降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)牙正畸移動(dòng)微環(huán)境改建作用的研究進(jìn)展

紀(jì)雅寧，錢素婷，丁玲敏，林 軍

Stomatology,2022,42(1):79-83

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是由神經(jīng)末梢分泌的一種神經(jīng)多肽，近年來(lái)，由于CGRP被發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)調(diào)控骨改建的關(guān)鍵因子并且與血管及膠原再生有關(guān)而備受關(guān)注[1]。早在1998年的研究[2]中就已證實(shí)，在牙正畸移動(dòng)(orthodontic tooth movement, OTM)中，CGRP不僅可以傳遞給牙周膜(periodontal ligament，PDL) 和牙槽骨傷害性刺激，而且在響應(yīng)OTM發(fā)生的神經(jīng)、血管、膠原及牙槽骨等的改建中也十分重要。生理狀態(tài)下CGRP陽(yáng)性纖維約占全部感覺(jué)神經(jīng)的50%，而OTM微環(huán)境中CGRP的表達(dá)量增加且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3-4]。正畸治療過(guò)程中，矯治器產(chǎn)生的力通過(guò)三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion，TG)的瞬時(shí)受體電位香草素1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)受體啟動(dòng)CGRP的合成、囊泡運(yùn)輸及分泌過(guò)程，CGRP水平上升，對(duì)OTM微環(huán)境的改建發(fā)生作用[5-6]，包括但不限于牙周神經(jīng)、膠原、血管及牙槽骨的新生。目前，關(guān)于CGRP調(diào)控OTM微環(huán)境改建的機(jī)制研究較少，現(xiàn)對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行闡述。

1 CGRP及其受體的分子生物學(xué)特性

1.1 CGRP的分子生物學(xué)特性

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是降鈣素基因相關(guān)肽超級(jí)家族的成員之一，衍生自CALCA基因RNA轉(zhuǎn)錄物的可變剪接，由37個(gè)氨基酸組成。人類表達(dá)兩種形式的CGRP(α-CGRP和β-CGRP)，它們由11號(hào)染色體的不同位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而來(lái)，僅有3個(gè)氨基酸的不同，同源性超過(guò)90%，發(fā)揮著相似的生物學(xué)作用[7]。傳統(tǒng)上，人們認(rèn)為α-CGRP是OTM微環(huán)境中的主要形式[8]。

CGRP主要位于C和Aδ感覺(jué)神經(jīng)纖維中，由神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞合成，通過(guò)軸漿運(yùn)輸?shù)礁杏X(jué)神經(jīng)末梢，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以分泌顆粒的形式儲(chǔ)存。在OTM微環(huán)境中，CGRP主要由TG合成，隨著感覺(jué)神經(jīng)末梢廣泛分布于牙槽各處[9-10]，呈血管周圍定位性及骨代謝活躍區(qū)定位性特征性分布[11]。上述產(chǎn)生及分布特點(diǎn)為CGRP對(duì)OTM微環(huán)境中骨、血管、神經(jīng)及膠原的調(diào)控提供了先天的優(yōu)勢(shì)。

1.2 CGRP受體的分子生物學(xué)特性

功能最佳的CGRP受體由兩部分結(jié)構(gòu)構(gòu)成，一部分為G蛋白耦聯(lián)降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor, CRLR)和受體活性修飾蛋白-1(receptor activity modifying protein-1, RAMP-1)組成的異二聚體，另一部分為受體成分蛋白(receptor component protein, RCP)[12]。

在OTM微環(huán)境中，矯治器產(chǎn)生的力刺激三叉神經(jīng)(trigeminal nerve, TN)神經(jīng)末梢以旁分泌形式釋放CGRP至OTM微環(huán)境中，與CGRP受體結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，在產(chǎn)生疼痛的同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)調(diào)節(jié)作用[13]。

2 CGRP對(duì)OTM中牙槽骨改建的作用

2.1 CGRP對(duì)OTM微環(huán)境中干細(xì)胞的作用

牙源性干細(xì)胞(dental stem cells，DSCs)主要為間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs),來(lái)自于胚胎發(fā)育過(guò)程中的中胚層，具有多向分化潛能，是目前組織工程及再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[14]。其中與OTM牙槽骨改建相關(guān)的且表達(dá)CGRP受體的牙源性干細(xì)胞主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)及牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)[15]。

2.1.1 CGRP促進(jìn)BMSCs成骨分化及遷移 目前，大家普遍認(rèn)同BMSCs可以通過(guò)Wnt/β-Catenin、BMPs/Smad、TGF-β/STAT信號(hào)通路等來(lái)調(diào)控成骨細(xì)胞分化[16]。在對(duì)牙槽骨的研究中， Liu等[17]在CGRP缺乏影響牙槽骨內(nèi)種植體骨結(jié)合的研究中發(fā)現(xiàn)，下牙槽神經(jīng)切除術(shù)導(dǎo)致的CGRP缺乏會(huì)使種植體周圍成骨受到抑制，且這一過(guò)程由經(jīng)典的Wnt/β-Catenin通路傳遞，即CGRP通過(guò)PKA信號(hào)傳導(dǎo)激活糖原合酶激酶-3b(GSK-3b)導(dǎo)致β-Catenin核轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)BMSCs的成骨分化及成骨細(xì)胞的增殖，進(jìn)而完成牙槽骨的重塑。王飛及Zhang等[18-19]在體外實(shí)驗(yàn)中證明CGRP促進(jìn)BMSCs成骨分化與Hippo通路有關(guān)，CGRP能夠上調(diào)p-Mst1/2表達(dá),通過(guò)效應(yīng)分子Yap/Taz完成信號(hào)的轉(zhuǎn)達(dá)。基于目前研究證據(jù)可分別證實(shí)OTM微環(huán)境中CGRP表達(dá)上調(diào)和高表達(dá)的CGRP可通過(guò)經(jīng)典Wnt/β-Catenin通路與Hippo通路等促進(jìn)BMSCs成骨分化進(jìn)而加速局部牙槽骨改建，但尚缺乏連續(xù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明CGRP對(duì)OTM局部微環(huán)境BMSCs的作用。Jia等[20]還發(fā)現(xiàn)CGRP給藥可以使下頜牽張成骨(mandibular distraction osteogenesis，MDO)大鼠模型中的BMSCs遷移能力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中，成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和核心結(jié)合因子2(runt-related transcription factor2，RUNX2)表達(dá)上調(diào)， 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)表達(dá)亦上調(diào)。而同期針對(duì)SDF-1的實(shí)驗(yàn)[21]證明，SDF-1既可招募并促進(jìn) BMSCs成骨分化又可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)等的表達(dá)，可以推測(cè) CGRP通過(guò)上調(diào)成骨細(xì)胞表達(dá) SDF-1 招募并促進(jìn) BMSCs 成骨分化加速骨改建，同時(shí)與微循環(huán)改建相關(guān)聯(lián)，但目前亦沒(méi)有具體且連續(xù)性的實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行證明。

2.1.2 CGRP促進(jìn)PDLSCs成骨分化 PDLSCs是一類具有自我更新能力、多能性和免疫調(diào)節(jié)作用的MSCs，不僅可以向同胚層骨樣細(xì)胞，脂肪樣細(xì)胞增殖分化，而且可以向外胚層來(lái)源的神經(jīng)元細(xì)胞，施萬(wàn)細(xì)胞等分化[22]。在OTM中，正畸矯治力可以通過(guò)Piezo 1受體及細(xì)胞骨架等傳遞給PDLSCs，也可以通過(guò)TG的TRPV1受體啟動(dòng)CGRP的合成和分泌傳遞[23-25]。王芳等[26]的體外研究證實(shí)，CGRP對(duì)人PDLSCs成骨分化和成血管能力有正向促進(jìn)作用，且其與mTOR信號(hào)通路有關(guān)。除此以外，王林等[24]研究發(fā)現(xiàn)OTM中促進(jìn)PDLSCs成骨分化的激活通路還包括Notch1， OTM微環(huán)境中的PDLSCs上調(diào)了ALP、Runx2、OCN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)了成骨，但關(guān)于CGRP在其中的地位未進(jìn)行證實(shí)。PDLSCs作為組織再生領(lǐng)域的新興研究熱點(diǎn)，針對(duì)其的研究相對(duì)較少，CGRP促進(jìn)其成骨的研究亦十分缺乏，具體機(jī)制尚需研究者們進(jìn)一步發(fā)掘。

2.2 CGRP對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用

成骨細(xì)胞胞膜上存在CGRP受體在多年前就已被報(bào)道，提示CGRP對(duì)成骨細(xì)胞有直接作用[27]。

He等[28]從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CGRP抑制了OPG/RANKL調(diào)控的破骨細(xì)胞生成。將成骨細(xì)胞與CGRP、CGRP拮抗劑分別孵育，時(shí)間到達(dá)后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CGRP處理組核因子κB配體受體活化劑(RANKL)的表達(dá)呈劑量依賴性下調(diào)，通過(guò)加入CGRP拮抗劑可以逆轉(zhuǎn)該趨勢(shì)。同樣Yu等[29]的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CGRP處理組小鼠在2周時(shí)就可檢測(cè)到 ALP、BSP和RUNX2 等的表達(dá)上調(diào)。OPG/RANKL比值亦上調(diào)，從而較對(duì)照組觀察到更多的礦化結(jié)節(jié)。除此之外，Wu等[30]發(fā)現(xiàn)了CGRP可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中環(huán)狀RNA(circRNAs)mm9_circ_009056表達(dá)的上升以及miR-22-3p的表達(dá)減少，進(jìn)而通過(guò)BMPs/Smad 及Wnt/β-Catenin途徑提高BMP7、RUNX2的基因和蛋白質(zhì)水平來(lái)加強(qiáng)成骨，抑制破骨，即CGRP表達(dá)上調(diào)可明顯提高成骨細(xì)胞的成骨能力。也有研究證實(shí)CGRP可通過(guò)增強(qiáng)了 BMP2 表達(dá)水平促進(jìn)成骨[31]。

CGRP還可促進(jìn)成骨細(xì)胞自噬[32]，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)雙層囊泡結(jié)構(gòu)的自噬小體吞噬細(xì)胞自身蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，實(shí)現(xiàn)成骨細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞更新，是促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化的重要調(diào)控機(jī)制[33]。一方面成骨細(xì)胞自噬可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制OPG / RANKL信號(hào)通路進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞生成。另一方面通過(guò)自噬囊泡運(yùn)輸磷灰石晶體促進(jìn)局部成骨[34]。

CGRP在OTM微環(huán)境中可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及成骨，抑制破骨細(xì)胞形成逐漸成為了研究者們的的共識(shí)。

3 CGRP促進(jìn)OTM微環(huán)境中微血管擴(kuò)張和再生

CGRP受體廣泛分布于OTM微血管系統(tǒng)中，始終表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)及血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells， VEC), CGRP與微血管中的受體結(jié)合，不僅可擴(kuò)張微血管，也同時(shí)促進(jìn)了微血管再生。

研究顯示，CGRP作為血管擴(kuò)張劑，是前列腺素的10倍以上[35]。CGRP可以通過(guò)2種方式介導(dǎo)這種反應(yīng)：①直接激活其在VSMC的受體并通過(guò)Gs-AC-cAMP-PKA通路使K+外流，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低來(lái)介導(dǎo)舒張;②直接激活其在VEC的受體并通過(guò)Gs-AC-cAMP-PKA通路以增強(qiáng)NO的產(chǎn)生，NO可以擴(kuò)散到血管平滑肌中，通過(guò)Gc激活介使K+外流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低來(lái)介導(dǎo)舒張[36-37]。VSMC和VEC具有獨(dú)立但互補(bǔ)的作用，共同對(duì)微循環(huán)中血管的擴(kuò)張起促進(jìn)作用。

Mi等[38]構(gòu)建了大鼠牽張成骨模型，在牽張階段結(jié)束時(shí)，CGRP組內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的比例和牙槽骨缺損中的毛細(xì)血管密度顯著上升。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CGRP通過(guò)激活PI3K / AKT信號(hào)通路使BMSCs向 EPCs分化。此外，分化的EPCs迅速組裝成管狀結(jié)構(gòu)并促進(jìn)BMSC的成骨分化。Guo等[39]用鏈球菌素構(gòu)建出了糖尿病大鼠模型并在其頭骨植入鈦，CGRP組同對(duì)照組及假實(shí)驗(yàn)組相比VEGF的mRNA表達(dá)上升。后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CGRP在Y397位點(diǎn)促進(jìn)了局灶性粘附激酶(focal adhesion kinase, FAK)升高，通過(guò)CGRP-FAK-VEGF信號(hào)軸導(dǎo)致VEGF的表達(dá)變化[40]。 VEGF被認(rèn)為可以強(qiáng)效地促進(jìn)VEC的增殖分化以誘導(dǎo)促進(jìn)新血管的形成。關(guān)于OTM張力側(cè)微環(huán)境中血管的改建是否符合這一規(guī)律尚未有學(xué)者進(jìn)行研究，對(duì)此需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

隨著新血管生成，OTM微環(huán)境中血供增加，骨及神經(jīng)改建過(guò)程中所需的O2及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得以滿足，過(guò)程中產(chǎn)生的CO2及其他代謝產(chǎn)物得以排出，對(duì)OTM造成的局部微環(huán)境改建產(chǎn)生推進(jìn)作用。

4 CGRP對(duì)OTM微環(huán)境神經(jīng)改建的作用

CGRP是外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)再生中不可或缺的組成部分，軸突再生與其密切相關(guān)。Wang等[6]構(gòu)建的大鼠OTM模型中，TG中有1 279個(gè)差異表達(dá)基因，包括 Atf3、Adcyap1、Bdnf 和 Csf1 的上調(diào)以及 Scn10a、Kcna2、Kcnj10 和 P2ry1 的下調(diào)，產(chǎn)生類似于神經(jīng)損傷的轉(zhuǎn)錄組變化，不僅在 TRPV1 陽(yáng)性神經(jīng)元中，而且在整個(gè) TRPV1 陰性神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞中啟動(dòng)正畸力作用后軸突損傷的主動(dòng)再生程序。

Gomez-Sanchez等[41]提出了髓鞘吞噬(myelin phagocytosis)的概念，OTM微環(huán)境中CGRP表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子c-Jun上調(diào)啟動(dòng)MAPK信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)有髓鞘的和無(wú)髓鞘的施萬(wàn)細(xì)胞(Schwann cell,SC)脫分化為有助于髓鞘清除的細(xì)胞，便于巨噬細(xì)胞(macrophages，ME)侵襲和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。Chung等[13]在上述研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步提出，SC也會(huì)在Notch和JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下分脫分化，以促進(jìn)髓鞘碎片形成。從近端開(kāi)始，SC沿著軌道生長(zhǎng)，以軸突生長(zhǎng)。SC的髓鞘吞噬會(huì)反過(guò)來(lái)造成CGRP的上調(diào)形成神經(jīng)再生的正反饋。除此以外，這種高度協(xié)調(diào)的運(yùn)動(dòng)是由成纖維細(xì)胞通過(guò)EphrinB/EphB2信號(hào)傳導(dǎo)部分控制的，這限制了SC的自我排斥行為，從而允許足夠的粘附發(fā)生遷移。

5 CGRP對(duì)OTM微環(huán)境膠原改建的作用

上世紀(jì)末，CGRP已被證明可以激活MAPK，MAPK磷酸化后通過(guò)PKA依賴性和非依賴性途徑促進(jìn)PDLSCs向成纖維細(xì)胞的分化[42]，增殖分化而來(lái)的成纖維細(xì)胞不斷地在OTM微環(huán)境中合成膠原纖維。 Feng等[43]構(gòu)建的大鼠OTM模型中壓力側(cè)PDLSCs的I型膠原(type Ⅰ collagen ，Col-Ⅰ)表達(dá)受到抑制，壓力消除后表達(dá)恢復(fù)。該過(guò)程通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)來(lái)調(diào)節(jié)，阻斷TGF-β抑制PDLSCs中已恢復(fù)的Ⅰ型膠原Col-Ⅰ表達(dá)，可以抑制早期復(fù)發(fā)，即PDLSCs通過(guò)TGF-β/ Smad通路調(diào)控OTM微環(huán)境中的膠原重塑。

6 總結(jié)及展望

基于目前研究證據(jù)，CGRP對(duì)微環(huán)境的可能作用機(jī)制如下：①招募BMSCs至OTM微環(huán)境中并通過(guò)Wnt/β-Catenin、Hippo信號(hào)通路等促進(jìn)BMSCs成骨分化，通過(guò)PI3K / AKT信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs 成血管分化；②通過(guò)mTOR及Wnt /β-Catenin、MAPK、Notch1信號(hào)通路促進(jìn)PDLSCs成骨分化，通過(guò)MAPK、TGF-β/ Smad信號(hào)通路促進(jìn)PDLSCs成纖維分化，通過(guò)mTOR信號(hào)通路促進(jìn)PDLSCs成血管分化；③通過(guò)OPG / RANKL， BMPs/Smad 及Wnt/β-Catenin通路抑制破骨分化；④通過(guò)成骨細(xì)胞自噬促進(jìn)成骨分化及局部成骨；⑤通過(guò)PKA途徑擴(kuò)張微血管，通過(guò)CGRP-FAK-VEGF信號(hào)軸上調(diào)VEGF促進(jìn)微血管增殖；⑥通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)SC的髓鞘吞噬促進(jìn)軸突伸長(zhǎng)。

目前對(duì)于CGRP調(diào)控OTM微環(huán)境改建具體機(jī)制的研究仍然較少，CGRP在OTM中如何控制局部微環(huán)境的組織改建以及其中神經(jīng)、血管、膠原及牙槽骨等組織的改建之間如何建立聯(lián)系尚待進(jìn)一步研究。