張翰鈺 李敬東

1.河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453100；2.河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，河南新鄉(xiāng) 453100

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），占全球成人NHL 的近30%[1]。該疾病發(fā)病年齡為60～70 歲，男性高于女性。DLBCL是一種在臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)、治療反應(yīng)及預(yù)后等方面有很大異質(zhì)性的侵襲性腫瘤[2]。目前診斷淋巴瘤的主要依據(jù)是病理組織活檢，基于組織病理學(xué)、基因表達(dá)和圖像評(píng)估指導(dǎo)臨床治療，對(duì)于DLBCL 治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)，臨床上常用的方法主要為觀察患者淋巴結(jié)或淋巴器官腫塊消退的情況、影像學(xué)表現(xiàn)及臨床癥狀的改善，到目前為止仍無(wú)有效、精確、動(dòng)態(tài)的評(píng)估方法。所以床上亟待一種新的、無(wú)創(chuàng)、高效、更易獲得的技術(shù)手段用于其診斷和預(yù)后評(píng)估。隨著高通量測(cè)序平臺(tái)的出現(xiàn)及生物信息學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)鑒定出約有2 100 種不同的MicroRNA（miRNA），其中約有300 種在各種細(xì)胞類型中表達(dá)。研究顯示，miRNA 表達(dá)譜可以區(qū)分淋巴瘤組織和正常淋巴結(jié)，并且在不同亞型中表達(dá)程度不同[3]。探索miRNA 在淋巴損傷中的作用將有助于發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后和反應(yīng)監(jiān)測(cè)生物標(biāo)志物，越來(lái)越多的miRNA被用于惡性腫瘤檢測(cè)指標(biāo)的候選者[4]。隨著對(duì)miRNA的深入研究，其在DLBCL 中的作用逐漸被揭露本文就循環(huán)中miRNA 在DLBCL 診療中應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行描述。

1 miRNA 與DLBCL 的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）

1983 年，Pan 和Johnstone 在研究綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體釋放到細(xì)胞外空間與一種小囊泡有關(guān)，首次發(fā)現(xiàn)了外泌體[5]的存在。研究結(jié)果提示在正常的生理過(guò)程和疾病的發(fā)生機(jī)制中，外泌體均在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮了重要的作用[6]。其中外泌體中蛋白、RNA 和脂肪成分特異，且攜帶了一些重要的信號(hào)分子，有望在疾病早期診斷中發(fā)揮作用，大量文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA 是外泌體最為核心的效應(yīng)分子[7]。

miRNA 是一類內(nèi)生的、分布廣泛、長(zhǎng)度為20～24 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA（non-coding RNA），是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的70～90 個(gè)堿基大小的單鏈RNA 前體經(jīng)過(guò)Dicer 酶加工后生成，不同于siRNA 但是和siRNA密切相關(guān)，可以與目的信使RNA 的3’-UTR 結(jié)合沉默基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響它的表達(dá)。miRNA 參與調(diào)節(jié)多中生物信號(hào)傳導(dǎo)通路，可調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因[8]。已有研究證實(shí)miRNA 參與多種重要的生物程序如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、疾病的發(fā)生與發(fā)展，調(diào)控造血系統(tǒng)及導(dǎo)致血液惡性腫瘤的發(fā)生[9]。

B 細(xì)胞淋巴瘤是由成熟B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，主要發(fā)生在淋巴結(jié)或淋巴系統(tǒng)的其他部位，可以發(fā)生在正常B 細(xì)胞分化的不同階段。Arthur 等[10]指出在淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)基因改變通常與B 細(xì)胞發(fā)育和/或分化的途徑相關(guān)，所以B 細(xì)胞分化過(guò)程似乎容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。除了基因的改變外，表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，尤其是miRNA，在B 細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用，同時(shí)也參與了B 淋巴細(xì)胞的形成。

miRNA 在B 細(xì)胞惡性腫瘤中表達(dá)的相關(guān)性首次在慢性淋巴細(xì)胞白血病中（chronic lymphocytic leukemia，CLL）發(fā)現(xiàn)，為miRNA 在癌癥發(fā)病機(jī)制中的突出和復(fù)雜作用提供了一個(gè)模型，特別是在B 細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病機(jī)制中。DLBCL 主要內(nèi)在致癌途徑與異常的c-MYC和NF-κB 活性有關(guān)，研究證實(shí)DLBCL 患者中存在多種miRNA 的異常表達(dá)，miRNA 的失調(diào)間接抑制某些基因的表達(dá)從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生，其中最常見(jiàn)的是miR-155。近年來(lái)，科研工作者對(duì)其參與疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后展開(kāi)了如火如荼的研究。Zhu 等[11]發(fā)現(xiàn)與臨近組織比較，淋巴瘤組織中miR-155 表達(dá)水平更高，miR-155 下調(diào)抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（細(xì)胞周期相關(guān)蛋白B1、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白D1、CDK4）的表達(dá)，但增加了凋亡相關(guān)蛋白水平（Bax/Bcl-2 和cas pase3 活性）和抑制炎癥因子的分泌。此外，還觀察到miR-155 水平與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 受體2（transforming growth factor-β receptor 2，TGF-βR2）水平呈負(fù)相關(guān)，TGF-βR2 已被證明是一種新型腫瘤抑制基因[12]。Janus 激酶（JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡，并與淋巴瘤有關(guān)。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（suppressors-of-cytokine-signaling 3，SOCS3）是JAK-STAT 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子，生物信息學(xué)分析顯示，miR155 和SOCS3 存在互補(bǔ)位點(diǎn)。研究顯示miR-155-5p 通過(guò)SOCS3/JAK-STAT3 信號(hào)[13]和靶向SMAD5 促進(jìn)細(xì)胞增殖和阻斷凋亡，從而逃避TGF-β1 的生長(zhǎng)抑制作用[14]。Li 等[13]通過(guò)對(duì)DLBCL 及反應(yīng)性淋巴結(jié)增生患者的研究發(fā)現(xiàn)DLBCL 組織中miR-155 表達(dá)顯著增加，而SOCS3 水平下降，并在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明miR-155 可以靶向調(diào)節(jié)SOCS3的表達(dá)從而調(diào)控JAK-STAT 信號(hào)通路從而調(diào)控DLBCL 疾病的發(fā)生發(fā)展。Zheng 等[15]發(fā)現(xiàn)miR-155 可作為B 細(xì)胞淋巴瘤的致癌標(biāo)志物，與疾病發(fā)生呈正相關(guān)，并且與T 細(xì)胞受體傳導(dǎo)、細(xì)胞周期及p53 信號(hào)傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。并進(jìn)行體內(nèi)外檢查發(fā)現(xiàn)B 淋巴瘤細(xì)胞來(lái)源的miR-155 特異性調(diào)節(jié)Fas 介導(dǎo)的CD8+T 細(xì)胞的凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞之間通過(guò)miR-155-PD-L1 調(diào)節(jié)軸的功能相互作用，導(dǎo)致B 淋巴瘤對(duì)抗PD-L1 抗體敏感，提示miR-155 是B 細(xì)胞淋巴瘤的抗PD-L1 抗體治療的潛在靶點(diǎn)。

隨著對(duì)miRNA 研究的深入及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的miRNA 在TME 被發(fā)現(xiàn)。Xu 等[16]通過(guò)挖掘RNA-seq 數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析，并行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-340-5p 與DLBCL 患者CD8+腫瘤浸潤(rùn)性T 細(xì)胞（tumor-infiltrating T cells，T-TILs）呈正相關(guān)，KMT5A 是miR-340-5p 的直接靶基因，同時(shí)也證實(shí)了miR-340-5p 通過(guò)調(diào)節(jié)KMT5A 和COP1 并進(jìn)一步激活CD73 泛素化來(lái)促進(jìn)CD8+T-TIL 浸潤(rùn)和抗腫瘤功能。同樣的，李敬東等[17]通過(guò)對(duì)SU-DHL-4 細(xì)胞進(jìn)行研究證實(shí)了miR-34b-5p 過(guò)表達(dá)導(dǎo)致E-cadherin 基因和蛋白的表達(dá)水平升高，而N-cadherin 和Vimentin基因的蛋白表達(dá)水平降低，以至抑制SU-DHL-4 細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)miR-34b-5p 過(guò)表達(dá)抑制RhoA/ROCK 信號(hào)通路。證實(shí)了TME 中的CD8+T-TILs 在腫瘤發(fā)展中的重要作用。

miR-21 在多種腫瘤中的表達(dá)顯著升高及其在TME 中顯示出調(diào)節(jié)潛力，其主要作為一種腫瘤抑制因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)作用[18]。相關(guān)研究顯示，ABT-199 是一種特異性Bcl-2抑制劑，靶向Bcl-2 的BH3 結(jié)合域，并在治療B 細(xì)胞淋巴瘤方面顯示出令人鼓舞的臨床前結(jié)果[19]。Zheng等[20]在探索miR-21 在TME 中作用時(shí)證實(shí)了miR-21作為DLBCL 的血清致癌生物標(biāo)志物，而且發(fā)現(xiàn)mi-R21 通過(guò)ICOS/ICOSL 軸增加了Treg 細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用并刺激了腫瘤血管生成。

2 miRNA 與DLBCL 治療新靶點(diǎn)的探索

2.1 miR-155 在DLBCL 診療中的應(yīng)用

對(duì)于DLBCL 的治療，R-CHOP 方案已成為新診斷DLBCL 患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但仍有一部分患有難治性或復(fù)發(fā)性疾病的治療效果欠佳，促使科研工作者們努力探索治療DLBCL 的新靶點(diǎn)[21]。Cobomarsen 是一種單鏈、化學(xué)修飾的miR-155 靶向寡核苷酸，是一種基于LNA（一種類寡核苷酸衍生物）的抗miR-155化合物，基于這些結(jié)果，對(duì)于cobomarsen 的治療作用開(kāi)展多種臨床試驗(yàn)[22]。Anastasiadou 等[23]研究了cobomarsen 在具有高miR-155 表達(dá)的ABC-DLBCL 細(xì)胞系和異種移植小鼠模型中的功效和藥效學(xué)活性，并且評(píng)估其在侵襲性DLBCL 患者中的治療效果和安全性的研究中發(fā)現(xiàn)cobomarsen 可以與其靶標(biāo)結(jié)合并抑制其作用于miR-155 生物傳感器的互補(bǔ)序列，可以被遞送并在細(xì)胞內(nèi)具有活性，并且可以抑制miR-155導(dǎo)致DLBCL 細(xì)胞增殖減少和凋亡增加。在異種移植小鼠模型中還觀察到了靜脈注射cobomarsen 可減少腫瘤體積、觸發(fā)細(xì)胞凋亡并抑制miR-155 靶基因表達(dá)。同時(shí)在診斷為侵襲性ABC-DLBCL 患者治療中觀察到其安全性，不足的是該研究只在1 例患者身上評(píng)估了安全性。Huang 等[24]也在探索胃DLBCL 的治療新方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-155-DEPTOR 通路的激活是對(duì)幽門螺桿菌治療耐藥的標(biāo)志物。雖然上述研究各有局限性，對(duì)但仍為DLBCL 的治療提供了新的思路。

2.2 miR-28 在DLBCL 診療中的應(yīng)用

許多miRNA 位于癌癥相關(guān)基因組區(qū)域并且失調(diào)的miRNA 作為致癌基因?qū)Χ喾N惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，這些特征為DLBCL 的治療新的靶點(diǎn)的研究提供思路。miR-28 是一種在B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中經(jīng)常丟失的生發(fā)中心（germinal center，GC）特異性miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-28 通過(guò)損害記憶B 細(xì)胞和漿細(xì)胞分化來(lái)調(diào)節(jié)原代B 細(xì)胞中的GC 反應(yīng)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析確定了參與細(xì)胞周期和B 細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)的miR-28 靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)miR-28 表達(dá)減少了體外原代細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的增殖尤其是在DLBCL異種移植物中的重新表達(dá)阻止了腫瘤生長(zhǎng)[25]。近年來(lái)，miRNA 在癌癥發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用使其成為非常有前景的治療靶點(diǎn)選擇[26]。使用合成模擬物阻斷DLBCL 生長(zhǎng)被認(rèn)為是治療性miRNA 引入的最安全的途徑，相關(guān)實(shí)驗(yàn)從治療角度和毒性分析上驗(yàn)證了miR-28 的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目前治療B 細(xì)胞淋巴瘤的治療策略，因此miR-28 替代可作為DLBCL 治療的新策略[25]。

2.3 miR-198 在DLBCL 診療中的應(yīng)用

硼替佐米（Bortezomib，BTZ）是一種蛋白酶體抑制劑，已在美國(guó)和歐洲國(guó)家被批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的治療，隨著對(duì)BTZ 研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)揭示了BTZ 可以抑制活化的B細(xì)胞型淋巴瘤的進(jìn)展。為探索BTZ 在調(diào)節(jié)DLBCL 細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在分子機(jī)制，Wang 等[27]監(jiān)測(cè)到BZT 影響DLBCL 細(xì)胞系CRL-2630 的生長(zhǎng)并且上調(diào)了該細(xì)胞系中miR-198 的表達(dá)。同時(shí)使用信息生物學(xué)工具預(yù)測(cè)miR-198 結(jié)合高遷移率組AT-hook1（high mobility group AT-hook1，HMGA1）的3’-非翻譯區(qū)并抑制DLBCL 細(xì)胞中HMGA1 的表達(dá)。與BZT 誘導(dǎo)的miR-198 過(guò)表達(dá)一致，BTZ 抑制了DLBCL 細(xì)胞中HMAG1的豐度，HMGA1 的過(guò)表達(dá)減弱了BTZ 誘導(dǎo)的DLBCL細(xì)胞系的凋亡，為DLBCL 的治療提供新的研究思路。但目前關(guān)于miR-198 在DLBCL 中的更多作用未被發(fā)現(xiàn)，仍需要進(jìn)一步探索。

3 miRNA 與DLBCL 預(yù)后評(píng)估中的作用

盡管標(biāo)準(zhǔn)R-CHOP 化療可明顯改善DLBCL 的臨床結(jié)果，但對(duì)于復(fù)發(fā)或難治性患者的預(yù)后較差[28]。分子異質(zhì)性導(dǎo)致DLBCL 的多種結(jié)果，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)和存活率對(duì)于實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)適應(yīng)治療策略至關(guān)重要[29-30]，因此，使用易得的循環(huán)預(yù)后生物標(biāo)志物識(shí)別高危患者在DLBCL 中非常重要。Sun 等[31]使用miRNA PCR 陣列分析了20 例DLBCL 患者在診斷、緩解和復(fù)發(fā)時(shí)血清樣本中的miRNA 表達(dá)譜，建立了基于四種循環(huán)miRNA（miR-21、miR-130b、miR-155 和miR-28）的預(yù)后模型，并在279 例患者的訓(xùn)練隊(duì)列和225 例患者的驗(yàn)證隊(duì)列中進(jìn)行了測(cè)試，通過(guò)單變量和多變量分析評(píng)估顯示4 種循環(huán)miRNA 預(yù)后模型有效地預(yù)測(cè)了DLBCL的復(fù)發(fā)和存活，此外TME 有助于其在DLBCL 進(jìn)展中的作用。同樣的，對(duì)于不同亞型DLBCL 患者預(yù)后的探索發(fā)現(xiàn)miR-208a-5p 和miR-296-5p 顯示與患者更好的生存相關(guān)，而miR-1304-5p 過(guò)表達(dá)提示生存預(yù)后較差，與DLBCL 亞型無(wú)關(guān)[32]。

最近，在一項(xiàng)DLBCL 患者血清中miRNA 譜的初步研究中發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-22 與DLBCL 的治療反應(yīng)有關(guān)，是作為其他獨(dú)立于公認(rèn)預(yù)后因素（IPI、來(lái)源細(xì)胞、MYC/BCL2 易位）的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物[33]。在一項(xiàng)探討血漿中miR-155 對(duì)DLBCL 患者預(yù)后的評(píng)估的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-155 的相對(duì)表達(dá)水平與B 癥狀、LDH 水平、疾病晚期、IPI 評(píng)分密切相關(guān)，更重要的是miR-155水平升高的患者的總生存期（overall survival，OS）較短[34]。綜上，多種miRNA 聯(lián)合用于DLBCL 預(yù)后的評(píng)估將是一種更有效的診斷工具。

4 小結(jié)與展望

隨著生物信息學(xué)和高通量測(cè)序平臺(tái)的發(fā)展，對(duì)miRNA 在DLBCL 疾病的發(fā)生機(jī)制、良惡性診斷及鑒別、臨床治療新方法的選擇及預(yù)后中的作用有了更深的認(rèn)識(shí)，將會(huì)有更多的研究成果有望指導(dǎo)臨床工作，提高患者的生存質(zhì)量。但多種miRNA 在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，缺少特異性，miRNA 在DLBCL 患者中聯(lián)合應(yīng)用或許對(duì)疾病診治中的作用更準(zhǔn)確。同時(shí)開(kāi)發(fā)和廣泛驗(yàn)證能夠準(zhǔn)確提取和重復(fù)測(cè)量與DLBCL 相關(guān)的miRNA 的新方法，將循環(huán)標(biāo)志物、臨床參數(shù)結(jié)合起來(lái)，疾病的診治將會(huì)更受益于患者。但是目前對(duì)于miRNA 的研究尚未應(yīng)用于臨床，進(jìn)一步的探索及開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)的miRNA 試劑盒將有助于基礎(chǔ)研究與臨床研究相結(jié)合。