劉凌云 毛 涵 黃培露 陳書樂

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰外科，廣西桂林 541001

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一種高度惡性膽道腫瘤，預(yù)后極差[1-2]，其發(fā)病機(jī)制涉及基因突變、信號通路失調(diào)及表觀遺傳改變等多個(gè)方面[3-4]。深入研究ICC 信號通路的功能及機(jī)制，有利于揭示其疾病進(jìn)展機(jī)制。叉頭盒蛋白M1（FoxM1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子[5]，在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)并可促進(jìn)腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移[6-7]。筆者前期研究也證實(shí)FoxM1 促進(jìn)ICC 增殖及侵襲[8]，然而，F(xiàn)oxM1 表達(dá)變化對ICC 增殖及侵襲相關(guān)通路的影響及機(jī)制尚未清楚。

基因芯片RNA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)挖掘是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）能在RNA 水平層次挖掘影響相關(guān)疾病的基因信號通路，從而為具體基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供直接證據(jù)[9]。

本研究先通過GSEA 分析尋找ICC 中FoxM1 mRNA 高、低表達(dá)組之間可能存在的差異表達(dá)基因及相關(guān)信號通路，再在前期相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)建立的FoxM1高、低表達(dá)ICC 細(xì)胞系中[8]驗(yàn)證相關(guān)重要信號通路，從而初步證實(shí)其是否參與了FoxM1 調(diào)控ICC 增殖及侵襲等惡性表型。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集、篩選及GSEA 分析

從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（https：//cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載36 例ICC 患者的mRNA 數(shù)據(jù)（格式為Htseq-Counts）。通 過gencode（https：//www.gencodegenes.org/）數(shù) 據(jù) 庫的文件將基因ID 注釋為基因名。按照總體FoxM1 表達(dá)值中位數(shù)分為FoxM1 高表達(dá)組和低表達(dá)組并制作成表型數(shù)據(jù)文件（cls 格式，分組為FoxM1 high 和FoxM1 low），將mRNA 數(shù)據(jù)制作成與表型數(shù)據(jù)相對應(yīng)的基因表達(dá)譜文件（gct 格式，矩陣形式）。隨后，使用GSEA（http：//software.broadinstitute.org/gsea/ index.jsp）官網(wǎng)提供的基于JAVA 環(huán)境的GSEA 軟件（version3.0）分析比較FoxM1 不同表達(dá)組之間可能存在的差異表達(dá)基因及信號通路[10-11]。在GSEA 分析中使用GSEA官方提供的Molecular Signature Database（MsigDB）作為通路注釋源（同時(shí)包含KEGG 和REACTOME 等常見通路注釋數(shù)據(jù)）。通過1 000 次循環(huán)的排列組合尋找顯著富集信號通路。

1.2 Rt-PCR 檢測ICC 細(xì)胞系中FoxM1 及P53 mRNA的表達(dá)

一般材料：人ICC 細(xì)胞株HCCC-9810 和SSP-25（均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；RPMI1640 培養(yǎng)基（Life Technologies）；胎牛血清（Life Technologies）；LV-FoxM1-RNAi、FoxM1 過表達(dá)慢病毒及轉(zhuǎn)染試劑（中國吉?jiǎng)P基因公司）；RT-PCR 使用SYBR（Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus）（貨號：RR820A，日本TaKaRa 公司）；FoxM1 及P53 兔抗人多克隆抗體（Abcam）；GAPDH抗體（北京博奧森生物有限公司）。

方法：慢病毒分別轉(zhuǎn)染HCCC-9810 和SSP-25細(xì)胞（按照試劑盒說明書操作，上調(diào)FoxM1 為HCCC-9810-FoxM1 組、下調(diào)FoxM1 為SSP-25-shFoxM1 組），穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功后收集HCCC-9810-FoxM1 組、SSP-25-shFoxM1 組和各自對照組對數(shù)生長期細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，按照說明書合成cDNA 及后續(xù)操作。使用NCBI 在線Primer Blast 工具設(shè)計(jì)引物，反應(yīng)體系中引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FoxM1 表達(dá)對ICC 信號通路影響的GSEA 分析結(jié)果

GSEA 分析發(fā)現(xiàn)，ICC 中FoxM1 不同表達(dá)時(shí)常見基因信號通路如P53、MYC 信號通路表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均FDR-q 值＜0.250）。GSEA 基因信號通路富集分析結(jié)果情況見表2，主要有P53、ATM、ATR 和E2F 信號通路等。

2.2 GSEA 分析FoxM1 表達(dá)對P53 信號通路的影響

本研究重點(diǎn)選擇分析了P53 信號通路的GSEA情況，結(jié)果顯示FoxM1 高表達(dá)時(shí)KEGG_P53_SIGNALING_PATHWAY（圖1A）和PID_P53_DOWN STREAM_ PATHWAY（圖1B）及PID_P53_REGULATION_PATHWAY（圖1C）富集值更高，F(xiàn)DR-q值均＜0.250。

2.3 ICC 細(xì)胞系中驗(yàn)證FoxM1 表達(dá)變化影響P53 信號

RT-PCR 結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染后上調(diào)FoxM1 表達(dá)的HCCC-9810-FoxM1 細(xì)胞組中P53 mRNA 表達(dá)較對照組明顯升高，而下調(diào)FoxM1 表達(dá)的SSP-25-shFoxM1 細(xì)胞組中P53 mRNA 水平較對照組則顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.0 001）。見圖2。

3 討論

ICC 發(fā)生發(fā)展伴隨多個(gè)細(xì)胞信號通路的異常改變，包括EGFR、c-MET、WNT 和AKT/PI3K 信號通路等[3]。P53 基因突變是人類腫瘤中最常見的遺傳學(xué)改變之一[12]，突變后P53 基因由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?，P53 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與眾多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[13-15]。目前P53 通路在ICC 中作用尚不十分明確，需要進(jìn)一步探索。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1 調(diào)控相關(guān)通路在多種實(shí)體瘤中發(fā)揮重要作用[16-17]。FoxM1 在Ras 信號驅(qū)動(dòng)的HCC 進(jìn)展過程中起到關(guān)鍵作用[18]。FoxM1 還作為關(guān)鍵的下游效應(yīng)子，調(diào)控MET 信號通路從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞DNA損傷[19]。FoxM1 與β-catenin 或SMAD3 作用，分別介導(dǎo)致癌基因WNT 及TGF-β 信號通路激活，從而扮演促癌蛋白的角色[20]。而P53 和FoxM1 之間關(guān)系已有相關(guān)報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)P53 介導(dǎo)FoxM1 抑制對維持穩(wěn)定的細(xì)胞G2周期阻滯具有潛在價(jià)值，由此認(rèn)為促增殖FoxM1 是P53 介導(dǎo)抑制的靶標(biāo)[21]。研究表明，乳腺癌P53 野生型通過抑制FoxM1 轉(zhuǎn)錄來抑制MELK 表達(dá)，而突變型乳腺癌中MELK 表達(dá)明顯升高，從而表明突變型P53 通過釋放FoxM1 的野生型P53 依賴性抑制來誘導(dǎo)MELK 表達(dá)增加[22]。另有研究報(bào)道，功能獲得性突變體P53 通過靶向FoxM1 促進(jìn)頭頸部鱗癌的致癌潛能[23]。FoxM1 能促進(jìn)ICC 增殖及侵襲，但FoxM1 如何調(diào)控ICC 細(xì)胞惡性表型，與ICC 中P53 通路關(guān)系如何均不明確，尚需進(jìn)一步闡明。

本研究首先使用GSEA 分析FoxM1 表達(dá)與ICC相關(guān)信號通路之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICC 中FoxM1 高低表達(dá)情況下，較多基因信號通路如P53、MYC 信號通路表達(dá)有顯著差異性，而這些通路與ICC 增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示FoxM1 可能在ICC 發(fā)生發(fā)展等不同演進(jìn)階段產(chǎn)生廣泛作用。另外，基于P53 信號在惡性腫瘤中的廣泛而重要作用[13,24-25]，本研究重點(diǎn)分析并發(fā)現(xiàn)了ICC 中FoxM1 表達(dá)變化與P53 信號密切相關(guān)。接下來，RT-PCR 證實(shí)上調(diào)FoxM1 表達(dá)則P53 mRNA 表達(dá)升高，而下調(diào)FoxM1 則P53 mRNA 表達(dá)下降，提示FoxM1 高表達(dá)可能增強(qiáng)ICC 中P53 信號通路活性，也可以反向推測，可能由于ICC 中P53 基因突變增加，P53 蛋白和mRNA 產(chǎn)物增加、從而P53信號調(diào)控FoxM1 表達(dá)上升，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。ICC 中P53 突變及類型、與FoxM1 相互作用及其上下游機(jī)制研究可能是未來具有前景的研究方向。

綜上，本研究初步闡明了FoxM1 在ICC 中過表達(dá)可明顯影響ICC 增殖及侵襲相關(guān)信號通路，尤其是P53 通路。結(jié)果表明FoxM1 促進(jìn)ICC 進(jìn)展可能部分通過P53 信號通路起作用，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究為揭示ICC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步佐證FoxM1 成為ICC 新的生物標(biāo)志物及治療新靶點(diǎn)提供了新依據(jù)。