●高 珊（遼源市農業(yè)科學院 吉林 遼源 136200）

近年來，越來越多的新技術被應用在農作物遺傳改良種，這些技術推動了新品種的研發(fā)，加快了品種改良的進程，同時提高了改良的目的性?；蚓庉嬀褪瞧渲袘们熬白顬閺V泛的技術之一，是通過序列特異性核酸酶進行精確定位，對目的基因片段進行插入或剪切新基因片段使基因沉默或同源重組，從而讓目的性狀得到表達。

1 基因編輯技術

1.1 鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）

該項技術是第1代基因組編輯技術。每個ZFN單體都是由FokⅠ核酸內切酶的剪切結構域融合鋅指蛋白結構域而成。鋅指蛋白決定鋅指核酸酶的特異性。

1.2 轉錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）

這項技術已逐步替代ZFN技術，TALEN能特異性識別靶標DNA序列，具有較強的設計性，比ZFN技術具有更好的應用潛力。

1.3 規(guī)律性重復短回文序列簇（CRISPR/Cas）

規(guī)律性重復短回文序列簇（CRISPR/Cas）系統是古細菌和細菌在抵御外來病毒和質粒過程中產生的特異性免疫系統。CRISPR/Cas系統的基因座由反式激活RNA基因、Cas家族蛋白和CRISPR序列3部分組成。因其具有簡單、快速、高效等特點，已被應用于艾滋病、阿爾茲海默病等疾病的治療中。

鋅指核酸酶系統由可以特異性識別DNA雙鏈的鋅指結構域和FokⅠ核酸酶結構域兩部分構成，因其核酸酶設計復雜、特異性較差、易脫靶逐漸被取代。

轉錄激活因子樣效應物核酸酶系統是由TALEN效應蛋白的DNA結合域和FokⅠ核酸酶結構域兩部分組成，其特異性得到了一定的改善，但是由于所用載體太大，仍然沒有得到很好的應用。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列系統由CRISPR序列元件和Cas基因家族組成。

CRISPR/Cas系 統 有3種 類 型，TypeⅠ 和TypeⅢ系統存在于細菌和古細菌中，TypeⅡ系統僅存在于細菌中，其中Ⅱ型只需要1個Cas蛋白就可以完成對靶位點的切割，而Ⅰ型和Ⅲ型都需要多個Cas蛋白才能完成對靶標位點的切割。因此Ⅱ型系統已成為最常用的基因編輯系統。2013年Cong等[1]首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，對人類及小鼠細胞進行定點基因敲除。此后，該技術逐漸應用于果蠅、斑馬魚、擬南芥、水稻、小麥、玉米的體外培養(yǎng)細胞中。

2 CRISPR/Cas系統的工作機理

CRISPR/Cas工作機理可分為3個階段，主要是適應、表達和干擾，第一階段是新的間隔序列的獲得，第二階段是這些新獲得的間隔重復序列被轉錄為前體CRISPR RNA（Pre-crRNA）。然后在核酸內切酶的作用下形成成熟的crRNA[2-3]，第三階段是crRNA與tracrRNA的復合物在Cas蛋白的作用下切割外源DNA。

3 CRISPR/Cas9系統在作物育種中的應用

3.1 在水稻育種中的應用

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，并因其遺傳轉化更易操作，已成為重要的模式植物。因此，近年來利用CRISPR/Cas9技術對水稻品質、產量及抗性相關的研究被廣泛報道。Zhou等[4]應用CRISPR/Cas9系統讓水稻溫敏型雄性不育基因TMS5發(fā)生特異性突變，從而開發(fā)出11個無轉基因成分的改良TGMS品系，其具有巨大育種潛力。Shen等[5]應用CRISPR/Cas9系統編輯粒型基因GS3和穗粒數基因Gnla，導致基因突變失活，以此獲得粒長、穗粒數多的株系，但其產量顯著下降。Miao等[6]應用CRISPR/Cas9系統對水稻分蘗基因LAZY1進行編輯，使其發(fā)生雙等位變異，研究發(fā)現T1代轉基因幼苗的分蘗數量顯著增多。Wang等[7]通過應用CRISPR/Cas9技術編輯稻瘟病侵染效應因子基因OSERF922，使水稻抗稻瘟病能力增加。Wang等[8]利用CRISPR/Cas9技術編輯調控水稻產量千粒重的基因TGW6，實驗表明T1代純合缺失突變體千粒重明顯增加。Wang等[8]對秈稻應用CRISPR/Cas9技術進行定點突變發(fā)現，最終突變體水稻產量反著粒密度均增加。Wang等[9]利用 CRISPR/Cas9技術將稻瘟病感病品種“空育131”中的OsERF922 基因定向敲除，獲得的T2 純合突變系對稻瘟病菌的抗性較野生型明顯提高。

3.2 在玉米育種中的應用

玉米既是世界第一大糧食作物之一，同時也是化工、飼料等領域的原料。Liang等[10]率先建立了玉米的TALENs和CRISPR/Cas9基因定向編輯系統，并比較了TALENs和CRISPR/Cas9誘導ZmIpk同一位點的突變效率，結果發(fā)現在玉米原生質體中CRISPR/Cas9的誘導突變率較TALENs高4%。Svitashev等[11]利用CRISPR/Cas9技術敲除玉米的ALS2基因，獲得了抗磺胺脲成分除草劑的玉米植株。杜邦先鋒公司利用CRISPR/Cas9系統，將糯玉米性狀引入性狀優(yōu)良的雜交種中，從而解決了糯玉米地低產的問題。同時也避免了回交育種等繁瑣工作。美國杜邦先鋒公司將玉米ALS2編碼區(qū)的第165位脯氨酸利用CRISPR/Cas9技術突變成絲氨酸，得到抗氯磺隆的玉米突變體。

3.3 在小麥育種中的應用

小麥是異源多倍體植物，其基因組龐大。常規(guī)的雜交育種方法局限性較多，故新型的基因編輯技術更適合于小麥的研究。Zhang等[12]應用CRISPR/Cas9技術對調控小麥粒重、粒長的基因TaGASR7和穗密度基因TaDEP1進行定點編輯，研究結果表明，TaGASR7純合突變體粒重明顯增加，TaDEP1純合突變體明顯變短。Shan等[13]應用CRISPR/Cas9技術誘導面包小麥原生質體中MLO基因發(fā)生突變。Zheng等[14]利用CRISPR/Cas9獲得了可以同時敲出三個同源基因的對白粉病有較強抗性的突變體。Li等[15]編輯小麥的基因轉化其原生質體研究表明突變率達到28.5%。

4 展望

目前，全球已經有很多轉基因作物，大豆、玉米、棉花等已在多個國家廣泛種植，但轉基因作物的生物安全性問題一直受到關注。國際上對基因編輯作物是否屬于轉基因生物還沒有統一定論。目前，我國對基因編輯作物的監(jiān)督管理標準還沒有明確規(guī)定，因此需要盡快出臺相關的政策以規(guī)范基因編輯育種。

傳統的育種方法需要投入大量的人力和時間才能獲得星狀優(yōu)良的品種，而現在通過CRISPR/Cas9技術就可以直接有效地獲得優(yōu)良性狀品種，但CRISPR/Cas9技術存在一些技術方面的問題，如脫靶效應和如何構建通用載體等。雖然CRISPR/Cas9技術還有一些不足，但隨著科技的進步，相信其在未來轉基因研究中具有巨大潛力。