李建香 王君君 黃天馬 張子健 過偉峰

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院，南京 210022)(2. 南京中醫(yī)藥大學，南京 210023)

隨著微生態(tài)學的發(fā)展，無菌動物開始廣泛應用于生物學、醫(yī)學和藥學領域。制作公認的無菌動物模型是進行各項研究的基礎。無菌動物特別是無菌大鼠、小鼠的成功培育技術成為研究微生物與人類生命現(xiàn)象(健康、疾病)關系的關鍵技術[1-2]。由于無菌動物具有早期生長緩慢、性成熟晚、產仔量少且成活率高、壽命較長、免疫系統(tǒng)發(fā)育不良、消化功能差和抗輻射能力強等特點，其在微生物寄生蟲學、免疫代謝學、營養(yǎng)學、老年學、腫瘤學、消化學、神經精神學、放射醫(yī)學、毒理和藥理學等研究中發(fā)揮舉足輕重的作用[3-5]。

嚴格的無菌動物指在動物體宿主內外任何部位及生活環(huán)境中均檢測不出任何細菌、病毒、真菌及寄生蟲的動物。廣義的無菌動物還包括清除腸道中大部分菌群的動物，又稱為偽無菌動物。目前制作無菌鼠的方法主要有：剖腹取胎無菌飼養(yǎng)法制作無菌(germ-free, GF)鼠模型，抗生素雞尾酒法制作偽無菌(pseudo germ-free, PGF)鼠模型。本文對無菌鼠模型制作方法進行歸納總結與評價，以期為科學研究和推廣應用提供參考。

1 剖腹取胎無菌飼養(yǎng)法制作無菌鼠模型

通常認為哺乳動物在母體子宮內處于相對無菌狀態(tài)。對無特定病原體(specific pathogen free, SPF)大鼠、小鼠進行剖腹取胎凈化，采用無菌飼養(yǎng)方法培育于無菌隔離器，經人工飼育建立無菌鼠群[6-11]。

1.1 判斷孕鼠分娩日期

母鼠達到體成熟進行交配，通過陰道栓判斷母鼠受孕成功，根據經驗或者以提前交配的同種鼠的孕產期為依據，推斷受孕母鼠的分娩日期。一般于見栓后20.5 d進行剖宮取胎手術，剖得仔鼠成活率最高[12]。

1.2 進行剖宮取胎手術

器材及物品進行消毒與滅菌，通過頸椎脫臼法處死母鼠，充分消毒，按照無菌原則行剖腹產術。為避免污染仔鼠，在切取子宮前結扎兩側輸卵管及宮頸底部，完整分離子宮，避免損傷子宮囊。

1.3 隔離器中剖取仔鼠

將子宮囊充分消毒，轉移至無菌隔離器內。所有物品徹底滅菌并檢測合格后轉入隔離器，進行無菌操作，剪開子宮壁，分離胎盤，剪斷臍帶，取出仔鼠，及時擦拭清理仔鼠口鼻異物，刺激仔鼠促其自主呼吸。

1.4 無菌環(huán)境飼養(yǎng)仔鼠

剖得仔鼠后采取人工灌胃哺乳法或者無菌代乳鼠喂養(yǎng)，按無菌操作程序進行樣品接種前制備和接種。在無菌隔離器中給予仔鼠無菌飼料、水、墊料等。

1.5 培育監(jiān)測無菌鼠群

仔鼠生產和產后接觸的均為無菌環(huán)境，但母鼠體內的微生物可能通過胎盤傳播給仔鼠，因此不建議將第一代仔鼠用于無菌實驗。待此無菌新生鼠成年后，在無菌環(huán)境內繁殖后代，建立無菌鼠群用于科學研究。飼養(yǎng)仔鼠過程中，每1～2周收集1 次糞便和墊料，監(jiān)測微生物變化，以實時檢測是否受到污染。

2 抗生素雞尾酒法制作偽無菌鼠模型

給予SPF級大鼠、小鼠抗生素混合物可清除90%腸道微生物，但其體質量形態(tài)、生理功能、對全身系統(tǒng)的影響無顯著變化[13-15]?？股仉u尾酒法只是清除腸道大部分微生物，對口腔、皮膚、呼吸系統(tǒng)等微生物無影響，因此稱為偽無菌動物。通過抗生素雞尾酒法獲得偽無菌鼠模型，是研究腸道菌群與宿主關系、腸道菌群與疾病關系的理想模型。

2.1 選擇抗生素混合物

抗生素的抗菌譜和使用劑量不同，對腸道菌群的作用也不相同。制作偽無菌鼠模型應選擇廣譜抗生素聯(lián)合使用，以盡可能最大程度的清除大部分腸道微生物。目前常用的抗生素組合和劑量如下：鏈霉素(100 mg/kg)和新霉素(100 mg/kg)組合[16-21]，鏈霉素(200 mg/kg)、新霉素(200 mg/kg)和桿菌肽(200 mg/kg)[22-24]組合，新霉素(100 mg/kg)、萬古霉素(50 mg/kg)和兩性霉素-B(1 mg/kg)[25]組合，頭孢曲松鈉(350 mg/kg)和慶大霉素(126 mg/kg)[26]組合，氨芐西林(1 g/L)、新霉素(1 g/L)和甲硝唑(0.5 g/L)[27]組合，頭孢羥氨芐(100 mg/kg)、土霉素(300 mg/kg)、紅霉素(300 mg/kg)[28]組合等。

2.2 合理飼養(yǎng)SPF級鼠

以無菌飼料和純凈水飼養(yǎng)SPF級大鼠、小鼠，紫外線每日消毒飼養(yǎng)環(huán)境和墊料。注意抗生素混合物給藥途徑和持續(xù)時間，一般采用灌胃喂養(yǎng)，每日1次或2次，也可讓大鼠、小鼠自由飲用含抗生素的純凈水。根據實驗要求確定抗生素混合物喂養(yǎng)持續(xù)時間，少則3 d[28]，多則2周[25]，一般為5～7 d[1-2,26]?？股鼗旌衔飸咳张渲?，防止藥效流失，影響造模成功率。

2.3 監(jiān)測鼠群腸道菌群

抗生素雞尾酒法制作偽無菌鼠模型的方法受到外界環(huán)境因素影響較多，因此檢測腸道菌群尤其重要。定期收集新鮮糞便樣本，采用聚合酶鏈式反應(PCR)、熒光定量PCR技術、基因芯片技術或高通量測序等技術[29]實時監(jiān)測、快速精確的進行腸道菌群檢測，以確定偽無菌鼠是否造模成功。

3 制作方法評價與展望

無菌鼠模型制作技術可以推動微生態(tài)學的發(fā)展，促進疾病和微生物關系的研究深入發(fā)展。由于無菌鼠不攜帶任何生物體，基本排除生物因素對科學研究的干擾，可以明顯提高實驗的敏感性、重復性，有利于探究生命活動基本規(guī)律。隨著國內微生物研究的發(fā)展，無菌鼠是未來必不可少的動物模型之一。

無菌鼠適用于各種微生物學研究，尤其是研究藥物代謝、微生物寄生蟲、消化系統(tǒng)疾病、腫瘤的理想模型；按照嚴格的制作方法，制備成功率較高；在此基礎上植入某種特定微生物，可以建立悉生動物模型。但實際應用中尚存在以下問題：目前國內具有無菌鼠制備資質的研究所或企業(yè)相對較少，制備周期長，制備效率低；無菌鼠制備和飼養(yǎng)成本較高，導致價格昂貴，無法滿足實驗的大量需求；無菌鼠需飼養(yǎng)于無菌隔離器中，要求具備無菌環(huán)境，導致供應與應用分離，一定程度限制其推廣，難以充分滿足研究需求。

偽無菌鼠在實驗研究中可以部分代替無菌鼠，廣泛應用于腸道微生物的研究；采用抗生素雞尾酒法制備，制備周期短，制備效率高，價格便宜，制作簡便，對制備和飼養(yǎng)環(huán)境要求相對較低，可以滿足實驗的大量需求。但抗生素雞尾酒法制作模型也存在一些問題：目前主要適用于腸道微生物的研究，無法進行皮膚菌群、口腔菌群、泌尿道菌群、生殖道菌群等研究；無法替代無菌鼠模型移植一種或多種菌種建立悉生動物模型；業(yè)內尚未形成統(tǒng)一的偽無菌鼠造模成功評價標準；制備成功率相對較低，需進行公認的檢測后才能確定是否造模成功。

在應用方面，根據實際情況不論是采用無菌動物，偽無菌鼠或者悉生動物模型，希望能夠推動制備供應平臺與應用研究平臺分離，促成整體研究應用模型，構建無菌動物規(guī)?；咝а芯繎皿w系[30-31]。