魏 振，王秋玲，石繼超，龍 淼 *

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2.明康匯生態(tài)農(nóng)業(yè)集團(tuán)，安徽明光 239462；3.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng) 110001)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又稱(chēng)F-2毒素，是一種由鐮刀菌產(chǎn)生的非甾體類(lèi)真菌毒素，常存在于受鐮刀菌污染的谷物中(小麥、玉米、燕麥和大麥等)。ZEN的污染對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和食品安全有很大的影響，食用受ZEN污染的飼料的動(dòng)物會(huì)受到腫瘤、雌激素和免疫抑制作用的不利影響，這些過(guò)度或持續(xù)性的作用會(huì)導(dǎo)致體重減輕，并增加由免疫抑制和生殖障礙引起的疾病發(fā)展[1]。真菌毒素是真菌的天然次生代謝產(chǎn)物，估計(jì)約25%的相關(guān)食品受到真菌毒素的污染，這些真菌落在谷物上，會(huì)在收獲前的田地中或收獲后不適當(dāng)?shù)膬?chǔ)藏條件下有真菌污染而產(chǎn)生并積累的[2-3]。如果這些受污染的谷物商品進(jìn)行貿(mào)易，就有助于ZEN在全球的擴(kuò)散。

Zhou Y等[4]通過(guò)研究表明，ZEN不止影響雌性的生殖能力，還會(huì)影響到其后代的生殖能力；使雄性F1后代的精液質(zhì)量和精子數(shù)量明顯下降，畸形率顯著增加，睪丸激素水平顯著降低。王宗捷等[5]通過(guò)試驗(yàn)得出ZEN呈劑量依賴(lài)性抑制了山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖，并且隨著ZEN劑量的增加細(xì)胞的凋亡比例明顯上升，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)通路相關(guān)分子和蛋白表達(dá)量的研究表明，ZEN是通過(guò)ERS通路來(lái)調(diào)控山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。Cai G D等[6]從小鼠原代脾淋巴細(xì)胞中分離出T淋巴細(xì)胞，經(jīng)伴刀豆球蛋白激活后，接觸不同濃度的ZEN可降低激活的T淋巴細(xì)胞活力，可以使T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)和表面超微結(jié)構(gòu)損傷，抑制了CD25和CD278的表達(dá)，從而抑制了效應(yīng)分子孔蛋白(poreforming protein，PFP)、顆粒酶A(granzyme A，GZMA)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的合成，同時(shí)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡，并且伴有MAPK通路的過(guò)度激活，這說(shuō)明ZEN能通過(guò)誘導(dǎo)MAPK通路的激活促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。

動(dòng)物在食用受ZEN污染的飼料后，不僅會(huì)降低動(dòng)物的生殖能力、生產(chǎn)力、免疫力，而且ZEN還能殘留在動(dòng)物的組織中對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[7]。大部分的玉米赤霉烯酮類(lèi)化合物能夠通過(guò)尿液和糞便排出體外，但也有一小部分通過(guò)乳汁排出[8]。ZEN污染嚴(yán)重、波及范圍廣闊，無(wú)論是對(duì)人的健康還是動(dòng)物的健康都有嚴(yán)重的影響，所以對(duì)谷物、動(dòng)物性食品、動(dòng)物飼料原料及飼料成品進(jìn)行ZEN的檢測(cè)極為重要。

1 國(guó)內(nèi)外對(duì)ZEN檢測(cè)限量

我國(guó)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078.2-2006)要求，配合飼料、玉米中的ZEN含量不超過(guò)500 μg/kg。我國(guó)修訂的《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078-2017)要求，青年母豬、仔豬配合飼料中ZEN的限量為100 μg/kg和150 μg/kg，飼料原料中ZEN限量在0.5 mg/kg～1.5 mg/kg之間。食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)(Joint expert committee on food additives，JECFA)已將ZEN的最大可耐受日攝入量(TDI)定為0.5 μg/kg體重，而歐洲食品安全局(European food safety agency，EFSA)已將該數(shù)字降至0.025 μg/kg體重[9]。歐盟法規(guī)856/2005已將嬰兒食品中ZEN的最高殘留量設(shè)定為20 μg/kg[10]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于ZEN的限量越來(lái)越嚴(yán)格，研制較為迅速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中具有重要意義。

2 檢測(cè)方法

2.1 免疫分析法

Yin M Q等[11]以膠體金和廣譜單克隆抗體為基礎(chǔ)，結(jié)合玉米赤霉醇及其5種類(lèi)似物，建立了一種競(jìng)爭(zhēng)性的流式免疫分析(lateral flow immunochromatographic assay，LFIA)，用來(lái)專(zhuān)門(mén)測(cè)定家畜體內(nèi)生長(zhǎng)促進(jìn)劑玉米赤霉醇的殘留量，該方法可以在10 min內(nèi)得到結(jié)果，能做到快速、同時(shí)半定量、定量檢測(cè)牛乳中玉米赤霉醇及其5種類(lèi)似物的殘留量。另外，利用這種方法測(cè)試了其他真菌毒素和生長(zhǎng)促進(jìn)劑，結(jié)果表明試紙條的靈敏度非常高，沒(méi)有出現(xiàn)交叉反應(yīng)，說(shuō)明該測(cè)試條具有高度的特異性。Wang J N等[12]針對(duì)ZEN設(shè)計(jì)了一種基于ssCo3O4的高靈敏度阻抗免疫分析方法，可啟動(dòng)信號(hào)放大，阻抗信號(hào)隨著ZEN濃度對(duì)數(shù)的增加而增加，該免疫測(cè)定法對(duì)ZEN具有很高的敏感性，阻抗信號(hào)在0.1 fg/mL～10 pg/mL范圍內(nèi)隨ZEN濃度的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性增加，檢出限為3.30×10-14mg/mL。通過(guò)多巴胺(DA)在AuNPs表面的氧化自聚合反應(yīng)，合成了聚多巴胺涂層金納米顆粒(Au@PDAs)，Xu S L等[13]首次提出將其作為玉米中ZEN的LFIA檢測(cè)的信號(hào)放大標(biāo)簽，通過(guò)LFIA檢測(cè)，檢出限為7.4 pg/mL，該方法中聚多巴胺層以適當(dāng)?shù)暮穸韧扛苍诮鸺{米顆粒上之后，聚多巴胺涂層金納米顆粒變得更穩(wěn)定地分散在溶液中并且不容易聚集，而且其顏色強(qiáng)度也比金納米顆粒的顏色強(qiáng)度強(qiáng)，用于LFIA中可以提高靈敏度。Li M等[14]研發(fā)了磁珠免疫分析偶聯(lián)生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)(BAS-MBI)，該方法的檢測(cè)限為0.098 ng/mL，工作緩沖液的最大半數(shù)抑制濃度為0.71 ng/mL，檢測(cè)限為0.98 ng/g，農(nóng)業(yè)樣品檢測(cè)范圍為0.98 ng/g～51.6 ng/g，結(jié)果表明BAS-MBI是一種快速、靈敏、特異和準(zhǔn)確用來(lái)測(cè)定ZEN的有效方法。

免疫色譜分析(immunochromatographic analysis，ICA)是生物分析方法中最常用、最成熟的免疫分析法，它具有快速、特異性好、高通量、方便、低成本等特點(diǎn)，由于其可獨(dú)立于實(shí)驗(yàn)室且具有成本效益的免疫分析方法，ICA非常適合于不同基質(zhì)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但是傳統(tǒng)的免疫分析法通常只對(duì)樣品中的單一目標(biāo)分析物進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)分析物的同時(shí)檢測(cè)，所以，能建立一種同時(shí)檢測(cè)同一樣品中的多個(gè)目標(biāo)分析物且具有省時(shí)、低成本和高通量篩選的優(yōu)勢(shì)免疫分析法具有重要的意義[15]。Xu Y等[16]建立了一種基于納米銪(europium nanoparticles,EuNPs)的雙熒光免疫層析法(DF-ICA)，用于同時(shí)檢測(cè)玉米樣品中的橘霉素(citrinin，CIT)和ZEN。優(yōu)化后，同時(shí)測(cè)定CIT和ZEN的檢出限為0.06 ng/mL和0.11 ng/mL，半數(shù)抑制濃度為0.35 ng/mL和0.76 ng/mL，加標(biāo)回收率分別為86.3%～111.6%和86.6%～114.4%。Sun S J等[17]成功開(kāi)發(fā)了一種時(shí)間分辨熒光免疫色譜分析法(TRFICA)，用于中草藥中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)和ZEN同時(shí)定性和定量檢測(cè)。該方法中具有獨(dú)特光學(xué)特性的Eu-納米球(EuNPs)提高了免疫色譜分析的穩(wěn)定性和靈敏度。在最佳條件下，已建立的TRFICA對(duì)于AFB1的線(xiàn)性范圍為0.60 μg/kg～3.92 μg/kg，ZEN的線(xiàn)性范圍為0.40 μg/kg～1.28 μg/kg。結(jié)果證明該方法是一種同時(shí)快速、靈敏的定量檢測(cè)真菌毒素的方法。

2.2 分子印跡固相萃取

分子印跡技術(shù)是采用人工方法，針對(duì)待測(cè)分子(模板分子)所帶的官能團(tuán)和空間結(jié)構(gòu)，利用有機(jī)化合物(功能單體)和交聯(lián)劑的物理和化學(xué)性質(zhì)制備與待測(cè)分子專(zhuān)一性結(jié)合，含有特定空間結(jié)構(gòu)孔穴的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)的技術(shù)[18]。MIP具有預(yù)定性、特異識(shí)別性、實(shí)用性、良好穩(wěn)定性等特點(diǎn)，因此在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[19]。

Zhang Y等[20]以2，4，6-三丙烯酰胺基-3，5-三嗪(TAT)為功能單體成功合成出新型磁性表面分子印跡聚合物，并將其用于ZEN的富集和測(cè)定中，首次報(bào)道了ZEN在小麥中的分子印跡。該方法對(duì)ZEN的檢出限量為0.55 ng/g，回收率為92.1%～96.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.4%，成功地應(yīng)用于加標(biāo)小麥樣品中。Nolan P等以金屬有機(jī)骨架MIL-101為支撐核，香豆素-3-羧酸為ZEN的假模板，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸羥乙酯為交聯(lián)劑合成印跡聚合物(MIL-101@MIPs)，以該聚合物作為固相萃取柱的吸附劑進(jìn)行樣品制備，用高效液相色譜-熒光檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)洗脫。該方法的線(xiàn)性范圍為6.25 ng/kg～250 ng/kg，檢出限為2.09 ng/kg～4.16 ng/kg，定量限為6.25 ng/kg～12.50 ng/kg，加標(biāo)回收率在81.70%～90.10%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.56%[21]。Shao M Y等[22]描述了一種環(huán)保、高效的一步法合成包裹分子印跡熒光淬滅顆粒(MIFQP)的碳量子點(diǎn)及其在谷物樣品中ZEN測(cè)定中的應(yīng)用研究，經(jīng)驗(yàn)證，這些熒光淬滅材料對(duì)ZEN的檢測(cè)范圍為0.02 mg/L～1.0 mg/L，檢測(cè)極限為0.02 mg/L。最后，MIFQP成功應(yīng)用于玉米中的ZEN測(cè)定，回收率從78%提升至105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于20%，這表明它在實(shí)際應(yīng)用中具有很大潛力。

2.3 QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

QuEChERS是快速(quick)、簡(jiǎn)單(easy)、廉價(jià)(cheap)、有效(effective)、穩(wěn)定(rugged)、安全(safe)的簡(jiǎn)稱(chēng)，是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部Anastassiades等于2003年提出的樣品前處理方法[23]。

Nualkaw K等[24]建立了一種簡(jiǎn)單的基于QuEChERS的方法加入穩(wěn)定同位素稀釋(13C-ISTD)，再通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定豬，家禽和奶制品中的17種霉菌毒素。平均回收率準(zhǔn)確度在70%～120%范圍內(nèi)，精密測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，檢測(cè)極限和定量極限分別為0.25 ng/g～40.0 ng/g和0.5 ng/g～100.0 ng/g。Choukri K M等[25]采用了基于QuEChERS的萃取和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)阿爾及利亞市場(chǎng)上的120份谷物樣品進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其可以同時(shí)檢測(cè)出多種真菌毒素。Facorro R等[26]基于(d)固相萃取和QuEChERS提取物組合的樣品前處理方法，結(jié)合液相色譜-高分辨率質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定20個(gè)奶牛場(chǎng)混合飼料中的26種真菌毒素，分析的所有樣本均顯示出2種或多種真菌毒素同時(shí)存在，其中ZEN、伏馬菌素B1和β-玉米赤霉烯醇反復(fù)出現(xiàn)，發(fā)生頻率為60%～90%。Rausch A K等[27]使用QuEChERS的提取方法，然后在不同條件下進(jìn)行兩次高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，得出谷物中相關(guān)的真菌毒素，定量限為0.05 μg/kg～150 μg/kg。該方法對(duì)大多數(shù)真菌毒素均具有良好的線(xiàn)性(R2> 0.99)，回收率(61%～120%)，可重復(fù)性(RSDr<15%)和再現(xiàn)性(RSDR<20%)。

2.4 生物傳感器

基于生物傳感器的ZEN檢測(cè)方法具有高靈敏、強(qiáng)特異性的特點(diǎn)，是近年來(lái)新興的有效檢測(cè)手段，作為ZEN檢測(cè)的前景替代方法，生物傳感器技術(shù)具有高專(zhuān)一性、高選擇性、便攜性以及實(shí)時(shí)分析的性能，具有可觀的發(fā)展前景[28]。

Nolan P等研究出一種質(zhì)量敏感微陣列生物傳感器，它由4×16個(gè)微型質(zhì)量敏感傳感器像素組成，基于固體安裝諧振器技術(shù)，可以利用納米點(diǎn)斑技術(shù)對(duì)傳感器表面單個(gè)像素進(jìn)行功能化處理，同時(shí)半定量檢測(cè)3種受調(diào)控的霉菌毒素T2毒素、ZEN和伏馬菌素B1(fumonisins，F(xiàn)umB1)。通過(guò)使用便攜式微流控設(shè)備對(duì)T2毒素、ZEN和FumB1進(jìn)行單次檢測(cè)的靈敏度分別為1.3 ng/mL、6.8 ng/mL和2.0 ng/mL；對(duì)T2毒素、FumB1和ZEN的多重檢測(cè)靈敏度分別為6.1 ng/mL、3.6 ng/mL和2.4 ng/mL[29]。Chen Y F等[30]開(kāi)發(fā)了一種基于大腸埃希氏菌的靈敏、方便的電化學(xué)生物傳感器，用于真菌毒素ZEN的毒性檢測(cè)。這是首次將大腸埃希氏菌用作檢測(cè)真菌毒素的識(shí)別元件。生物傳感器設(shè)計(jì)采用了兩步反應(yīng)策略，以消除介質(zhì)、分析物和緩沖液的相互干擾。上述生物傳感器在標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)中顯示出良好的靈敏度，并且在實(shí)際油樣分析中顯示出優(yōu)異的準(zhǔn)確性，檢出限為6 ng/mL，線(xiàn)性范圍0.05 μg/mL～0.5 μg/mL。Wei T等[31]使用基于自組裝單層膜的SPR傳感器芯片建立了表面等離子體共振(SPR)方法。結(jié)果顯示AFB1、曲霉毒素A、ZEN和脫氧炔諾醇的最低檢出限分別為0.59 ng/mL、1.27 ng/mL、7.07 ng/mL和3.26 ng/mL。將測(cè)試數(shù)據(jù)與HPLC-MS/MS確證分析結(jié)果進(jìn)行了比較，兩者之間具有很好的一致性。結(jié)果表明，該方法具有高靈敏度、高線(xiàn)性和特異性，可同時(shí)檢測(cè)4種真菌毒素，可以滿(mǎn)足谷物食品的檢測(cè)要求。

2.5 其他

Yin N等[32]建立了無(wú)酶熒光測(cè)定法用于測(cè)定ZEN，該方法結(jié)合了催化的發(fā)夾裝配(CHA)，接近銀納米簇(Ag NCs)的超高熒光發(fā)光富含G的DNA序列，以及使用適體(Apt)。在ZEN存在下，抑制序列(Inh)通過(guò)ZEN與Apt-T的適體的結(jié)合而從觸發(fā)適體序列(Apt-T)釋放。自由的Apt-T充當(dāng)一個(gè)開(kāi)關(guān)，可打開(kāi)發(fā)夾H1和H2生成H1-H2復(fù)合物。已釋放的Apt-T可用于觸發(fā)H1和H2之間的下一輪CHA。最后，H1與Ag NCs探針(P)之間的雜交使富含G的序列與P包裹的深色Ag NC緊密相鄰。這導(dǎo)致Ag NC的高效發(fā)光和在575 nm/628 nm處具有激發(fā)/發(fā)射峰的放大熒光的產(chǎn)生。在優(yōu)化條件下，可觀察到濃度為1.3 pg/mL～100 ng/mL的線(xiàn)性相關(guān)，檢出限為0.32 pg/mL。Xu J H等提出了一種新的金納米粒子在適配體官能化的雜化親和整體柱上，并用于通過(guò)液相色譜儀在線(xiàn)特異性識(shí)別ZEN。適體的超高覆蓋密度可以達(dá)到3 636 pmol/μL，對(duì)于獲得高特異性、低干擾的共存物質(zhì)的ZEN的有效分析，對(duì)ZEN的靈敏識(shí)別具有最低檢測(cè)限0.05 ng/mL。Ji X D等[34]首先合成出一種新型的納米金屬-有機(jī)配位聚合物納米載體(3D櫻花形銅離子(Ⅱ)@ L-谷氨酸(L-Glu))，3D櫻花形Cu@L-Glu與鈀-鉑納米粒子(Pd-PtNPs)結(jié)合后獲得的Cu@L-Glu /Pd-PtNPs可作為信號(hào)標(biāo)簽，用于ZEN的超靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限為0.45 fg/mL。Chen Y等[35]開(kāi)發(fā)出一種基于高靈敏度量子點(diǎn)的熒光猝滅側(cè)向流動(dòng)測(cè)定，用于ZEN的靈敏檢測(cè)。ZEN的熒光淬滅側(cè)向流動(dòng)測(cè)定的線(xiàn)性檢測(cè)范圍在0.78 ng/mL～25 ng/mL之間，檢出限為0.58 ng/mL。此外，熒光淬滅側(cè)向流動(dòng)測(cè)定顯示出高的回收率(83.1%～93.6%)，可用于檢測(cè)出摻入玉米樣品中的ZEN濃度。

3 展望

對(duì)于研究出新型的ZEN檢測(cè)方法具有可觀的發(fā)展前景。目前的檢測(cè)方法雖然能夠通過(guò)精密的儀器和精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確定量出目標(biāo)物質(zhì)的含量，但是檢測(cè)所用的設(shè)備較為昂貴，推廣難度較大；檢測(cè)的費(fèi)用較高，需要專(zhuān)業(yè)操作人員；樣品的前期處理時(shí)間長(zhǎng)、步驟繁瑣，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。而目前的快速檢測(cè)方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，但是反應(yīng)的靈敏度低，結(jié)果的準(zhǔn)確度低、假陽(yáng)性率高，達(dá)不到準(zhǔn)確分析和檢測(cè)的目的，所以仍然需要高靈敏度、高準(zhǔn)確性、操作簡(jiǎn)便快捷、能夠達(dá)到實(shí)時(shí)分析和低費(fèi)用要求的檢測(cè)方法。為了能更好地守護(hù)人類(lèi)及動(dòng)物的健康，對(duì)于檢測(cè)方法的創(chuàng)新和優(yōu)化就是重中之重。