炎性細(xì)胞因子在肌萎縮側(cè)索硬化診斷治療中的研究進(jìn)展

李曉光，楊 璐，劉旭東，賈鑫淼，程燕飛，3，崔麗英

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科； 2.醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，北京 100730；3.山西醫(yī)科大學(xué) 第七臨床醫(yī)學(xué)院 臨汾市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 山東 臨汾 041000)

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一組選擇性累及腦和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性病，機(jī)制不明，尚無有效治療。遺傳因素在ALS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用， 目前認(rèn)為ALS是多基因參與的復(fù)雜疾病，迄今已發(fā)現(xiàn)超過30個(gè)致病基因。有基因突變的患者和無基因突變的患者臨床表現(xiàn)，如肌萎縮及肌無力部位，進(jìn)展速度等差別不大，發(fā)病年齡稍低。各種基因突變及無突變的病例涉及多種病理機(jī)制，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能異常、氧化應(yīng)激、蛋白的錯(cuò)誤折疊聚合和鈣超載、RNA/DNA調(diào)控異常及炎性反應(yīng)等。其中小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)在ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性中的作用成為近年來研究熱點(diǎn)[1]。

ALS患者腦脊液和血液多種炎性細(xì)胞因子水平發(fā)生改變，支持神經(jīng)炎性反應(yīng)在導(dǎo)致進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失的致病機(jī)制中的作用，也提示其可能成為有助于ALS診斷、預(yù)后判斷的潛在特異性生物標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，少數(shù)單個(gè)炎性細(xì)胞因子不具有足夠的敏感性和特異性作為特異性指標(biāo)，需要結(jié)合其他指標(biāo)[2]，也無治療成功的臨床試驗(yàn)。因此，闡明各類型ALS中多種炎性細(xì)胞因子變化的規(guī)律，具有重要的臨床意義。本綜述介紹了ALS中相關(guān)炎性細(xì)胞因子研究的進(jìn)展，并對(duì)文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行了分析，以期對(duì)今后的相關(guān)研究有所啟發(fā)。

1 神經(jīng)炎性反應(yīng)是肌萎縮側(cè)索硬化重要的病理機(jī)制

ALS患者的免疫系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致中樞和外周炎性反應(yīng)增加。神經(jīng)炎性反應(yīng)的特征是小膠質(zhì)細(xì)胞激活、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤以及炎性細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后分為MI型和M2型。M1型促進(jìn)神經(jīng)毒性T細(xì)胞反應(yīng)，分泌活性氧和促炎因子,包括白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)，以及減少保護(hù)性神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌而具有細(xì)胞毒性。相反，M2型具有保護(hù)作用，可釋放高水平的抗感染細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括IL-4、IL-10和胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)以及與其他神經(jīng)保護(hù)信號(hào)分子。

目前普遍認(rèn)為ALS患者血液中的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞通過白細(xì)胞介素、趨化因子、細(xì)胞黏附分子及受體等一系列分子之間的相互作用，可穿過血腦屏障并進(jìn)一步破壞血腦屏障，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腦脊液的改變及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)[3]。

在ALS患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，嗜酸粒細(xì)胞衍生神經(jīng)毒素、嗜酸粒細(xì)胞趨化因子、C反應(yīng)蛋白、TNFα等均有升髙，包括許多白細(xì)胞介素在內(nèi)的大量炎性細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞(如T調(diào)節(jié)細(xì)胞，Treg)和更快或更慢的進(jìn)展相關(guān)[4]。這為進(jìn)一步在更多患者及更細(xì)分組情況下確定其變化規(guī)律提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)。

2 肌萎縮側(cè)索硬化基因變異與炎性機(jī)制

對(duì)炎性過程研究有望將不同基因突變所致的ALS聯(lián)系起來，為ALS神經(jīng)功能障礙和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化的共同機(jī)制提供線索，可能加快對(duì)患者生物標(biāo)志物的確定及治療干預(yù)途徑和靶點(diǎn)的確定。從1993年起已發(fā)現(xiàn)了數(shù)種導(dǎo)致ALS的突變基因。有些突變基因編碼的許多蛋白質(zhì)可損害免疫系統(tǒng)功能，提供了免疫失調(diào)參與ALS發(fā)病機(jī)制的重要證據(jù)[5]。超氧化物歧化酶1(SOD1)、TAR-DNA結(jié)合蛋白(TAR-DNA binding protein，TARDBP)或C9orf72突變轉(zhuǎn)基因嚙齒動(dòng)物模型及ALS患者出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的明顯炎性反應(yīng)，這些突變基因的表達(dá)導(dǎo)致ALS樣病理改變及免疫功能障礙。編碼視神經(jīng)素蛋白(optineurin，OPTN)、編碼絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)、編碼序列體1蛋白(sequestosome，SQSTM1，也稱為泛素結(jié)合蛋白p62)、編碼腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3相互作用蛋白1(TNF-α-induced protein 3-interacting proteins，TNIP1)、編碼含纈氨酸蛋白(valosin-containing protein，VCP)基因和編碼趨化因子受體1[chemokine (C-X3-C motif) receptor 1，CX3CR1]的基因等也有報(bào)道可直接損害免疫基因功能并促進(jìn)炎性反應(yīng)。這些突變基因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周免疫系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)的炎性機(jī)制參與ALS發(fā)病機(jī)制的最直接證據(jù)。也提示自噬、核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和下游核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3(NLR pyrin domain-containing protein3，NLRP3)炎性小體參與了ALS的發(fā)病機(jī)制。

OPTN基因是目前唯一被認(rèn)為通過功能喪失突變導(dǎo)致經(jīng)典ALS的已知基因。OPTN通常抑制NF-κB活性，NF-κB是先天性免疫反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，在其缺失或突變形式下，NF-κB被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并促進(jìn)大量促炎基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)。大多數(shù)研究認(rèn)為突變的OPTN與NF-κB通路的失調(diào)有關(guān)，從而促進(jìn)促炎性反應(yīng)。OPTN基因也通過促進(jìn)周圍免疫細(xì)胞中TBK1激活和干擾素(interferon)釋放調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)信號(hào)。因此OPTN/TBK1介導(dǎo)的IFN-軸調(diào)節(jié)失常導(dǎo)致受損神經(jīng)元內(nèi)免疫衰竭，易感于神經(jīng)元退行性病變[6]。

TBK1基因無義及錯(cuò)義突變可引起家族及散發(fā)性ALS和額顳癡呆，TBK1基因共分離和單倍體不足突變也會(huì)導(dǎo)致ALS和額顳癡呆[7]。TBK1蛋白結(jié)合并促使許多蛋白質(zhì)磷酸化，包括OPTN和sequestosome-1/p62，并調(diào)節(jié)先天固有免疫和自噬。TBK1功能域的錯(cuò)義突變可損害正常靶點(diǎn)的結(jié)合和磷酸化，提示功能缺失機(jī)制和截短突變類似[8]。

ALS患者有數(shù)種SQSTM1基因突變。SQSTM1基因編碼一種調(diào)節(jié)自噬和氧化應(yīng)激的主要病理蛋白p62。SQSTM1的突變可改變p62的功能，并通過損害聚集蛋白降解和自噬而促進(jìn)ALS的病理生理學(xué)[9]。

VCP基因突變可導(dǎo)致家族性和散發(fā)性ALS。VCP是自噬和ALS泛素化蛋白酶體途徑的重要組成部分。VCP突變損害整體蛋白質(zhì)降解并導(dǎo)致TDP43沉積，導(dǎo)致包涵體肌病、Paget病、額顳癡呆和ALS[10]。

不同基因突變的ALS患者相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)不同，SOD1基因突變ALS患者組從發(fā)病到死亡的時(shí)間長于C9orf72六核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增ALS患者組和其他ALS患者組。其他ALS患者組腦脊液TNF-α高于C9orf72六核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增ALS患者組。與其他ALS患者組和SOD1基因突變患者組相比，C9orf72六核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增患者組的腦脊液IFN-α水平更高。ALS患者的生存率與IL-10呈負(fù)相關(guān)。其他ALS患者組血漿TNF-α、IL-10和TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，C9orf72六核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增患者組血漿IL-1β，SOD1基因突變ALS患者組腦脊液TRAIL均與生存率呈負(fù)相關(guān)[11]。這一研究進(jìn)一步證實(shí)ALS各亞型的生存時(shí)間差異與細(xì)胞因子水平相關(guān)，表明不同ALS基因變異存在相關(guān)的特異性免疫反應(yīng)。

3 炎性細(xì)胞因子做為臨床診斷、分型及預(yù)后生物標(biāo)志物的研究

目前在ALS患者中檢測各種炎性細(xì)胞因子的研究較多，但結(jié)果差異較大。如肌酸激酶、鐵蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12p70、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等水平普遍升高，而IFN-γ降低，認(rèn)為ALS存在T細(xì)胞介導(dǎo)系統(tǒng)性調(diào)節(jié)的炎性標(biāo)志物，結(jié)合各種變量綜合考慮，IL-6、TNF-α和IFN-g是調(diào)節(jié)幅度最大的標(biāo)志物。轉(zhuǎn)鐵蛋白和IL-2高水平是短生存期的預(yù)測因子。IL-5水平與肌酸激酶成正相關(guān)，而TNF-α與神經(jīng)微絲輕鏈(neurofilament light，NfL)成正相關(guān)。IL-6與C反應(yīng)蛋白水平相關(guān)，在縱向觀察中顯示在患者終末期水平增加。在進(jìn)展緩慢的ALS患者、男性患者、肢體起病、功能損害較小的ALS患者以及使用利魯唑治療的ALS患者中，血漿IL-6在6次就診中逐漸增加，表明IL-6在患者分層中可能有一定作用[4]。也發(fā)現(xiàn)ALS患者和對(duì)照組IL-4、IL-1b和IFN-γ水平存在顯著差異，ALS患者IL-4和IL-1b水平升高，而健康對(duì)照組的IFN-γ水平較高[12]。IL-6水平可區(qū)分ALS患者和正常對(duì)照，并可做為ALS診斷的生物標(biāo)志物，IL-2水平的升高在ALS起保護(hù)作用[13]。而IL-6水平與年齡及呼吸功能有關(guān)，認(rèn)為與疾病的炎性反應(yīng)狀態(tài)無關(guān)[14]，有時(shí)ALS患者和對(duì)照組腦脊液和血液IL-6水平無差別，而TNF-α升高[15]。也發(fā)現(xiàn)TNF-α在ALS患者腦脊液和血液均升高[16]。腦脊液MCP-1、MIP-1a和IL-18以及血漿MCP-1和IL-18有可能是ALS患者存在炎性的標(biāo)志物，神經(jīng)微絲(neurofilaments，NFs)在ALS患者也升高，隨病程變化趨于穩(wěn)定，可預(yù)測疾病進(jìn)展速度和生存率[17]。這意味著這類炎性標(biāo)志物可以預(yù)測預(yù)后。

ALS患者腦脊液IL-6水平高于健康對(duì)照組和神經(jīng)疾病對(duì)照組。ALS患者血清IL-6水平與健康對(duì)照組相比也有所升高，但與神經(jīng)疾病對(duì)照組相比無顯著性差異。他們?cè)谒谢颊呔捎^察到血清IL-6R增加，只有ALS患者腦脊液IL-6R水平顯著升高。根據(jù)基因型比較，只有攜帶IL-6R C等位基因的ALS患者腦脊液IL-6水平升高，攜帶IL6R C等位基因的ALS患者ALSFRS-R評(píng)分下降幅度大于未攜帶IL-6R C等位基因的患者[18]，并認(rèn)為這組患者可以進(jìn)行以IL-6為靶點(diǎn)的治療[19]。

有此可見，尋找腦脊液和血液中與臨床表型相關(guān)的炎性細(xì)胞因子是研究熱點(diǎn)，但集中在少數(shù)幾個(gè)炎性細(xì)胞因子，結(jié)論不一致，尤其腦脊液與血液檢測結(jié)果差異較大。臨床收集腦脊液需進(jìn)行有創(chuàng)的腰椎穿刺，限制了臨床常規(guī)應(yīng)用。血液中炎性細(xì)胞因子水平受影響因素多，ALS患者血液中某些細(xì)胞因子的水平在第一次和第二次就診之間變化很大，甚至在某些情況下與健康對(duì)照組沒有差異，顯示出疾病的巨大異質(zhì)性。前期研究主要的問題是樣本量較小，無法對(duì)患者進(jìn)行發(fā)病部位、年齡及臨床分型及分期的亞組分析。

4 炎性細(xì)胞因子做為治療監(jiān)測指標(biāo)的研究

在臨床藥物試驗(yàn)中可利用炎性因子作為監(jiān)測治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。ALS患者的炎性反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜過程，因此旨在降低炎性標(biāo)志物豐度的治療有一定意義。

早期研究聯(lián)合使用阿納金拉和利魯唑治療中度進(jìn)展的ALS和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病患者，未觀察到對(duì)疾病進(jìn)展的影響。患者血清IL-6和TNF-α有輕微下降。而纖維蛋白原水平顯著降低，血清中的C反應(yīng)蛋白水平升高，表明這種藥物組合可能針對(duì)特定的炎性反應(yīng)途徑[20]。

托珠單抗(tocilizumab)是一種基于抗體的治療藥物，可抑制IL-6和可溶性IL-6信號(hào)，已證明可降低治療24 h后散發(fā)性ALS患者外周血以及與活化巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的單核細(xì)胞中炎性介質(zhì)的mRNA表達(dá)和蛋白分泌。向患者直接輸注托珠單抗可降低急性和縱向基礎(chǔ)炎性反應(yīng)程度較高的散發(fā)性ALS患者血清許多炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)，并與ALSFRS-R評(píng)分的降低程度相關(guān)[21]。

由巴利昔單抗(basiliximab)、他克莫司(tacrolimus)、霉酚酸酯(mycophenolate)和強(qiáng)的松組合的免疫抑制方案治療31個(gè)ALS患者6個(gè)月時(shí)ALSFRS-R無改善。但I(xiàn)L-2水平升高，在隨訪中逐漸下降[22]。

在低劑量IL-2每4周治療5 d為一個(gè)循環(huán)的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)主要終點(diǎn)結(jié)局在第一循環(huán)治療后患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (regulatory T-cell，Treg)百分比顯著升高，次要結(jié)局在5個(gè)循環(huán)治療后Treg百分比依然與對(duì)照組有顯著差異，值得進(jìn)一步評(píng)估減緩ALS疾病進(jìn)展的效果[23]。

從治療角度，預(yù)后不良和病情進(jìn)展緩慢的ALS患者從某一種治療中獲益程度是不同的。確定炎性細(xì)胞因子的水平與臨床表型，病程的關(guān)系是非常重要的，因?yàn)榧词乖跓o法改變致病基因突變直接結(jié)果的情況下，炎性過程可能成為分層指標(biāo)及治療干預(yù)的靶點(diǎn)，或?qū)膊☆A(yù)后有一定預(yù)測作用。

5 問題與展望

ALS是一種多因素、多基因參與的疾病，不同的病理機(jī)制直接或間接導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，神經(jīng)炎性反應(yīng)是這些機(jī)制之一。多項(xiàng)研究表明，ALS患者的神經(jīng)炎性反應(yīng)狀態(tài)并不總是相同，ALS患者中細(xì)胞因子水平及變化趨勢因疾病階段、ALS類型、患者全身狀態(tài)具有較大異質(zhì)性。識(shí)別特定的細(xì)胞因子以幫助診斷、預(yù)測疾病的進(jìn)展及候選靶點(diǎn)具有挑戰(zhàn)性。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究ALS疾病進(jìn)展過程中各種促炎和抗炎細(xì)胞因子的變化規(guī)律，了解其時(shí)間點(diǎn)激活及其與ALS中其他分子和臨床表現(xiàn)的關(guān)系，有助于根據(jù)ALS患者的炎性反應(yīng)狀態(tài)進(jìn)一步分層，從而更好地監(jiān)測疾病進(jìn)展，并且開發(fā)針對(duì)這些關(guān)鍵免疫因子的更準(zhǔn)確的治療方法。