的排出和年輕干細胞的富集，獲得的細胞與酶消化后的細胞完全相似，整體移植用于牙周圍骨組織再生，避免了收集牙髓和分離間充質干細胞的過程，術后臨床和影像學效果顯著[53]。有學者收集了擴增培養(yǎng)的DPSCs，聯(lián)合膠原基質支架植于下頜智齒拔牙窩，再生的骨血管分布均勻，骨密度和牙槽間隔顯著提高，有效減少了拔牙后牙槽骨的吸收[54]。

3.3 神經(jīng)再生

常規(guī)藥物大都通過血液循環(huán)進入大腦，這在急性期似乎是可行的，但慢性期完整血腦屏障的存在則使其療效難以達到滿意的效果。學者們另辟蹊徑，選擇顱內注射DPSCs。由于慢性期可能出現(xiàn)神經(jīng)替代、血管生成和神經(jīng)可塑性現(xiàn)象，他們利用老年人自體適宜濃度的DPSCs，采用特殊的方式注射至中度至重度殘疾的中風幸存者腦部梗死灶及其周圍，通過術前及術后多次觀察分析得出結論：自體DPSCs治療中風后慢性癥狀是安全的、可行的[55]。也有DPSCs分化為神經(jīng)前體細胞，再將其與提供微環(huán)境和神經(jīng)營養(yǎng)因子的片狀蝸螺旋神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)后移植改善感音性耳聾的報道等。

3.4 其他

自2020年初新型冠狀病毒疫情爆發(fā)以來，領域內學者在已有的DPSCs研究成果的基礎上，開展了異體DPSCs用于治療重癥COVID-19的臨床試驗，在小樣本量下，對實驗組和對照組分別進行安全性和有效性的對比評估，各項臨床指標試驗結果有統(tǒng)計學意義，展示了其在應對突發(fā)性臨床及公共衛(wèi)生事件中的巨大優(yōu)勢[56]。國內在王松靈院士團隊的引領下，有關DPSCs的研發(fā)專利層出不窮，涉及醫(yī)療多個前沿領域：DPSCs用于治療或預防神經(jīng)性疾病、風濕性疾病、肥胖癥和/或代謝綜合征的研究正在不斷深入；體外誘導DPSCs向膀胱平滑肌細胞、心肌樣細胞分化的方法也獲得了一大批專利成果；牙齒相關干細胞、基因修飾的牙源性干細胞的用途也在臨床上不斷拓展；在支架開發(fā)方面，有促進骨缺損修復的埃洛石復合水凝膠的合成以及基于蛋清和甲基丙烯酸衍生化聚合物的復合膜制備，更是拓展了它們在培養(yǎng)干細胞方面的應用；TNF-α等增強DPSCs與臍靜脈內皮細胞共培養(yǎng)的血管生成能力也予以轉化應用；基于DPSCs對皮膚成纖維細胞衰老及增殖能力的影響，一種高保濕促潤膚的重建兒童乳牙DPSCs面膜有望進入市場用于人體；亦有學者開發(fā)了DPSCs延緩女性卵巢早衰的技術等等。

4 展 望

DPSCs具有良好的自我更新與多向分化潛能，取材安全方便、易于擴增和保存，十分有利于臨床研究與應用，基礎研究頗為豐富，但其各項突出成果成功轉化到臨床實踐的目標還未完全實現(xiàn)，累積的資料十分有限。移植到人體內后的相關機制、人類對異體DPSCs的排斥反應以及應用后的長期臨床效果等，國內外都還沒有深入研究報道。因此全面研究DPSCs的性質，進一步加強基礎-臨床轉化研究將是未來幾年亟待解決的課題。伴隨著材料學、分子生物技術、組織工程再生技術的進一步發(fā)展，必定會真正實現(xiàn)DPSCs的臨床轉化應用。