付 瑞 王莎莎 王 吉 李曉波 王淑菁 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所/國家嚙齒類實驗動物資源庫，北京 102629)

能力驗證(proficiency testing)是利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準則來確定實驗室檢測能力的質(zhì)量評價活動，是中國合格評定國家認可委員會(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)對合格評定機構(gòu)能力進行評價的主要方式之一[1]。為提高實驗動物質(zhì)量檢測實驗室的業(yè)務(wù)水平，更好的發(fā)揮檢測工作在保證實驗動物質(zhì)量方面的作用，本實驗室自2013年每年都會申請參加國際實驗動物科學(xué)協(xié)會(the International Council for Laboratory Animal Science，ICLAS)建立的實驗動物檢測實驗室能力驗證計劃(ICLAS-PEP)，2018年申報的病毒病原檢測項目包含4份小鼠病毒盲樣。

在檢測工作中，樣品檢測前處理工作嚴重影響檢測結(jié)果。隨著實驗動物檢測標準的更新，待檢樣品種類越來越多，不適當?shù)奶幚頃斐蓹z測結(jié)果的假陰性。一些復(fù)雜的實驗樣本，如：全血、糞便等，不能按照傳統(tǒng)的方法進行處理，因此，建立樣品處理的標準操作規(guī)程對保證實驗結(jié)果的一致性和可信度有著非常重要的意義。然而目前關(guān)于檢測樣品處理的研究較少，本研究初步探索了糞便樣本中諾如病毒檢測的檢測前處理方法，以期獲得最佳檢測策略。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

4份待測病毒盲樣49-1、49-4、49-8、49-9均保存在2 mL樣本管中，其中49-1為0.5 mL含RNA病毒的小鼠盲腸內(nèi)容物，49-4為0.5 mL含RNA病毒的小鼠糞便、49-8為含RNA病毒的小鼠小腸組織勻漿，49-9為小鼠肝勻漿。以上樣品均由ICLAS提供。諾如病毒陰性的小鼠盲腸內(nèi)容物由本實驗室采集保存，小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler’s mouse encephalomyelitis virus，TMEV)cDNA、出血熱病毒(hemorrhagic fever virus，HV)cDNA、呼腸孤病毒Ⅲ型(reovirus type 3，Reo3)cDNA、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)cDNA、諾如病毒(murine norovirus，MNV)培養(yǎng)液及cDNA由本實驗室保存。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，熒光定量PCR引物和探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 實驗試劑和儀器

病毒核酸DNA/RNA提取試劑盒(TaKaRa，北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司)、病毒RNA提取試劑盒【QIAGEN，凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司】、反轉(zhuǎn)錄試劑盒【Thermo，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司】、探針法熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒【ABI，艾濟遺傳(北京)科技有限公司】、染料法熒光定量PCR試劑盒、PCR反應(yīng)及電泳相關(guān)試劑(TaKaRa，北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司)、7500Fast熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1病毒核酸提取及反轉(zhuǎn)錄：在49-4的小鼠糞便樣本中加入0.5 mL無菌PBS混勻，分別吸取49-1、49-4、49-8、49-9盲樣0.2 mL，并提取DNA/RNA混合物后轉(zhuǎn)錄cDNA備用。

1.3.2引物的合成：由于提供的3份盲樣為腸道RNA病毒，故合成有可能在腸道出現(xiàn)的病毒，如腦脊髓炎病毒、小鼠輪狀病毒(mouse rotavirus，MRV)、Reo3、LCMV、HV、MHV、MNV的檢測引物，檢測3份RNA病毒的盲樣；49-9為小鼠肝勻漿，使用MHV以及小鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(lactate dehydrogenase hypertrophic virus，LDV)引物進行篩查。引物序列如表1所示。其中TMEV[2]、LCMV[3]、HV[4]、MHV[5]、MNV[6-7]為文獻中記錄的方法，MRV、Reo3、LDV為實驗室設(shè)計未發(fā)表的引物。TMEV、Reo3、MHV為探針法熒光定量PCR方法；HV為染料法熒光定量PCR方法；MNV既有熒光定量PCR方法，也有PCR方法；LCMV為巢式PCR方法；MRV、LDV為PCR方法。

表1 盲樣檢測使用的引物序列Table 1 Primers used in blind samples detection

1.3.3盲樣核酸的病毒篩查：TMEV、Reo3、MHV熒光定量PCR檢測使用的反應(yīng)體系為：2×Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L的探針0.25 μL，模板2 μL，無RNA酶水3.75 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 孵育2 min；95 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)，在每個循環(huán)的第二步反應(yīng)收集熒光信號。

HV檢測使用染料法熒光定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s，40 個循環(huán), 在每個循環(huán)的第三步反應(yīng)收集熒光信號，最后進行溶解曲線分析。

MNV檢測用Q-PCR方法，使用染料法熒光定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán), 在每個循環(huán)的第三步反應(yīng)收集熒光信號，最后進行溶解曲線分析。

LCMV檢測為巢式PCR方法，第一輪反應(yīng)以引物LCMV-1638F和LCMV-1010C進行擴增，退火溫度為55 ℃，第二輪反應(yīng)以LCMV-1010C和LCMV-1696F為引物進行擴增，退火溫度為55 ℃。MRV、LDV、MNV進行PCR方法檢測時，退火溫度均為55 ℃。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，陽性產(chǎn)物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測序鑒定。

使用上述方法對盲樣49-1、49-4、49-8、49-9進行檢測，同時每種方法設(shè)立以水為模板的陰性對照。LCMV、HV、TMEV、Reo3、MNV、MHV等檢測方法使用相應(yīng)的病毒核酸作為陽性對照對方法進行確認。

1.3.449-4樣本的再次鑒定：將剩余的49-4盲樣樣本進行10倍稀釋后，使用病毒RNA提取試劑盒提取RNA后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 49-4B。使用引物MNVPF和MNVPR進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，陽性結(jié)果由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測序鑒定。

1.3.5不同試劑盒提取核酸的對比：將MNV陰性的小鼠盲腸內(nèi)容物樣本用無菌PBS分別進行4、8、16、32倍體積稀釋后振蕩混勻，將MNV病毒培養(yǎng)液使用無菌PBS進行10倍稀釋，制備成100～10-4的病毒稀釋液，將每個稀釋梯度的盲腸樣本和病毒稀釋液進行1∶1混合后分別使用RNA/DNA提取試劑盒和病毒RNA提取試劑盒提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA后-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時將PBS與100～10-4的病毒稀釋液進行1∶1混合后作為對照樣品，使用兩種試劑盒提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA后-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肕NV Q-PCR檢測方法檢測cDNA中MNV的核酸濃度。

1.3.6不同稀釋度的盲腸內(nèi)容物使用病毒核酸DNA/RNA提取試劑盒檢測：將使用無菌PBS進行4倍稀釋的小鼠盲腸內(nèi)容物樣本與100稀釋的MNV病毒原液1∶1混合后，再使用PBS進行1∶4、1∶8倍比稀釋分別得到A1∶16稀釋樣本和A1∶32稀釋樣本，使用RNA/DNA病毒核酸提取試劑盒提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA后-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用MNV Q-PCR檢測方法檢測cDNA中MNV的核酸濃度。

2 結(jié)果

2.1 49-1的檢測

使用TMEV Q-PCR方法對49-1、49-4、49-8、49-9樣本進行檢測時，檢測出49-1有S型擴增曲線，49-4、49-8、49-9無擴增曲線(圖1)，CT值為18.23，故盲樣49-1為TMEV陽性樣本。

注：1：49-1；2：49-4；3：49-8；4：49-9；5：陰性對照；6：陽性對照Note：1：49-1；2：49-4；3：49-8；4：49-9；5：Negative control；6：Positive control圖1 TMEV檢測結(jié)果Fig.1 Detection result of TMEV

2.2 49-8的檢測

使用MRV PCR方法檢測49-4、49-8、49-9時，49-8呈現(xiàn)397 bp的特異性條帶(圖2)。將PCR產(chǎn)物進行測序后在NCBI上比對，與發(fā)現(xiàn)于美國的MRV ETD株的同源性為99%，故49-8為MRV陽性樣本。

注：M：100 bp DNA Ladder；1：49-4；2:49-8；3:49-9；N：陰性對照Note：M：100 bp DNA Ladder；1：49-4；2:49-8；3:49-9；N：Negative control圖2 MRV檢測結(jié)果Fig.2 Detection result of MRV

2.3 49-9的檢測

使用MHV、LDV檢測方法檢測49-9，LDV PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)出223 bp的特異性條帶(圖3)。將PCR產(chǎn)物進行測序后在NCBI上比對，與LDVORF1a基因的同源性為96%，故49-8為LDV陽性樣本。

注：M：100 bp DNA Ladder；1：49-9；N：陰性對照Note：M：100 bp DNA Ladder；1：49-9；N：Negative control圖3 LDV檢測結(jié)果Fig.3 Detection result of LDV

2.4 49-4的檢測

使用TMEV、Reo3、HV、MNV、MHV、LCMV等方法檢測49-4，均未出現(xiàn)陽性擴增曲線，使用MNV PCR方法檢測49-4，PCR產(chǎn)物出現(xiàn)較多非特異性擴增條帶，陽性條帶不明顯。使用MNV PCR方法檢測1.3.4中得到的49-4B，PCR產(chǎn)物出現(xiàn)特異187 bp的特異性條帶(圖4)，PCR產(chǎn)物測序后與美國的MNV GV株的同源性為98.62%，故49-4為MNV陽性樣本。

M：100 bp DNA Ladder；1：49-4B；N：陰性對照M：100 bp DNA Ladder；1：49-4B；N：Negative control圖4 MNV檢測49-4B結(jié)果Fig.4 Detection result of MNV for sample 49-4B

2.5 不同試劑盒提取核酸的檢測結(jié)果

將10倍梯度稀釋的病毒培養(yǎng)液和倍比稀釋的小鼠盲腸樣本1∶1混合后，分別使用兩種試劑盒RNA提取后進行MNV Q-PCR檢測，檢測結(jié)果如圖5、6所示。比較發(fā)現(xiàn)病毒DNA/RNA提取試劑盒提取糞便樣本中的MNV RNA時，對后續(xù)的Q-PCR檢測結(jié)果影響較大。

注：橫坐標為混合的污染樣本中病毒的稀釋倍數(shù)，縱坐標為熒光定量PCR檢測的拷貝數(shù)Note:The abscissa is the dilution ratio of virus in the mixed contaminated samples, and the ordinate is the copy number detected by fluorescence qPCR圖5 使用病毒DNA/RNA試劑盒提取RNA后進行MNV檢測Fig.5 Performed MNV detection with virus DNA/RNA extract kit

注：橫坐標為混合的污染樣本中病毒的稀釋倍數(shù)，縱坐標為熒光定量PCR檢測的拷貝數(shù)Note:The abscissa is the dilution ratio of virus in the mixed contaminated samples, and the ordinate is the copy number detected by fluorescence qPCR圖6 病毒RNA提取試劑盒提取RNA后進行MNV檢測Fig.6 Performed MNV detection with virus RNA extract kit

病毒原液的MNV濃度為3.13×106copies/μL，使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取時在病毒10-2倍稀釋即病毒核酸濃度為3.13×104copies/μL時，盲腸樣本進行1∶4、1∶6、1∶16、1∶32倍體積比稀釋時都能獲得較好的結(jié)果，當盲腸樣本進行不高于16倍的體積稀釋時，對樣本中的高濃度病毒樣本的檢測會出現(xiàn)較大偏差，盲腸樣本進行32倍的體積稀釋后，對MNV的核酸檢測結(jié)果影響較小。統(tǒng)計分析病毒原液對照和盲腸樣本1∶32倍稀釋后的檢測結(jié)果，無顯著差異(P>0.05)。

使用病毒RNA提取試劑盒對后續(xù)的Q-PCR檢測結(jié)果影響較小。盲腸內(nèi)容物樣本在稀釋度為1∶8時病毒核酸檢測的偏差最小。統(tǒng)計分析病毒原液對照和盲腸樣本1∶8稀釋后的檢測結(jié)果，無顯著差異(P>0.05)。

2.6 不同稀釋度的盲腸內(nèi)容物使用RNA/DNA提取試劑盒檢測結(jié)果

將1∶4稀釋的盲腸內(nèi)容物樣本與不同梯度稀釋的MNV病毒液1∶1混勻后再使用無菌PBS進行4倍和8倍稀釋，使用病毒DNA/RNA試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用MNV Q-PCR檢測，結(jié)果如圖7所示。盲腸內(nèi)容物樣本中的病毒核酸經(jīng)16倍稀釋及32倍稀釋后進行核酸提取，檢測得到的結(jié)果與病毒對照的檢測結(jié)果相差不大，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)無顯著差異(P>0.05)。

注：橫坐標為混合的污染樣本中病毒的稀釋倍數(shù)，縱坐標為熒光定量PCR檢測的拷貝數(shù)Note:The abscissa is the dilution ratio of virus in the mixed contaminated samples, and the ordinate is the copy number detected by fluorescence qPCR圖7 MNV污染的盲腸內(nèi)容物樣本倍比稀釋后檢測結(jié)果Fig.7 Detection result of multiple dilution of MNV contaminated cecum content samples

3 討論

鑒于ICLAS提供的盲樣主要是檢測病毒抗原，PCR檢測方法作為病毒抗原檢測首選方法具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。而熒光定量PCR方法較傳統(tǒng)PCR方法來說進一步提高了靈敏度，染料法熒光定量PCR和探針法熒光定量PCR各有其優(yōu)缺點。探針法熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，然而MNV、出血熱病毒等病毒核酸的單核苷酸多態(tài)性較高，探針法熒光定量PCR方法的建立和應(yīng)用就存在局限性。染料法熒光定量PCR具有靈敏度的優(yōu)點，且相對于探針法來說，僅使用兩對引物進行檢測，有利于MNV、出血熱病毒等單核苷酸多態(tài)性較高病毒的檢出。ICLAS主要委托國際上的動物病毒檢測機構(gòu)制備盲樣，病毒來源多樣，病毒單核苷酸多態(tài)性較高的病毒最好使用PCR或者染料法熒光定量PCR法的通用引物進行檢測。

由于ICLAS提供盲樣時，并未對盲樣的檢測范圍有規(guī)定，且盲樣量有限，因此分析盲樣樣品種類，有針對性的進行病毒篩查十分有必要。比如盲樣49-8來源于小鼠小腸組織，則首先篩查MRV。MRV屬于呼腸病毒科，輪狀病毒屬，病毒經(jīng)口腔感染3日齡小鼠后3 h病毒可在胃、小腸和大腸中檢出，24 h肝、肺、脾、和血液中也可檢出病毒，30 h大腦、膀胱和尿液中也有病毒存在。LCMV可出現(xiàn)在感染動物的所有器官，但一般使用腦、肝組織進行病毒分離，HV一般在感染動物的腦、肺、腎等組織中分離病毒，Reo3、TMEV、MNV主要在小鼠糞便中檢測病毒。經(jīng)過鑒定，收到的4份盲樣，49-1為TMEV，49-4為MNV，49-8為MRV，49-9為LDV。

在對盲樣49-4的檢測過程中發(fā)現(xiàn)使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取核酸對后續(xù)的MNV檢測有影響。Q-PCR的擴增曲線異常、PCR產(chǎn)物電泳條帶非特異擴增明顯且測序得不到陽性結(jié)果。本實驗使用MNV陰性小鼠盲腸內(nèi)容物和MNV病毒培養(yǎng)物進行模擬實驗，結(jié)果顯示病毒DNA/RNA提取試劑盒提取核酸對低于1∶16倍稀釋的的盲腸內(nèi)容物中高濃度MNV檢測有影響，其Q-PCR擴增曲線為非S曲線的異常曲線，而盲腸內(nèi)容物進行1∶32稀釋后對各種濃度的MNV檢測均無影響。參考文獻中感染MNV小鼠的小鼠糞便中MNV的拷貝數(shù)一般在105～106copies，故實驗總結(jié)出糞便樣本中MNV檢測時最好選取病毒RNA提取試劑盒，或者樣本使用PBS進行體積比1∶16倍稀釋后使用病毒DNA/RNA提取試劑盒進行核酸提取。

本實驗僅使用兩種試劑盒作為代表進行了盲腸內(nèi)容物樣本的MNV核酸提取實驗，兩種試劑盒都是離心柱法，結(jié)合其實驗結(jié)果，可能是高濃度的盲腸樣本中的物質(zhì)經(jīng)過不同的離心柱膜純化后的成分不同，進而影響了實驗結(jié)果。田勝男等[8]在比較Trizol法和QIAamp Viral RNA Mini Kit法提取不同樣品中的MNV RNA時，使用Trizol法提取的小腸組織RNA進行PCR實驗不能得到特異的擴增條帶。是否是腸液中的某些成分對Trizol法和DNA/RNA離心柱法提取RNA時有影響還需要進一步的實驗進行研究。一些研究顯示，腸液中的某些黏液有可能對病毒提供保護作用，這也可能導(dǎo)致腸液濃度大時對病毒RNA的提取效率[9]。本實驗僅分別使用了一種試劑盒，是否有可能是病毒DNA/RNA提取試劑盒相對于病毒RNA提取試劑盒不同的原理造成了RNA提取的不同結(jié)果，還需要進一步的實驗研究。

經(jīng)過此次國際比對能力驗證，對收到的4份病毒病原盲樣上報了實驗結(jié)果后獲得100%滿意的結(jié)果，對實驗室病毒檢測能力進行了自我評估，說明病毒檢測鑒定能力可靠，檢測人員水平合格。MNV盲腸內(nèi)容物污染模擬實驗確定了實驗室檢測MNV的最佳策略，提高了實驗人員對樣品檢測前的處理工作對實驗結(jié)果影響的認識，說明參加ICLAS-PEP計劃對提高和保障實驗室檢測水平有重要意義。