水蛭來源熒光假單胞菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

王淑嫻，許 拉，樊 英，王友紅，葉海斌，吳海一

(山東省海洋科學研究院 海洋食品與醫(yī)藥研究中心，山東 青島 266104)

水蛭，別名馬蛭、麻黃蜞、馬蟥等，屬于蛭綱，水蛭科動物，具有很高的藥用價值。水蛭分布于世界各地，共有300多種，在我國有100余種。其中寬體金線蛭、茶色蛭及日本醫(yī)蛭干燥的動物全體被《中華人民共和國藥典》認定為中藥藥材[1]。水蛭在我國分布范圍很廣，在內(nèi)陸淡水水域內(nèi)生長繁殖，棲息于水田、溝渠中，吸食人、畜血液，是中國傳統(tǒng)的特種藥用水生動物。其干制品具有止痛、活血通經(jīng)等功效，可用于治療產(chǎn)后腹痛、高血壓、中風偏癱、肝損傷、腎病綜合征等。另外活水蛭外用能吸血消腫，可用于治療癰腫、丹毒等證。近年來由于農(nóng)藥、化肥等濫用，加之養(yǎng)殖戶對水質(zhì)綜合調(diào)控的重視程度不夠，致使水蛭生活環(huán)境逐漸惡化，各類病害頻繁爆發(fā)，給水蛭養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。

2022年10月，山東某水蛭養(yǎng)殖場暴發(fā)病情，患病水蛭食欲不振，懶于活動，身體收縮，解剖可見內(nèi)臟中有氣泡。本研究從瀕死的患病水蛭體內(nèi)通過分離純化獲得一株優(yōu)勢菌株，并利用生理生化、分子生物學、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對該菌進行鑒定，旨在為生產(chǎn)中水蛭的疾病防治提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

TSA胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(購自青島海博生物有限公司)用于細菌培養(yǎng)；生理生化鑒定管(購自杭州微生物試劑有限公司)用于細菌的生理生化分析；細菌快速鑒定板(購自美國Biolog公司)用于Biolog鑒定；細菌DNA提取和PCR試劑盒(Takara)用于模板提取及擴增，其他化學試劑和引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)勢菌株分離純化 挑取患病的水蛭內(nèi)臟組織，在TSA培養(yǎng)基上劃線，28 ℃過夜培養(yǎng)，挑取優(yōu)勢菌落繼續(xù)轉(zhuǎn)接至純培養(yǎng)，置于超低溫冰箱(-80 ℃)中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌落形態(tài)及理化特性檢測 28 ℃下培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征；將細菌進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)；預先測定菌液濃度，將適量細菌接種于生理生化鑒定管中，過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

1.2.3 Biolog分析 將供試菌株接入GenIII 第三代鑒定板，96孔板分布有陽性、陰性對照以及71種碳源、23化學敏感物質(zhì)，培養(yǎng)24 h后通過Biolog微生物鑒定軟件對測試板上的“表型指紋”進行分析。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 利用廣譜型基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa)提取細菌DNA作為PCR反應模板。通用引物27F和1 492R作為16S rRNA 基因PCR擴增引物。50 μL PCR反應體系包含：DNA模板1 μL，引物( 10 μmol/L) 各2 μL，PremixTaqTM ( Ex TaqTM Version 2.0 plus dye) 25 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸l min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃溫育10 min。吸取6 μL的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，利用凝膠成像儀觀察。參考陸夢瑩等[2]的方法，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測序，測序結(jié)果登陸GenBank進行BLAST比對，使用MEGA 4.0軟件，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病水蛭優(yōu)勢菌的分離純化

從患病水蛭的病灶處，分離獲得一株大小、形態(tài)、顏色一致的優(yōu)勢菌，命名為SZ-1，該菌在TSA 平板上生長菌落形態(tài)為圓形、磚紅色、邊緣不光滑。革蘭氏染色鏡檢顯示，該菌為革蘭氏陰性菌，桿狀，兩端鈍圓，有極生鞭毛。

2.2 菌株SZ-1生理生化特征及Biolog分析

菌株SZ-1在生理生化管中的生長情況顯示：該菌能液化明膠，葡萄糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵均為陽性；甲基紅試驗、檸檬酸鹽發(fā)酵、接觸酶反應均為陽性；乙醇、L-鼠李糖利用為陰性；水解淀粉、脂酶反應陰性。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊( 第八版) 》[3]，各項指標經(jīng)對比，與假單胞菌屬相近。

通過Biolog GenIII第三代鑒定板檢測發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)鑒定該菌株為熒光假單胞菌B(PseudomonasfluorescensB)，相似度(SIM )為0.541，位距(DIST)為4.439。測試板上的“表型指紋”分析結(jié)果如表1所示。

表1 菌株SZ-1 Biolog 鑒定板分析結(jié)果

2.3 16S rRNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構建

菌株SZ-1的16S rRNA 基因序列長度為1 443 bp，其序列通過NCBI-BLAST進行同源性檢索顯示其與熒光假單胞菌標準菌株MH304226.1的16S rRNA基因序列同源性最高，一致性達99.86%。從Genebank上選取典型的序列，包括熒光假單胞菌、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、燦爛弧菌(V.splendidus)、需鈉弧菌(V.natriegens)、地中?；【?V.mediterranei)、歐式弧菌(V.owensii)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)的16S rRNA 基因序列，利用MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育學分析，結(jié)果顯示細菌SZ-1與熒光假單胞菌(MH304226.1和MG576170.1)聚合在一起(如圖1所示)。

根據(jù)細菌SZ-1的生理生化特征、Biolog分析、16S rRNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，將細菌SZ-1鑒定為熒光假單胞菌。

注：分支上的數(shù)字表示這一分支的可靠程度；長度表示進化距離。

3 討論

假單胞菌屬(Pseudomonas)廣泛分布于土壤、淡水、海水以及生物體中，是一類生長適應能力較強的革蘭氏陰性菌，大多不致病，還有一部分是條件致病菌。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，熒光假單胞菌是一類常見的水生生物條件致病菌，因感染熒光假單胞菌而引發(fā)各種細菌性疾病的情況越來越普遍，該菌能感染無脊椎動物和脊椎動物，對魚蝦的危害尤其嚴重[4-5]。徐國成等[6]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞桿菌感染對蝦后引起熒光病，蝦苗出現(xiàn)活力下降，食欲不振，直至死亡。王高學等[7]發(fā)現(xiàn)大鯢感染該菌會患赤皮癥，體表呈現(xiàn)出化膿性潰瘍并且布滿紅斑塊。中國常見的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類中，熒光假單胞菌能夠引起草魚、鯉和大菱鲆等發(fā)生赤皮病[5]，但是目前還未有該菌引起水蛭患病的報道。

致病性熒光假單胞菌對水產(chǎn)動物的危害日益嚴重，且有研究表明它可能是一種潛在的人畜共患病原，能夠引起菌血癥、皮膚病、消化系統(tǒng)和呼吸道感染等疾病的爆發(fā)[8]，這警示人們應該對該菌引起重視。

本研究中通過細菌形態(tài)學特征、生理生化結(jié)果初步鑒定SZ-1菌株屬于假單胞菌屬。Biolog GenIII微孔板可對細菌進行71種碳源利用測試以及23 種化學敏感性測試，其“表型指紋”被用來在種水平上鑒定該微生物，本研究中Biolog GenIII分析鑒定該菌株為熒光假單胞菌。細菌SZ-1的16S rRNA 基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建，顯示該菌的16S rRNA基因序列與已報道的熒光假單胞菌(MH304226.1和MG576170.1) 16S rRNA基因序列的相似性高達99%以上，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，SZ-1菌株與熒光假單胞菌聚為一支。

綜上所述，本研究中利用微生物學和分子生物學方法，對患病水蛭進行了病原菌的分離和鑒定，研究結(jié)果可為水蛭養(yǎng)殖過程中熒光假單胞菌的疾病防治提供基礎資料。