李 璇，陳虹宇，姜 寧

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110161)

非洲錐蟲病是由布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)感染引起的一類人獸共患寄生蟲病，是世界衛(wèi)生組織(WHO)法定報(bào)告的寄生蟲病，嚴(yán)重威脅人的健康以及畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-3]。該病主要存在于撒哈拉以南非洲地區(qū)，但近幾年由于旅行及工作原因在我國(guó)出現(xiàn)了輸入性病例[4-5]。人類非洲錐蟲病也稱昏睡病，是由布氏岡比亞錐蟲和布氏羅得西亞錐蟲感染引起的，主要癥狀是嗜睡昏迷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[2]；動(dòng)物那加那病是由布氏錐蟲感染引起，主要癥狀是貧血、消瘦[3]。

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是一類小分子蛋白，分布廣泛，主要起氧化還原調(diào)節(jié)作用。Trx與硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸共同組成Trx系統(tǒng)。Trx系統(tǒng)是一種重要的抗氧化系統(tǒng)，可以清除寄生蟲蟲體自身和宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的的活性氧和活性氮，以減少其對(duì)蟲體的損傷[6]。迄今為止只在布氏錐蟲中發(fā)現(xiàn)1個(gè)Trx，具有氧化還原活性[7]，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Trx-putative及Trx-like含有與Trx一樣的“Tioredoxin-like super family”結(jié)構(gòu)域。因此其具有很高的研究?jī)r(jià)值，很可能成為新的藥物靶點(diǎn)蛋白。基于此，本研究對(duì)布氏錐蟲Trx-putative及Trx-like的抗氧化功能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株、質(zhì)粒和菌株 布氏錐蟲427株、pET-28a與pGEX-4T-1表達(dá)質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室保存； pEASY-Blunt Zero克隆質(zhì)粒、大腸埃希氏菌Trans1-T1 competent cells和BL21(DE3)competent cells，北京市全式金生物公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c小鼠，雌性SD大鼠(180 g～220 g)，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物公司。

1.1.4 主要儀器 PCR儀、Nanodrop 2000，Thermo公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；SDS-PAGE電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀，寧波心之生物公司產(chǎn)品；細(xì)胞壓力破碎儀，STANSTED公司產(chǎn)品；乳化機(jī)，Wiggen公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，TECAN公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀、正置熒光顯微鏡、倒置顯微鏡，德國(guó)LEICA公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；金屬浴，杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成 Trx-putative和Trx-like基因號(hào)分別為Tb427.04.2450和Tb427.05.950。利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)4對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，引物1和引物3與pET-28a載體連接，引物2和引物4與pGEX-4T-1載體連接(表1)。

表1 引物序列

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將布氏錐蟲427株接種Balb/c小鼠，傳3代，待毒力穩(wěn)定后收集并純化蟲體，具體操作步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以布氏錐蟲cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增Trx-putative和Trx-like基因，反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL cDNA、10 μL 2×Prime STAR Max Premix、1 μL上游引物、1 μL下游引物和6 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用膠回收試劑盒回收目的片段，并與pEASY-Blunt Zero克隆載體連接，轉(zhuǎn)入Trans1-T1細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆菌測(cè)序，通過(guò)雙酶切技術(shù)將Trx-putative和Trx-like基因分別與表達(dá)載體pET-28a和pGEX-4T-1連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21(DE3)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性菌測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化 將原核表達(dá)菌pET-28a/Trx-putative、pET-28a/Trx-like、pGEX-4T-1/Trx-putative、pGEX-4T-1/Trx-like分別劃線接種于含有對(duì)應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單菌落加到含有對(duì)應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，按1∶100的比例擴(kuò)大再培養(yǎng)，當(dāng)OD 600 nm值為0.6～0.8時(shí)取出菌液，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，在22 ℃條件下過(guò)夜誘導(dǎo)菌體表達(dá)His標(biāo)簽重組蛋白，在16 ℃條件下過(guò)夜誘導(dǎo)菌體表達(dá)GST標(biāo)簽重組蛋白，收集菌體并超聲破碎，使用Ni-Agarose Resin純化可溶性His標(biāo)簽重組蛋白，使用Glutathione-sepharose Resin純化可溶性GST標(biāo)簽重組蛋白，純化的重組蛋白使用PBS透析，再通過(guò)SDS-PAGE和Western blot對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 特異性抗性血清的制備 用純化的重組蛋白Trx-putative-His和Trx-like-His分別與弗氏佐劑等體積混合并充分乳化，100 μg/只經(jīng)皮下多點(diǎn)注射180 g～220 g的雌性SD大鼠，每個(gè)蛋白免疫接種3只大鼠。共免疫4次，2次免疫間隔14 d。初次免疫使用弗氏完全佐劑，之后用不完全佐劑。四免后8 d，對(duì)SD大鼠尾尖采血，分離血清。

通過(guò)間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，將Trx-putative-GST和Trx-like-GST蛋白質(zhì)分別用包被液稀釋至濃度為5 μg/mL，每孔150 μL，加到96孔酶標(biāo)板中，4 ℃過(guò)夜；倒凈孔內(nèi)液體，每孔200 μL PBST，放置4 min，洗3次；每孔150 μL 30 mg/mL BSA，37 ℃封閉2 h后用PBST洗滌；將免疫大鼠血清作為一抗，用PBST進(jìn)行稀釋，稀釋比例為1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000，陰性組加入健康大鼠血清，空白組加入PBST，每孔50 μL，37 ℃孵育1 h后用PBST洗滌；將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(1∶2 0000)作為二抗，每孔50 μL，37 ℃孵育1 h后用PBST洗滌；每孔100 μL TMB顯色液，室溫放置15 min，避光操作；每孔50 μL 2 mol/L硫酸，終止顯色；用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD 450 nm值，判定其血清效價(jià)，當(dāng)(待測(cè)血清OD 450 nm-空白組OD 450 nm)/(陰性血清OD 450 nm-空白組OD 450 nm)≥2.1時(shí)，特異性抗性血清可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 Real-time PCR分析目的基因轉(zhuǎn)錄水平 選取Tubulin作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)并合成Trx-putative、Trx-like以及Tubulin基因的real-time PCR引物，引物序列見(jiàn)表1中的引物對(duì)5～7。以體內(nèi)外不同環(huán)境培養(yǎng)的布氏錐蟲cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Green酶、0.8 μL 10 μmol/L上游引物、0.8 μL 10 μmol/L下游引物、0.4 μL RoxⅡ和6 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn) Balb/c小鼠體內(nèi)培養(yǎng)布氏錐蟲數(shù)天后，尾尖采血制備血涂片，用免疫組化筆確定試驗(yàn)區(qū)域，用冰冷的甲醇固定，PBS洗滌，加入30 mg/mL BSA封閉，37 ℃孵育30 min，一抗為大鼠抗性血清，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，二抗為Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG，37 ℃，避光孵育30 min，PBS充分洗滌，加入含DAPI的熒光淬滅劑，用熒光顯微鏡觀察Trx-like及Trx-putative蛋白在布氏錐蟲體內(nèi)的分布情況。

1.2.7 胰島素還原試驗(yàn) 采用DTT/胰島素還原法測(cè)定布氏錐蟲Trx-like及Trx-putative蛋白的二硫鍵異構(gòu)酶活性，具體操作步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[9-11]。反應(yīng)體系為800 μL，包含665 μL 0.17 mmol/L胰島素、不同濃度目的蛋白(3.1 μmol/L、6.2 μmol/L)，最后加入13 μL 100 mmol/L DTT啟動(dòng)反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)量60 min內(nèi)溶液濁度的變化，間隔2 min記錄一次OD 650 nm值。

1.2.8 金屬催化氧化試驗(yàn) 采用金屬催化氧化法測(cè)定布氏錐蟲Trx-like及Trx-putative蛋白對(duì)超螺旋pUC19質(zhì)粒的保護(hù)作用，反應(yīng)體系為50 μL，包含終濃度為5 μmol/L的三氯化鐵、3.3 mmol/L的DTT以及不同終濃度的Trx-like和Trx-putative(200、400、800 μg/mL)，37 ℃孵育2.5 h，加入200 ng的pUC19質(zhì)粒，37 ℃再孵育2 h，通過(guò)DNA凝膠電泳檢測(cè)Trx-like和Trx-putative蛋白的抗氧化水平。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism軟件和Excel處理數(shù)據(jù)。兩組間差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以“P<0.05”為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白Trx-putative和 Trx-like的表達(dá)與純化

利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Trx-putative和Trx-like，純化后的重組蛋白通過(guò)SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)測(cè)大小一致(圖1)，且蛋白純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.His標(biāo)簽重組蛋白的SDS-PAGE和Western blot;M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)椎;1.Trx-putative-His;2.Trx-like-His；B.GST標(biāo)簽重組蛋白的SDS-PAGE和Western blot;M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)椎;3.Trx-putative-GST;4.Trx-like-GSTA.SDS-PAGE and Western blot of His labeled recombinant protein;M.Protein molecular weight Marker;1.Trx-putative-His;2.Trx-like-His；B.SDS-PAGE and Western blot of GST labeled recombinant protein;M.Protein molecular weight Marker;3.Trx-putative-GST;4.Trx-like-GST

2.2 Trx-putative和Trx-like基因在布氏錐蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果

熒光定量PCR分析Trx-putative和Trx-like基因(Tb427.04.2450和Tb427.05.950)在布氏錐蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)、體外環(huán)境培養(yǎng)的布氏錐蟲內(nèi)，Trx-putative和Trx-like基因均有轉(zhuǎn)錄；Trx-putative基因在體外培養(yǎng)的布氏錐蟲中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于體內(nèi)培養(yǎng)的蟲體(圖2A)，差異顯著(P<0.05)；Trx-like基因在不同環(huán)境培養(yǎng)的布氏錐蟲中的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著差異(圖2B，P>0.05)；Trx-putative和Trx-like基因在同一培養(yǎng)環(huán)境下的布氏錐蟲中的轉(zhuǎn)錄水平差異極顯著(圖2C-D，P<0.01)，Trx-putative基因的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于Trx-like基因(P<0.01)。

A.Tb427.04.2450;B.Tb427.05.950;C.體內(nèi);D.體外

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)

間接免疫熒光試驗(yàn)觀察Trx-putative和Trx-like在布氏錐蟲體內(nèi)的表達(dá)位置(圖3)，發(fā)現(xiàn)Trx-putative和Trx-like在蟲體胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布。

圖3 Trx-putative和Trx-like在布氏錐蟲體內(nèi)的表達(dá)位置

2.4 胰島素還原試驗(yàn)

采用DTT/胰島素還原法測(cè)定布氏錐蟲Trx-putative和Trx-like的二硫鍵異構(gòu)酶活性(圖4)，Trx-putative可以催化胰島素的還原，且具有濃度依賴性，Trx-like不具有此功能。

A.Trx-putative;B.Trx-like

2.5 金屬催化氧化試驗(yàn)

利用金屬催化氧化系統(tǒng)(Metal-catalyzed oxidation system，MCO)測(cè)定布氏錐蟲Trx-putative和Trx-like對(duì)超螺旋pUC19質(zhì)粒的保護(hù)作用(圖5)。單獨(dú)孵育的MCO組分僅會(huì)對(duì)超螺旋pUC19質(zhì)粒造成輕微損傷，而在僅有MCO系統(tǒng)和帶有牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的MCO系統(tǒng)中，超螺旋pUC19質(zhì)粒出現(xiàn)完全切割。但是當(dāng)MCO系統(tǒng)中加入Trx-putative和Trx-like后，顯示出對(duì)超螺旋pUC19質(zhì)粒的保護(hù)作用。

A.Trx-putative的抗氧化試驗(yàn);1.未孵育的puc19質(zhì)粒;2.孵育的puc19質(zhì)粒;3.puc19質(zhì)粒中僅加入三氯化鐵;4.puc19質(zhì)粒中僅加入DTT;5.puc19質(zhì)粒在MCO體系中;6.puc19質(zhì)粒在MCO體系中加入BSA;7-9.puc19質(zhì)粒在MCO體系中加入200 、400、800 μg/mL Trx-putative;B.Trx-like的抗氧化試驗(yàn);1.未孵育的puc19質(zhì)粒;2.孵育的puc19質(zhì)粒;3.puc19質(zhì)粒中僅加入三氯化鐵;4.puc19質(zhì)粒中僅加入DTT;5.puc19質(zhì)粒在MCO體系中;6.puc19質(zhì)粒在MCO體系中加入BSA;7-9.puc19質(zhì)粒在MCO體系中加入200 、400、800 μg/mL Trx-like;NF.Nick form; SF.Supercoil form

2.6 定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)

A.Trx-putative/C62A的SDS-PAGE和Western blot;M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)椎;1.Trx-putative/C62A;B.Trx-like/C39A的SDS-PAGE和Western blot;M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)椎;2.Trx-like/C39AA.SDS-PAGE and Western blot analysis of Trx-putative/C62A;M.Protein molecular weight Marker;1.Trx-putative/C62A;B.SDS-PAGE and Western blot analysis of Trx-like/C39A;M.Protein molecular weight Marker;2.Trx-like/C39A

利用突變蛋白Trx-putative/C62A和Trx-like/C39A進(jìn)行胰島素還原試驗(yàn)，突變蛋白Trx-putative/C62A的二硫鍵異構(gòu)酶活性顯著降低(圖7)。

圖7 Trx-putative/C62A蛋白的胰島素還原試驗(yàn)結(jié)果

利用突變蛋白Trx-putative/C62A和Trx-like/C39A進(jìn)行金屬催化氧化試驗(yàn)，突變蛋白仍具有部分抗氧化作用(圖8)。結(jié)果表明Trx-putative和Trx-like蛋白“-CXXC-”基序中的第2個(gè)半胱氨酸并不是其發(fā)揮抗氧化功能的決定性氨基酸。

A.Trx-putative/C62A的抗氧化試驗(yàn);1.未孵育的puc19質(zhì)粒;2.孵育的puc19質(zhì)粒;3.puc19質(zhì)粒中僅加入三氯化鐵;4.puc19質(zhì)粒中僅加入DTT;5.puc19質(zhì)粒在MCO體系中;6.puc19質(zhì)粒在MCO體系中加入BSA;7-9.puc19質(zhì)粒在MCO體系中加入200 、400、800 μg/mL Trx-putative/C62A;B.Trx-like/C39A的抗氧化試驗(yàn);1.未孵育的puc19質(zhì)粒;2.孵育的puc19質(zhì)粒;3.puc19質(zhì)粒中僅加入三氯化鐵;4.puc19質(zhì)粒中僅加入DTT;5.puc19質(zhì)粒在MCO體系中;6.puc19質(zhì)粒在MCO體系中加入BSA;7-9.puc19質(zhì)粒在MCO體系中加入200、400、800 μg/mL Trx-like/C39A;NF.Nick form;SF.Supercoil formA.Antioxidant test of Trx-putative/C62A;1.puc19 without incubation; 2.puc19 in water and incubated 37 ℃ for 2 h;3.puc19 only with FeCl3;4.puc19 only with DTT;5.puc19 with MCO system;6.puc19 with BSA with MCO system;7-9.puc19 with Trx-putative/C62A(200,400,800 μg/mL)with MCO system;B.Antioxidant test of Trx-like/C39A ;1.puc19 without incubation; 2.puc19 in water and incubated 37 ℃ for 2 h;3.puc19 only with FeCl3;4.puc19 only with DTT;5.puc19 with MCO system;6.puc19 with BSA with MCO system;7-9.puc19 with Trx-like/C39A(200,400,800 μg/mL)with MCO system;NF.Nick form;SF.Supercoil form

3 討論

寄生蟲在其生命周期中不斷暴露在被激活的免疫細(xì)胞釋放的活性氧(reactive oxide species ，ROS)下，當(dāng)ROS大量釋放時(shí)，會(huì)對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、RNA等分子造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至壞死[6]。因此，挖掘與錐蟲抗宿主氧化損傷有關(guān)的蛋白質(zhì)，有可能為篩選新的藥物靶標(biāo)提供關(guān)鍵信息。目前已知多種蛋白參與這種機(jī)制[12-14]，硫氧還蛋白被證實(shí)是其中一種[7]，但尚未見(jiàn)很可能起著類似功能的Trx-putative和Trx-like蛋白的研究報(bào)道。

本研究從布氏錐蟲中鑒定了Trx-putative和Trx-like蛋白。生物信息學(xué)分析這2種蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)Trx-putative和Trx-like含有與Trx一樣的“Tioredoxin-like super family”結(jié)構(gòu)域，推測(cè)這2種蛋白很可能具有與Trx類似的生物學(xué)功能。Trx-putative和Trx-like基因在布氏錐蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果顯示，Trx-putative和Trx-like基因在體內(nèi)外不同環(huán)境培養(yǎng)的布氏錐蟲內(nèi)均檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本，但Trx-putative基因在體外培養(yǎng)的布氏錐蟲中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其在體內(nèi)培養(yǎng)的蟲體，推測(cè)推測(cè)Trx-putative和Trx-like蛋白可能參與蟲體與宿主的相互作用。

Trx-putative和Trx-like基因在同一培養(yǎng)環(huán)境下的布氏錐蟲中的轉(zhuǎn)錄水平差異極顯著，且Trx-putative基因的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于Trx-like基因，推測(cè)Trx-putative可能是一種新型的硫氧還蛋白，在布氏錐蟲的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，Trx-putative和Trx-like蛋白廣泛分布于布氏錐蟲胞質(zhì)中，所以研究這兩個(gè)蛋白對(duì)于進(jìn)一步探究布氏錐蟲和宿主的相互作用具有重要意義。胰島素還原法測(cè)定Trx-putative和Trx-like蛋白的二硫鍵異構(gòu)酶活性結(jié)果顯示，Trx-putative能在DTT的催化作用下，使胰島素中的二硫鍵被打開(kāi)，由于B鏈的聚集使得溶液的濁度增加，從而在650 nm處有強(qiáng)烈的光吸收，并且隨著Trx-putative蛋白濃度的增加，酶活性增強(qiáng)。結(jié)果證實(shí)了Trx-putative具有二硫鍵異構(gòu)酶活性，Trx-like蛋白則沒(méi)有該功能，進(jìn)一步推測(cè)Trx-putative可能就是布氏錐蟲的一種新型的硫氧還蛋白。本研究通過(guò)體外超螺旋DNA損傷保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在MCO系統(tǒng)中，布氏錐蟲Trx-putative和Trx-like蛋白均可以保護(hù)超螺旋質(zhì)粒免受氧化損傷，隨著蛋白濃度增加，保護(hù)效果越強(qiáng)，表明Trx-putative和Trx-like具有保護(hù)DNA損傷的作用。已報(bào)道硫氧還蛋白具有一段保守的活性區(qū)域“-CXXC-”[6]，生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)Trx-putative和Trx-like也具有一段該活性區(qū)域，為了進(jìn)一步研究Trx-putative和Trx-like蛋白的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，將這兩個(gè)蛋白保守區(qū)域中的第2個(gè)半胱氨酸進(jìn)行點(diǎn)突變，將其突變成丙氨酸[15-16]，結(jié)果顯示突變蛋白的二硫鍵異構(gòu)酶活性顯著降低，抗氧化作用減弱。研究結(jié)果為進(jìn)一步篩選有效藥物靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。