泌尿外科疾病中Uroplakins的研究進(jìn)展

周 輝，李宜桓，陳書練，羅 旭

Uroplakins(Upk)是一類在脊椎動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布的完整膜蛋白，主要分布于尿路上皮傘狀細(xì)胞層，是尿路斑塊的主要組成部分，因此又稱為尿斑蛋白。Upk主要包括Upk1A、Upk1B、Upk2、Upk3A和Upk3B，其中Upk1A和Upk1B是具有40%同源性的四跨膜蛋白，Upk2和Upk3為單跨膜蛋白。Upk3B在尿路上皮斑塊中的表達(dá)水平較低，通常不足Upk3A的10%，但在內(nèi)臟間皮組織和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中大量表達(dá)。此外，在胃、腎、前列腺、生殖腺等多種非尿路上皮組織中，亦發(fā)現(xiàn)多種Upk的表達(dá)。

Upk的主要功能是形成尿路上皮的血尿屏障，防止膀胱中尿液的水和其他溶質(zhì)進(jìn)行跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Upk的破壞和異常表達(dá)會(huì)損害尿路上皮屏障功能，導(dǎo)致尿路系統(tǒng)異常。大量研究表明，Upk在多種泌尿系統(tǒng)相關(guān)疾病的病理和發(fā)病機(jī)制中起重要作用。因此，深入了解Upk在泌尿外科相關(guān)疾病中的表達(dá)和作用，將有助于疾病的進(jìn)一步診斷與治療。

1 Upk是構(gòu)建尿路屏障的主要蛋白

生理?xiàng)l件下尿路上皮傘細(xì)胞的頂端質(zhì)膜上被大量的斑塊蛋白覆蓋，這些斑塊的外葉比內(nèi)葉厚，稱為不對(duì)稱單位膜(asymmetric unit membrane, AUM)。AUM蛋白顆粒主要由Upk1A、Upk1B、Upk2和Upk3A構(gòu)成，呈六邊形排列，直徑為16 nm[1]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Upk1A與Upk2組成異二聚體，Upk1B與Upk3A組成異二聚體，并轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體進(jìn)行下一步合成。Upk2前序列上3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)中的2個(gè)多糖在高爾基體中形成復(fù)合多糖，并在反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中通過(guò)弗林蛋白酶的作用去除，在糖基化修飾和構(gòu)象變化的作用下組成異四聚體(Upk1A/Upk2-Upk1B/Upk3A)。六個(gè)異四聚體組裝成16 nm的環(huán)形二維晶體結(jié)構(gòu)，在高爾基體后囊泡中排列成緊密的半結(jié)晶狀斑塊蛋白[2]。在細(xì)胞角蛋白的調(diào)節(jié)下，斑塊蛋白從高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到頂端質(zhì)膜，導(dǎo)致高爾基體在細(xì)胞中碎裂和重新分布，大量肌動(dòng)蛋白微管發(fā)生重新排列，細(xì)絲從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)消失[3]。AUM通過(guò)鉸鏈區(qū)相互連接，賦予了傘細(xì)胞層高度的可塑變形性和順應(yīng)性，從而適應(yīng)膀胱從充盈到排空過(guò)程中經(jīng)歷的形態(tài)變化。

Upk正確合成尿路斑塊是尿路屏障形成的基礎(chǔ)。Upk基因敲除的小鼠表現(xiàn)為AUM結(jié)構(gòu)改變和屏障功能缺陷。Upk1B基因敲除后的小鼠無(wú)法產(chǎn)生Upk1B/3A二聚體，AUM的形成受阻[4]。Upk3基因缺陷的小鼠Upk1B表達(dá)上調(diào)且無(wú)法正常進(jìn)行糖基化，無(wú)法形成正確的AUM結(jié)構(gòu)，其尿路上皮通透性顯著增加，但跨膜阻力表達(dá)正常[5]。Upk2基因敲除小鼠的尿路上皮斑塊完全丟失，由于Upk3B的存在，Upk3A基因敲除小鼠的尿路上皮斑塊丟失70%～80%。

2 Upk在泌尿系統(tǒng)發(fā)育中的作用

胚胎期Upk在膀胱、輸尿管和腎盂的尿路上皮中表達(dá)，其表達(dá)量與尿路上皮斑塊形成的數(shù)量一致。研究發(fā)現(xiàn)，源自胚胎期輸尿管芽上皮細(xì)胞的Sec10對(duì)尿路上皮發(fā)育和屏障功能建立有至關(guān)重要的作用，Sec10基因敲除后Upk3表達(dá)完全缺失，未觀察到尿路斑塊形成和尿路上皮分化[6]。Upk3基因缺失小鼠表現(xiàn)為腎盂擴(kuò)張、腎積水，并且可導(dǎo)致原發(fā)性膀胱輸尿管反流(vesicoureteric reflux, VUR)。文獻(xiàn)報(bào)道，在Upk3A基因突變的患者中發(fā)現(xiàn)腎發(fā)育不全、泄殖腔畸形和VUR等畸形[7]。Upk2基因突變小鼠因輸尿管內(nèi)尿路上皮細(xì)胞增生出現(xiàn)梗阻性先天性腎病，最終死亡[8]。Upk1B基因敲除小鼠發(fā)生進(jìn)行性腎積水，約16%出現(xiàn)單側(cè)重復(fù)腎畸形[4]。因此，Upk缺失和異常可能導(dǎo)致腎臟發(fā)育不良。

尿路上皮和生殖系統(tǒng)具有相同的胚胎起源，因此在多處生殖系統(tǒng)組織中發(fā)現(xiàn)Upk的表達(dá)。Upk在人類胚胎生殖竇和尿道中表達(dá)，然而隨著男性陰莖、尿道的發(fā)育和包皮、龜頭結(jié)構(gòu)的成形，Upk的表達(dá)量逐漸減弱直至消失[9]。在人類女性生殖道中亦未觀察到Upk表達(dá)[10]。Upk1A、Upk1B、Upk2和Upk3B在雄性小鼠的前列腺、睪丸、精囊和精子中大量表達(dá)[11-12]。組織學(xué)分析表明，Upk3B在精子細(xì)胞成熟期被特異性激活[13]。Upk基因敲除小鼠的體外受精率和產(chǎn)仔數(shù)均下降，提示Upk可能在受精過(guò)程中起重要作用[11]。

3 Upk在膀胱癌中的作用

尿路上皮癌占膀胱癌的90%以上，Upk在大多數(shù)膀胱尿路上皮癌中表達(dá)，而在非尿路上皮癌中不表達(dá)。因此，Upk的特異性抗體在臨床上用于鑒定尿路上皮起源的膀胱腫瘤病變。腫瘤組織破壞了正常尿路上皮結(jié)構(gòu)，Upk在血液和尿液中的釋放量明顯增多。在膀胱癌組織中，Upk1A的表達(dá)較癌旁組織明顯上升，且與臨床預(yù)后不良相關(guān)，是影響患者生存率的重要預(yù)后因子。在尿路上皮癌細(xì)胞株(T24)中，siRNA轉(zhuǎn)染Upk1A可抑制T24的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。在肝癌細(xì)胞中亦發(fā)現(xiàn)相同情況，缺氧下Upk1A與HIF-1α結(jié)合從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和糖酵解，其中長(zhǎng)鏈非編碼RNA Upk1A-AS1起關(guān)鍵作用[15]。Upk1B在膀胱癌中表達(dá)增高，且與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良密切相關(guān)，下調(diào)Upk1B后可明顯降低癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用[16]。Upk2是尿路上皮細(xì)胞譜系標(biāo)志物，在尿路上皮來(lái)源腫瘤的鑒別和診斷中的價(jià)值優(yōu)于S100P、GATA3和THBD等[17]。Upk2在尿路上皮癌免疫組化中呈胞膜和胞質(zhì)內(nèi)彌漫性表達(dá)，在與其他來(lái)源腫瘤的鑒別中具有較高的特異性和敏感性[18]。膀胱癌患者的血漿Upk2平均濃度較正常對(duì)照組高1.4倍，尿液Upk2平均濃度高3.4倍[19]。在非浸潤(rùn)性膀胱癌和浸潤(rùn)性膀胱癌、低級(jí)別組和高級(jí)別組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，血漿和尿液的Upk2濃度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Upk3A在膀胱癌患者血漿和尿液中的表達(dá)明顯升高，且在低級(jí)別組和高級(jí)別組之間差異有顯著性，提示Upk3A濃度在膀胱癌分級(jí)中有較高的應(yīng)用價(jià)值[20]。Tsumura等[21]檢測(cè)血清中Upk3的濃度，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量和肌肉侵襲、淋巴血管侵犯存在顯著相關(guān)性，浸潤(rùn)性膀胱癌的血清Upk3濃度明顯高于非浸潤(rùn)性膀胱癌。因此，高血清Upk3可能提示膀胱癌患者預(yù)后不良。

值得關(guān)注的是，Upk在其他腫瘤中亦發(fā)揮重要作用。Upk1A在肺癌[22]、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌[15]中升高，但在食管癌[23]、結(jié)直腸癌[24]、胃癌[25]中表達(dá)降低。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，Upk1A的低表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Upk1A啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化，去甲基化處理后可恢復(fù)Upk1A的表達(dá)[23]。Upk1B在腎癌組織中表達(dá)增加，過(guò)表達(dá)Upk1B能增強(qiáng)N-α-乙酰基轉(zhuǎn)移酶10(NAA10)引起的增殖作用[26]。Upk2在乳腺大汗腺癌和浸潤(rùn)性小葉癌中表達(dá)[27]。卵巢Brenner瘤常伴尿路上皮化生，在Brenner瘤可見Upk3表達(dá)[28]。根據(jù)癌癥基因組圖譜中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，Upk3A在前列腺癌中的表達(dá)比膀胱癌中更高[17]。Upk3B是間皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，在間皮瘤中表達(dá)降低[29]。

4 Upk在膀胱炎中的作用

細(xì)菌性膀胱炎主要由尿路致病性大腸桿菌(uropathogenic escherichia coli, UPEC)引起，大多數(shù)UPEC分離株均表達(dá)1型菌毛黏附素(FimH)，F(xiàn)imH能識(shí)別糖基化的Upk1A并特異性結(jié)合其核苷酸結(jié)構(gòu)序列，從而啟動(dòng)UPEC對(duì)宿主的入侵、定植與增殖，促進(jìn)尿路上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌群落的形成。將Upk1A的天冬酰胺連接糖基化位點(diǎn)(Asn169)替換為非糖基化位點(diǎn)(Gln169)后，F(xiàn)imH無(wú)法與Upk1A正常結(jié)合，UPEC定植與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較正常小鼠明顯減少[30]。Upk1A胞外環(huán)結(jié)構(gòu)上的糖基化位點(diǎn)可聚集相對(duì)分子質(zhì)量為(2.0～3.0)×104的高甘露糖，是FimH黏附的關(guān)鍵。FimH拮抗劑甘露糖苷能有效抑制FimH的黏附作用，從而阻斷UPEC與Upk1A的結(jié)合，是治療UPEC感染的有效靶點(diǎn)[31]。FimH還通過(guò)酪蛋白激酶Ⅱ誘導(dǎo)Upk3A結(jié)構(gòu)域中的Thr244磷酸化，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，促進(jìn)UPEC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[32]。敲低Upk3后UPEC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯減少，Upk1B可促進(jìn)Upk3的表達(dá)與結(jié)合，進(jìn)一步加劇UPEC的感染程度[33]。敲除Upk1B后，尿路上皮的細(xì)菌負(fù)荷明顯減少[4]。

間質(zhì)性膀胱炎(interstitial cystitis, IC)為一種病因不明、以疼痛和下尿路癥狀為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，其主要特征是尿路上皮通透性增加、屏障功能受損導(dǎo)致大量炎性物質(zhì)聚集，并刺激神經(jīng)元產(chǎn)生疼痛和相關(guān)癥狀。Zeng等[34]檢測(cè)到IC患者的膀胱組織中Upk1A、Upk1B、Upk2的表達(dá)水平顯著降低，而Upk3表達(dá)量增加，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Upk3的選擇性剪接體Upk3-delta4表達(dá)增加。與潰瘍性IC、正常對(duì)照組相比，非潰瘍性IC患者膀胱組織中Upk3表達(dá)明顯升高。Cho等[35]的研究顯示，在潰瘍性IC患者的非潰瘍部位中Upk3表達(dá)明顯升高。非潰瘍性IC在膀胱鏡檢查中缺乏表達(dá)，Upk3的表達(dá)水平可能在潰瘍性IC和非潰瘍性IC的鑒別具有重要的臨床意義。Upk3增加CD4+T細(xì)胞對(duì)尿路上皮細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)，引起膀胱的炎癥浸潤(rùn)、超敏反應(yīng)和相關(guān)癥狀。已有實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射UPK3A 65-84肽誘導(dǎo)IC的表型特征，建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性膀胱炎的動(dòng)物模型[36]。

出血性膀胱炎往往因腫瘤接受化療或放療引起，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CYP)是引起出血性膀胱炎最常見的化療藥物。腹腔注射CYP后，大鼠的尿液中Upk2濃度明顯增加，并出現(xiàn)嚴(yán)重血尿。出現(xiàn)明顯血尿的大鼠Upk2濃度高于無(wú)明顯血尿的大鼠，提示Upk2的濃度水平可能與血尿的嚴(yán)重程度有關(guān)[37]。使用腎上腺素進(jìn)行膀胱內(nèi)灌注后Upk2的表達(dá)水平上升，膀胱黏膜水腫和出血等情況得到緩解。腹腔注射CYP后小鼠膀胱組織中的Upk3A表達(dá)水平明顯下降，S-烯丙基半胱氨酸(SAC)是一種有效的尿路保護(hù)劑，使用SAC治療后上調(diào)了Upk3A的表達(dá)水平。

5 展望

隨著近年對(duì)Upk結(jié)構(gòu)和功能的研究逐漸深入，Upk在泌尿外科疾病中的作用有了更清楚的認(rèn)識(shí)。Upk是尿路屏障的主要構(gòu)成蛋白，在病理?xiàng)l件下受表觀遺傳變化的調(diào)控。Upk的表達(dá)變化與膀胱癌的轉(zhuǎn)移、分期和預(yù)后有密切聯(lián)系。Upk可能改變細(xì)菌入侵和炎癥浸潤(rùn)，從而影響膀胱炎的發(fā)生、發(fā)展。目前，越來(lái)越多的研究證實(shí)Upk在其他組織和疾病中的表達(dá)，Upk與多種腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系。目前，Upk的研究不再限于尿路上皮炎癥和腫瘤，但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少，Upk在不同系統(tǒng)疾病中的病理改變和分子機(jī)制仍值得進(jìn)一步探討。