馮天瑞，嚴維剛

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 泌尿外科，北京 100730)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是目前全球男性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]，在美國男性惡性腫瘤發(fā)病率中居首位。雖前列腺癌在中國的發(fā)病率低于西方國家，但近年來也呈逐年升高趨勢，已成為男性泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤[2]。盡管大部分早期前列腺癌預(yù)后較好，但目前的治療方法仍對發(fā)生局部進展和遠處轉(zhuǎn)移的PCa治療效果有限。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程頗為復雜，許多相關(guān)分子生物學機制尚未明確。因此研究PCa的發(fā)生、發(fā)展機制對早期診斷及指導PCa治療有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)是一類通過反向剪接(back-splicing)形成的共價閉合環(huán)狀RNA分子。近年來，隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)和生物信息學算法的發(fā)展，越來越多的circRNAs被發(fā)現(xiàn)并揭示其功能。環(huán)狀RNA在腫瘤細胞增殖、凋亡、 血管生成及轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮著重要調(diào)控作用。circRNAs較其他線性RNA有著更高的穩(wěn)定性且可被檢出， 無論是其在腫瘤形成過程中的作用或是作為腫瘤診斷和治療的潛在標志物和治療靶點都有著巨大的研究潛力[3]。

1 CircRNAs的功能

1.1 CircRNAs調(diào)控microRNAs

MicroRNAs(miRNAs)是一類重要的基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，其在幾乎所有的人類惡性腫瘤的發(fā)病機制中均有涉及。自ciRS-7 (circular RNA sponge for miR-7)[4]的相關(guān)研究發(fā)表以來，關(guān)于circRNAs通過miRNA結(jié)合位點發(fā)揮海綿吸附作用調(diào)節(jié)miRNAs的研究一直是circRNAs功能研究的熱點。事實上circRNAs可能并不僅限于通過包含多個單種miRNA的結(jié)合位點來發(fā)揮miRNA海綿作用，也可能作為多種不同的類型的miRNA海綿，分別調(diào)控多種miRNAs及整個miRNA家族以完成其功能[5]。此外，與上述的miRNA海綿機制不同，ciRS-7還可在神經(jīng)元中通過調(diào)節(jié)miR-7穩(wěn)定性或其運輸進而調(diào)節(jié)其靶基因而發(fā)揮功能[6]。

1.2 CircRNAs與蛋白質(zhì)結(jié)合

除了對miRNA的海綿吸附作用以外，circRNAs可通過其所含有的若干RNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點與相關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)生海綿作用并調(diào)節(jié)基因表達。例如在人宮頸癌(HeLa)細胞系中，circ-PABPN1可以通過與RNA結(jié)合蛋白Hu-antigen R (HuR)作用而抑制PABPN1基因翻譯[7]。除海綿作用外，部分circRNAs還可以通過調(diào)節(jié)蛋白之間的反應(yīng)而發(fā)揮作用。如circFoxo3可發(fā)揮“腳手架”功能同時結(jié)合p53及MDM2蛋白以促進MDM2介導的對p53的泛素化作用以使其失活[8]。

1.3 CircRNAs調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄及剪接

與上述的circRNAs多在細胞質(zhì)中發(fā)揮功能不同， circRNAs還可于細胞核中在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達。某些circRNAs如ci-ANKRD52可通過與RNA聚合酶Ⅱ作用的方式調(diào)節(jié)其親本基因ANKRD52轉(zhuǎn)錄；EIciRNAs (exon-intron circRNAs)則可通過U1 snRNP依賴的方式促進其親本基因的轉(zhuǎn)錄；關(guān)于circMBL與MBL/MBNL1的研究則證明了circRNAs可以通過與傳統(tǒng)線性剪接競爭調(diào)控基因表達[9]。

1.4 CircRNAs與蛋白翻譯

由于缺乏傳統(tǒng)翻譯過程中所需的5′端帽結(jié)構(gòu)和3′端poly(A)尾結(jié)構(gòu)，circRNAs通常被認為是一種非編碼RNA，但是現(xiàn)已有多項研究表明擁有內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry sites,IRESs)的人工circRNAs可以進行翻譯[10]。盡管有研究發(fā)現(xiàn)有數(shù)千種circRNAs包含可能的開放閱讀框(0RF)及上游IRES并具有編碼蛋白質(zhì)的潛能[11]，目前僅有circ-ZNF609， circMBL，circFBXW7等少數(shù)幾種內(nèi)源性circRNAs已被研究證明具有翻譯的能力[10]。關(guān)于circRNAs蛋白翻譯的研究仍需進一步深入探索。

2 前列腺癌領(lǐng)域的circRNAs相關(guān)研究進展

2.1 CircRNAs 在前列腺癌中的表達

有研究對比了正常前列腺組織與局限性原發(fā)前列腺癌組織，發(fā)現(xiàn)在兩種組織中652種circRNAs表達量存在差異[3]，其中絕大多數(shù)(629種)在腫瘤組織中下調(diào)且不能完全用其親本基因的表達下調(diào)而解釋。進一步的研究則表明腫瘤組織中circRNAs的分子數(shù)目(circRNAs豐度)與細胞的增殖能力呈負相關(guān)。另一項研究分析了4種前列腺癌細胞系(LNCaP、V16A、22Rv1、PC-3)中共計25 036種circRNAs[12]，發(fā)現(xiàn)其中絕大部分circRNAs的豐度低于其同源線性RNAs，但有127種circRNAs的豐度顯著高于其同源線性RNAs，而具有更加極端(過高或過低)的circRNAs分布的患者往往有著更差的預(yù)后。關(guān)于PCa細胞系中豐度最高的circRNAs和其對應(yīng)的線性RNAs的研究則表明有11.3%的circRNAs在至少一種細胞系中為必需，而絕大多數(shù)(91.8%)必需circRNAs的同源線性對應(yīng)則并非必需，這表明circRNAs調(diào)控細胞增殖的能力與其線性對照無關(guān)。從上述研究可以看到前列腺癌組織中有著豐富的circRNAs表達且與正常前列腺組織存在差異，對其的進一步研究有利于揭示前列腺癌發(fā)生發(fā)展的過程并提供新的可能的治療靶點。

2.2 CircRNAs與前列腺癌的增殖和進展

2.2.1 調(diào)控microRNAs：CircZNF609在前列腺癌組織中高表達并可以負性調(diào)節(jié)miR-186-5p，而沉默circZNF609可以通過circZNF609/miR-186-5p/YAP1/AMPK通路促進前列腺癌細胞的增殖及侵襲[13]。Hsa_circ_0001206在前列腺組織中表達顯著下調(diào)，其可通過與miR-1285-5p結(jié)合的方式通過hsa_circ_0001206/miR-1285-5p/Smad4信號通路在體外和體內(nèi)抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲及腫瘤生長[14]。CircAMOTL1L可以作為miR-193a-5p的海綿，通過circAMOTL1L/miR-193a-5p/Pcdha軸抑制前列腺癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和遷移及侵襲過程[15]，而p53可直接激活RBM25的表達，進而間接促進circAMOTL1L的形成。CircABCC4在前列腺癌組織及細胞系中均表達上調(diào)，且其可作為miR-1182的海綿上調(diào)FOXP4表達以促進前列腺癌進展[16]。

與以上研究中circRNAs主要發(fā)揮海綿作用調(diào)控miRNAs不同， circCSNK1G3為多種前列腺癌細胞系所必須，而其可以通過miRNAs穩(wěn)定機制與miR-181b/d協(xié)同調(diào)控CBX7(一種前列腺癌中的腫瘤抑制因子)以調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖能力[12]。

2.2.2 調(diào)控蛋白及信號通路：Circ-102004在前列腺癌組織中表達顯著升高，其可通過調(diào)節(jié)EPK,JNK,Hedgehog,及Wnt/β-catenin等信號通路促進前列腺癌細胞增殖和侵襲，抑制其凋亡，并促進腫瘤在動物模型體內(nèi)生長[17]。Circ0005276可以通過與RNA結(jié)合蛋白FUS作用而激活其親本X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP) 基因表達，從而促進前列腺癌細胞增殖與遷移[18]。

2.3 CircRNAs與前列腺癌耐藥

雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy,ADT)是治療進展期前列腺癌，特別是轉(zhuǎn)移性前列腺癌最重要的手段之一。但隨著病情進展，往往會發(fā)生耐藥并最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?castration resistant prostate cancer,CRPC)。即便阿比特龍(abiraterone)、恩雜魯胺(enzalutamide,Enz)等新型抗雄藥物的出現(xiàn)延緩了這一進程，絕大多數(shù)患者發(fā)生耐藥無可避免。雄激素受體(androgen receptor,AR)剪接變體(AR splice variants,AR-Vs)的出現(xiàn)是導致CRPC的重要原因之一[19]，表達AR-V7(androgen receptor splice variant-7)的患者往往對阿比特龍及恩雜魯胺耐藥且AR-V7高表達患者較其他CRPC患者生存期更短[20]，而環(huán)狀RNA可能參與了這一過程。CircRNA17在CRPC C4-2恩雜魯胺耐藥(EnzR-C4-2)細胞系中較恩雜魯胺敏感(EnzS-C4-2)細胞系表達降低；而在EnzS-C4-2細胞系中抑制circRNA17表達可提高AR-V7表達，并導致Enz耐藥和腫瘤細胞侵襲[21]。CircRNA17可通過正向調(diào)節(jié)miR-181c-5p表達影響AR-V7表達而發(fā)揮上述作用。此外，在前列腺癌細胞系中沉默circFoxo3會促進其增殖、侵襲，并增強對多西他賽的耐藥性，而外源性補充circFoxo3則可以增強荷瘤小鼠對多西他賽的敏感性并延長其生命[22]。由此可見對circRNAs的研究可以進一步揭示前列腺癌耐藥的發(fā)生機制，為延緩和避免耐藥發(fā)生提供新的切入點。

2.4 CircRNAs作為生物標志物

由于缺乏開放的末端結(jié)構(gòu)，circRNAs比它們的同源線性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更加穩(wěn)定并可以抵抗核糖核酸外切酶(RNase R)處理，同時其可以在前列腺癌患者的多種體液成分甚至尿液中被可靠檢測[3]，因此circRNAs是一種理想的前列腺癌潛在生物標志物。

AR基因的過表達及其可變剪接產(chǎn)物如AR-V7表達是CRPC形成及預(yù)后不良的生物標志。circAR3是一種前列腺組織特異的circRNA，其來源于AR基因，而血清中的circAR3水平可以正向反映原發(fā)腫瘤的Gleason評分以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況[23]。有研究[24]在47例轉(zhuǎn)移性去勢抵抗前列腺癌(mCRPC)組織標本中共篩選出了13種來源于AR基因的circRNAs(circARs)，其中豐度最高的4種circARs在CRPC組織中均表達上調(diào)。在CRPC組織中circARs的表達水平和線性AR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達水平顯著相關(guān)，因此circARs有潛力成為新型的mCRPC患者的生物標志物。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)circ-AURKA可作為前列腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的一種特征性標志物來鑒別癌的亞種[3]。

2.5 不同的聲音

雖然近兩年在前列腺癌領(lǐng)域涌現(xiàn)出的大量關(guān)于circRNAs的研究使得人們對circRNAs在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用有了更深入的了解，但也存在一些爭議。如兩項不同的探究circFoxo3在前列腺癌組織及細胞系中的表達及功能的研究對于前列腺癌組織和正常前列腺組織中circFoxo3表達的對比給出了相反的結(jié)論[22,25]。造成該差異結(jié)果的一個可能的解釋是其中一項研究開展于不同的標本中，而另一研究則對比了相同標本中的前列腺癌組織和正常組織。此外，前一研究認為沉默circFoxo3表達可以促進前列腺癌細胞增殖、侵襲并抑制其凋亡；而另一研究則認為circFoxo3發(fā)揮促癌功能，沉默其表達可顯著抑制前列腺癌細胞增殖并促進其凋亡。即便兩者的實驗方法和細節(jié)存在諸多差異，但是從相反的結(jié)果看出目前關(guān)于circRNAs的研究仍存在一定的局限，對其研究的深度尚淺，有待在此領(lǐng)域進一步探索。

3 問題與展望

得益于高通量RNA測序技術(shù)及生物信息學的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明過去被認為是轉(zhuǎn)錄錯誤而形成的circRNAs其實在包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病進程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，其獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及特性也使其成為了一種理想的潛在生物標志物。CircRNAs在前列腺癌領(lǐng)域的研究讓人們對前列腺癌發(fā)生發(fā)展及耐藥產(chǎn)生等機制有了更深入的認識，并為以后的前列腺癌治療提供了新的可能的方向。但是目前對于circRNAs的功能及相關(guān)機制的研究仍處于開始階段，存在許多尚未解決的問題，且距離臨床應(yīng)用仍存在一定距離。同時一些研究的結(jié)果及其解釋也存在著矛盾和爭議，有待更深入的研究來解答?？偠灾?，鑒于circRNAs在惡性腫瘤領(lǐng)域廣闊的研究前景和潛力，相信后續(xù)關(guān)于circRNAs的研究可以為從前列腺癌到其他惡性腫瘤的診治提供新的策略。