王文萱，李云鵬，徐鶴寧，趙 鑫，馬 柔，張麗娜，張瑩瑩

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

皂苷(saponin)也叫做皂角苷、堿皂體、皂素、皂甙或皂草苷[1]。皂苷廣泛存在于陸地高等植物中，是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一[2]，具有殺菌、化感、殺病毒、殺蟲等多種生物活性，在植物抵御病蟲害過程中發(fā)揮著重要作用[3]。水茄(Solanum torvumSwartz.)為雙子葉植物綱茄科茄屬亞灌木，為藥食同源類野生植物[4]，也是茄科植物保護(hù)地嫁接栽培中常用的抗病砧木[5]。水茄葉片提取物和代謝物中的多種甾體皂苷具有細(xì)胞毒性、抗炎、抗病毒、抗真菌、抗抑郁和抗糖尿病活性，可用于營養(yǎng)品和多種草藥天然配方的新成分[6]。水茄植株提取物能顯著抑制多種植物病原真菌的生長；水茄葉部提取物對植物病原菌的抑制活性最好[7]。水茄葉片提取物能夠抑制霉菌毒素的產(chǎn)生，可作為抗真菌劑的來源，抑制真菌對植物的侵害，防止果品采后真菌感染和霉菌毒素污染[8]。RAJESH等[9]從水茄葉片的提取物中分離出了抗真菌化合物，經(jīng)分析鑒定為一種甾體皂苷。綜上所述可見，水茄葉片皂苷在醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)用方面都有很高的研究和利用價值。

響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)是常用的對工藝過程進(jìn)行優(yōu)化的方法，它能夠直觀地顯示出所設(shè)響應(yīng)值與不同因素的函數(shù)關(guān)系，通過公式、圖表的分析篩選出最佳優(yōu)化條件[10]。應(yīng)用響應(yīng)面法可以了解到多個變量之間相互影響的關(guān)系，能夠準(zhǔn)確地評估不同變量及其間交互作用對響應(yīng)值的影響[11]。目前，響應(yīng)面法在優(yōu)化皂苷[12]、多糖[13]、黃酮[14]等天然活性物質(zhì)的提取工藝中有廣泛的應(yīng)用。

關(guān)于水茄總皂苷的提取工藝研究，目前尚未見報道。本試驗(yàn)以水茄葉片中總皂苷提取率為評價指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)考察乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度對提取率的影響；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對水茄葉片中總皂苷的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以期提高水茄葉片總皂苷的提取率，為日后水茄葉片總皂苷的研究和利用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：采集水茄健康葉片，洗凈晾干。

試劑：薯蕷皂苷（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司），無水乙醇、甲醇、石油醚、正丁醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CHY-6001多功能粉碎機(jī)，金華市莫菲家用電器有限公司；CP224S電子天平，德國Sartorius公司；SB5200DT超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵，天津華鑫儀器廠；UV-1780紫外分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料前處理 將晾干的水茄葉片粉碎過40目篩，備用。

1.3.2 水茄葉片中總皂苷提取方法 稱取葉片粉末，倒入具塞錐形瓶中，以乙醇作為提取溶劑，加蓋搖勻，在超聲波清洗器中進(jìn)行輔助提取，抽濾得提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)呈膏狀，用蒸餾水溶解，在分液漏斗中，用石油醚萃取脫脂，再用飽和的正丁醇溶液萃取，將正丁醇相旋轉(zhuǎn)蒸干，加蒸餾水溶解。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以薯蕷皂苷為標(biāo)準(zhǔn)品，參照文獻(xiàn)[15]，用香草醛-冰乙酸/高氯酸法[16]進(jìn)行顯色，隨行試劑做空白參比。繪制橫坐標(biāo)為薯蕷皂苷濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

1.3.4 總皂苷濃度和提取率 水茄葉片中總皂苷濃度和提取率的計(jì)算見公式(1)和(2)。

式中：C為總皂苷濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；N為測定吸光度時的稀釋倍數(shù)，M為水茄葉片質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

（1）乙醇濃度

分別以體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇提取，料液比1:5，溫度50℃，超聲功率輔助提取30 min。

（2）料液比

分別以料液比 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25進(jìn)行提取，乙醇濃度80%，溫度50℃，超聲功率輔助提取30 min。

（3）提取時間

乙醇濃度80%，料液比1:5，溫度50℃，分別超聲輔助提取30、60、90、120、150 min。

（4）提取溫度

乙醇濃度80%，料液比1:5，分別以40、50、60、70、80℃，超聲輔助提取30 min。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 10分析軟件[17]，選擇Box-Behnken設(shè)計(jì)，以水茄葉片總皂苷提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)自變量為乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度的四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 薯蕷皂苷溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以薯蕷皂苷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得回歸方程(3)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對水茄葉片中總皂苷提取率的影響 如圖1所示，當(dāng)乙醇濃度在50%～80%時，隨乙醇濃度升高，水茄葉片總皂苷提取率也逐漸升高。當(dāng)乙醇濃度升到80%，提取率達(dá)到最大值。乙醇濃度較低時，提取率也較低，這可能是因?yàn)樵谔崛∪軇┲兴恼急容^多，多糖等水溶性物質(zhì)溶出比皂苷類物質(zhì)多[18]。因此，選擇乙醇濃度80%作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中水平。

圖1 乙醇濃度對超聲提取水茄葉片中總皂苷的影響

2.2.2 液料比對水茄葉片中總皂苷提取率的影響 如圖2所示，當(dāng)料液比在1:5～1:15(g/mL)時，隨著料液比的增加，水茄葉片總皂苷提取率也隨之逐漸升高。在料液比達(dá)到1:15(g/mL)時，提取率達(dá)到了最大值。當(dāng)液料比在1:15～1:25(g/mL)時，隨著料液比的增大，提取率逐漸下降，這可能是因?yàn)殡S著溶液體積的增大，體系中水也逐漸增多，會使部分多糖類物質(zhì)溶解[19]，阻礙皂苷成分的溶出，從而影響提取率。因此，選擇料液比1:15(g/mL)為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中水平。

圖2 料液比對超聲提取水茄葉片中總皂苷的影響

2.2.3 提取時間對水茄葉片中總皂苷提取率的影響 如圖3所示，當(dāng)時間在30～90 min時，提取時間逐漸變長，水茄葉片總皂苷提取率也隨之升高。在提取時間達(dá)到90 min時，提取率達(dá)到了峰值。當(dāng)提取持續(xù)時間超過90 min后，水茄葉片總皂苷提取率隨時間變長反而下降，這可能是因?yàn)樵碥疹愇镔|(zhì)發(fā)生了氧化和降解等因素的影響[20]，所以提取率逐漸下降。因此，選擇提取時間90 min作為設(shè)計(jì)的中水平。

圖3 提取時間對超聲提取水茄葉片中總皂苷的影響

2.2.4 提取溫度對水茄葉片中總皂苷提取率的影響 如圖4所示，當(dāng)溫度在40～60℃時，隨提取溫度的升高，水茄葉片總皂苷的提取率也在逐漸升高，這可能是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，溫度越高傳質(zhì)過程越易進(jìn)行，隨著溫度的升高分子擴(kuò)散也隨之變劇烈，溫度加快了溶質(zhì)的擴(kuò)散，有利于活性物質(zhì)溶出。然而在60～80℃區(qū)間內(nèi)，水茄葉片總皂苷提取率緩慢下降，可能是因?yàn)樵诟邷叵虏糠植环€(wěn)定的皂苷類物質(zhì)被破壞[21]。因此，選擇60℃作為設(shè)計(jì)的中水平。

圖4 提取溫度對超聲提取水茄葉片中總皂苷的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 通過Design Expert 10軟件，設(shè)計(jì)自變量為乙醇濃度、料液比、提取時間和溫度的四因素三水平試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過Design Expert 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到如下回歸方程(4)。

由表3可知，響應(yīng)面模型P=0.0001＜0.001，表示該模型差異極顯著。失擬P=0.0977＞0.05，模型失擬項(xiàng)沒有顯著性差異，模型總決定系數(shù)R2=0.9851，調(diào)整決定系數(shù)R2(Adj)=0.9702，以上3項(xiàng)表明該模型擬合性良好。預(yù)測決定系數(shù)R2(Pred)=0.9200，表示模型預(yù)測性良好；CV值為2.41%，表明試驗(yàn)操作嚴(yán)謹(jǐn)可信；信噪比(Adeq precision)為30.925＞4，表示試驗(yàn)結(jié)果能夠被得到的回歸方程很好地解釋。綜上所述，認(rèn)為超聲提取水茄葉片總皂苷可以用此回歸方程進(jìn)行結(jié)果預(yù)測。

表3 方差分析結(jié)果

續(xù)表3

2.3.2 響應(yīng)面分析 通過表中各因素P值可知，C（提取時間）、D（提取溫度）這2個因素對總皂苷提取率的影響極顯著，B（料液比）影響顯著，A（乙醇濃度）影響不顯著；AB、AC、AD、BC、BD、CD各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著。二次項(xiàng)總體影響極顯著(P＜0.001)。由F值的大小可判斷，在選擇的水平范圍內(nèi)，各因素影響總皂苷提取率的順序?yàn)樘崛r間(C)＞提取溫度(D)＞料液比(B)＞乙醇濃度(A)。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用軟件繪制響應(yīng)曲面和等高線，可直觀的顯示出任意2種因素對皂苷提取率的影響，見圖5～10。

圖5 乙醇濃度和料液比對總皂苷提取率影響的等高線及響應(yīng)曲面

圖7 乙醇濃度和提取溫度對總皂苷提取率影響的等高線及響應(yīng)曲面

圖8 料液比和提取時間對總皂苷提取率影響的等高線及響應(yīng)曲面

圖9 料液比和提取溫度對總皂苷提取率影響的等高線及響應(yīng)曲面

圖10 提取時間和溫度對總皂苷提取率影響的等高線及響應(yīng)曲面

由圖5～10可知，任意2個影響因素相互影響的響應(yīng)斜面都有一個最高點(diǎn)，這表示在選定的水平范圍內(nèi)得到的結(jié)果有極值，說明各因素選擇考察的水平較為適當(dāng)[22]。響應(yīng)曲面的斜率越大，各因素水平發(fā)生變化時對水茄葉片總皂苷提取率的響應(yīng)程度越強(qiáng)[23]，所以各因素影響提取率的程度與方差分析結(jié)果吻合。各個交互因素的等高線都為橢圓形，表明AB、AC、AD、BC、BD、CD均有交互作用，其中CD的等高線更加接近于圓形，所以表明，時間和溫度交互作用最弱，BD的交互作用最強(qiáng)但P＞0.05，影響并不顯著。

依據(jù)線性二次多項(xiàng)式回歸方程可得水茄葉片總皂苷最佳提取工藝條件為乙醇濃度80.30%，料液比1:15.06(g/mL)，提取時間 95.56 min，提取溫度62.29℃，此時，水茄葉片總皂苷的理論提取率為38.82%。

2.4 水茄葉片總皂苷超聲提取最優(yōu)工藝驗(yàn)證

對最佳工藝進(jìn)行3次重復(fù)平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[24]，3次實(shí)驗(yàn)總皂苷平均提取率為38.60%(RSD=0.24%)，與模型預(yù)測結(jié)果相吻合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證明，響應(yīng)面法優(yōu)化總皂苷提取工藝重復(fù)性良好，優(yōu)化的參數(shù)具有實(shí)用價值，方案穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論及討論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對水茄葉片中總皂苷的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，對總皂苷的提取率的影響，提取時間和溫度極顯著、料液比顯著、乙醇濃度不顯著；且各因素之間都有交互作用，其中料液比與溫度的交互作用最強(qiáng)。優(yōu)化后的最佳工藝條件為乙醇濃度80.30%，料液比1:15.06(g/mL)提取時間95.56 min，提取溫度62.29℃，在此條件下，水茄葉片總皂苷的理論提取率為38.82%。

對優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證，皂苷平均提取率為38.60%(RSD=0.24%)，與模型預(yù)測值有0.24%相對標(biāo)準(zhǔn)誤差，本試驗(yàn)嚴(yán)格控制了除變量以外的其他條件，如超聲提取時使用的容器、飽和正丁醇萃取的時間等，出現(xiàn)的誤差可能是由于超聲波清洗機(jī)持續(xù)工作產(chǎn)生機(jī)械熱能[25]，一定程度上影響了提取過程。綜上所述，驗(yàn)證結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果相吻合，優(yōu)化的皂苷提取工藝重復(fù)性良好，穩(wěn)定可行，在最優(yōu)提取條件下，水茄葉片總皂苷的提取率可達(dá)38.60%。本試驗(yàn)僅對水茄葉片總皂苷進(jìn)行了超聲波輔助提取法的優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)行水茄總皂苷的純化工藝研究，以期為水茄總皂苷的利用提供技術(shù)支持；水茄葉片總皂苷生物活性是否受到提取操作的影響，也有待驗(yàn)證。