宏基因組二代測序技術在感染性疾病診斷中的應用價值

馬 慧,沈永明,司 萍

(天津市兒童醫(yī)院 天津大學兒童醫(yī)院檢驗科，天津 300134)

目前，感染性疾病仍然是全世界人類發(fā)病率和死亡率的主要原因。其致病原類型多樣，除常見病原體外，罕見細菌、病毒、真菌及寄生蟲等病原體不易被檢測，給臨床診斷帶來困難?？焖贉蚀_地診斷病因病原體可能是一項挑戰(zhàn)，因為各種各樣的微生物可能導致臨床上難以區(qū)分的疾病，而目前的方法可檢測病原體的光譜相對較窄。因此，由于病原體的多樣性，傳統(tǒng)檢測手段的局限性，以及臨床醫(yī)生對目標病原體的判斷水平參差不齊，在臨床上超過2/3的感染性疾病最終仍無法鑒定其病原體，導致臨床不能針對性地用藥，經(jīng)驗試錯情況時有發(fā)生。這一困境在臨床重癥感染性疾病，特別是由疑難、罕見的病原體導致的臨床重癥型病例上尤其嚴峻[1-2]。

宏基因組二代測序(mNGS)是基于高通量測序技術以及生物信息學分析對病原體進行基因測序的臨床實驗室診斷技術[3-4]，是一種不依賴于分離培養(yǎng)的新興病原體檢測技術。以其不需培養(yǎng)、鑒定速度快、準確率高等優(yōu)點逐步應用于感染性疾病領域。截至目前，該技術是臨床應用最廣泛的病原體高通量測序技術，對臨床患者感染病原體的早發(fā)現(xiàn)和精準治療有著極其重要的作用。但就現(xiàn)階段而言，受限于高昂成本，mNGS 主要集中應用于重大疾病、突發(fā)公共衛(wèi)生事件和特定病例人群，目前尚未納入常規(guī)臨床檢測[2]。本文就其在感染性疾病診斷中的應用價值及其優(yōu)勢進行綜述。

1 mNGS在不同器官系統(tǒng)感染性疾病中的應用

1.1血流感染：血流感染(BSI)是危重患者常見的危及生命的并發(fā)癥，通常導致感染性休克和死亡。為了獲得最佳治療效果，目前的指南建議盡早開始廣譜抗菌治療，最好在敗血癥/感染性休克識別后1 h內(nèi)開始。然而在實際臨床實踐中，大約46%的經(jīng)驗性抗生素治療被證明是不合適的，導致死亡率增加35%，增加了抗生素耐藥性和毒性的風險。因此，快速準確地檢測BSI病原體對于指導早期抗菌治療、實現(xiàn)更好的抗生素管理以及進一步改善臨床結果非常有價值。目前，血培養(yǎng)結合抗菌藥物敏感性測試(AST)仍然是BSI診斷的金標準。然而，血液培養(yǎng)受到周轉(zhuǎn)時間長、敏感性相對較低的限制(因為之前使用抗生素導致微生物接種量低或生長抑制) ，以及低特異性。近年來，mNGS在疑似BSI患者的病原體檢測中顯示了巨大的潛力。mNGS不需要培養(yǎng)，可以分析臨床樣本中的整個微生物群落[5]。早期的研究已經(jīng)表明，mNGS與膿毒癥患者血液培養(yǎng)試驗的診斷一致性高達93.7%，其結果與其他直接分子診斷方法的結果相當或優(yōu)于，表明mNGS有可能識別多種感染，包括各種病因引起的血液感染[6]。mNGS的總體診斷敏感性明顯高于單獨使用的細菌培養(yǎng)，同時對培養(yǎng)陰性膿毒癥病例提供了更好的結果。

綜上所述，在血液感染的診斷和治療指導方面，mNGS與基于培養(yǎng)的方法相比具有不可否認的優(yōu)勢，因為無論微生物類型如何，它都能將病原體鑒定所需的時間顯著縮短到24小時以下，且受抗生素影響較小[7]。

1.2中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染：各種病原微生物可感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，表現(xiàn)為腦膜炎、腦炎和膿腫，通常威脅生命；早診斷、早治療是臨床亟待解決的關鍵問題。目前臨床使用的主要病原學檢測方法靈敏度較低、時效性差，不能滿足臨床需要，導致患者無法得到早期診斷及精確用藥。因此，迫切需要及時準確的診斷方法，近年來，mNGS顯示了其優(yōu)越性。近幾年應用 mNGS從患者腦脊液中診斷出腮腺炎病毒、EB病毒、布氏桿菌、李斯特菌、結核分支桿菌、福氏奈格菌、創(chuàng)傷弧菌、腦囊蟲相關的腦炎或者腦膜炎的案例相繼見諸報道[8]。還有報道稱從CNS感染疑診患者的腦組織中檢測出人類皰疹病毒和麻疹病毒[8]。mNGS輔助診斷CNS感染的作用越來越受到重視。此外，mNGS也被證明在診斷亞急性或慢性腦膜炎方面、在鑒定培養(yǎng)陰性和未診斷病例中存在的復雜和罕見病原體方面有價值。事實上，除了具有相當高的診斷性能外，mNGS還可能有助于指導CNS感染的更具針對性的治療。然而，盡管與傳統(tǒng)方法相比，mNGS的總體檢出率更高，但它不能取代傳統(tǒng)方法，如培養(yǎng)。相反，建議將mNGS與傳統(tǒng)微生物檢測結合使用，以提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的致病性診斷[9]。此外，在采集CNS樣本之前，mNGS結果受抗生素使用的影響較小，因此，在抗生素使用嚴重影響患者致病微生物檢測的情況下，該技術優(yōu)于其他方法。

1.3呼吸道感染：呼吸道感染目前仍是高發(fā)病率及高死亡率的疾病，其病原體的診斷非常重要，傳統(tǒng)病原學檢測方法診斷能力不足問題日益突出。隨著mNGS的發(fā)展與成熟，該技術有望成為幫助指導靶向治療和抗生素合理應用的有效工具。目前國內(nèi)的實驗室對于常見細菌診斷技術相對成熟,但對一些少見的細菌感染,比如結核分枝桿菌、諾卡菌、非結核分枝桿菌、各種放線菌、厭氧菌,診斷能力尚有不足[10]。mNGS可以相對快速、準確地檢測和識別多種病原體，有助于及時、準確地治療肺部感染，特別是對危重病患者和混合感染患者。此外,使用mNGS也被證明可以提高肺部侵襲性真菌的診斷感染。此外，在免疫功能低下患者的分析中，mNGS的檢測準確率甚至可能達到100%。mNGS目前是病毒發(fā)現(xiàn)的首選方法，特別是對于新出現(xiàn)的肺炎病毒(即SARS-CoV、MERS-CoV和H7N9)，并且可能有助于追蹤和控制疫情[11]。

1.4骨和關節(jié)感染(BJI)：骨關節(jié)感染在臨床上較為常見，尤其是骨科內(nèi)植物相關感染如假體周圍感染或骨折內(nèi)相關性感染是臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)，盡管醫(yī)學水平不斷提高，但仍有許多骨關節(jié)感染患者最終因感染導致關節(jié)功能受限、生活質(zhì)量下降和殘疾。目前傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)仍然是大多數(shù)醫(yī)院的主要診斷方法，但常規(guī)培養(yǎng)存在敏感度相對較低和費時等缺點。近年來，分子診斷已被應用于BJI的診斷。這些技術獨立于培養(yǎng)的方法，目前PCR是一種普遍接受的病原體鑒定方法，敏感度有所提升，但無法識別真菌和多微生物混合感染。

滑液、外植體(即人工關節(jié)和其他矯形設備)的超聲液以及假體周圍組織均可通過mNGS來識別致病病原體。然而，迄今為止的研究主要集中在特定類型的樣品上，如超聲波液體或滑液。很少有隊列研究報告調(diào)查mNGS檢測BJI患者不同類型樣本病原體的能力。骨關節(jié)感染時，經(jīng)常無法獲得充分的關節(jié)液樣本，而組織樣本較容易獲取。常規(guī)的分子診斷手段多數(shù)需要采用關節(jié)液樣本提取病原體核酸以避免組織樣本中人員核酸污染的干擾，mNGS的技術特點無此方面限制[12]。另外， 國內(nèi)外一些報道發(fā)現(xiàn)與常規(guī)培養(yǎng)相比，mNGS擁有更高的病原體檢出率，mNGS不僅可以檢測到所有常規(guī)培養(yǎng)陽性病原體的序列數(shù)，還能從常規(guī)培養(yǎng)陰性的樣本中檢測到病原體序列數(shù)[13-14]。mNGS的另一優(yōu)勢是可以檢出混合感染，但也存在一定的局限性。其檢出的病原體無法確定是定植菌、背景菌或致病菌，對于病原體存活狀態(tài)也無法確定，還需要結合臨床表現(xiàn)和優(yōu)化培養(yǎng)結果進行精準診斷[12]。此外，非結核分枝桿菌(NTM)骨關節(jié)感染的病原檢出率和報道近年逐漸增多。薛白等[13]報道在骨關節(jié)感染患者中，mNGS對骨關節(jié)結核而言，優(yōu)勢不明顯。其原因可能與送檢樣本的不同類型有關。為增加研究結果的可靠性，未來應持續(xù)開展大樣本的、多中心的研究。

綜上所述，對于培養(yǎng)陰性BJI、通過關節(jié)腔穿刺獲得的樣本量有限或患者對經(jīng)驗性抗生素治療或清創(chuàng)反應不佳的情況，應強烈建議使用mNGS[15]。

1.5尿路感染(UTI)：UTI是一種常見的社區(qū)獲得性感染，通常由細菌以及某些真菌或病毒引起。大腸桿菌(≈75%)是簡單和復雜UTI最常見的病原體，后者由復雜的致病微生物組成，這使得診斷病原體相當困難?？股刂委熗ǔＪ荱TI患者的優(yōu)先治療策略，然而，由于最近嚴重的抗生素濫用，病原體對抗生素的耐藥性顯著增加，進一步增加了疾病負擔[16]。因此，快速、準確地鑒定UTI的病原體，進而優(yōu)化藥物治療至關重要。UTI診斷的金標準仍然是定量尿培養(yǎng)。然而，細菌的標準實驗室定量尿液培養(yǎng)通常至少需要18 h，這表明發(fā)病后24～48 h內(nèi)診斷可能存在困難[17]。此外，由于許多病毒和寄生蟲傳統(tǒng)上難以培養(yǎng)或不可能培養(yǎng)，因此可以通過檢測特定抗原、抗體或基因的血清學和分子方法進行診斷。然而，臨床醫(yī)生的事先判斷對于診斷仍然是重要和必要的[18]。mNGS能夠比培養(yǎng)方法更快、更敏感地識別病原體，無需臨床前預測或培養(yǎng)，這進一步促進了準確診斷和最佳治療。

1.6消化系統(tǒng)感染：主要的腸道病原菌種類包括來自外部環(huán)境的侵入性腸道病原菌和來自共生腸道的病原菌。由于腸道通常由共生細菌定植，糞便樣本的mNGS主要集中在非細菌物種，例如輪狀病毒A、隱孢子蟲和人類帕雷喬病毒，這些病毒通常在發(fā)熱兒童的糞便樣本中檢測到。mNGS也被用于檢測急性膽囊炎患者的潛在病原體，篩查是否存在罕見病毒，或識別急性肝衰竭患者的合并感染。除了病原體識別外，mNGS也是一種快速和不可知的診斷方法，用于研究耐藥體，并可用于識別腸道中的抗生素耐藥基因(ARG)，幫助檢測多藥耐藥菌(MDROs)，從而導致早期實施感染預防實踐、抗菌優(yōu)化和預防侵襲性感染[19]。

2 總結

mNGS不僅可以快速檢測和全面識別細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體和鉤端螺旋體等，而無需事先推定致病者。而且病原體可以直接從各種臨床標本(血液、痰液、肺泡灌洗液、腦脊液、胸水、腹水、膿液和組織標本)中識別，具有更高的靈敏度和準確性，優(yōu)于基于培養(yǎng)的方法，尤其是對于分枝桿菌、厭氧菌、非典型病原體和病毒。此外，mNGS受先前抗生素暴露的影響較小[9]。因此，mNGS在傳染病診斷和鑒別診斷方面顯示出巨大潛力。但目前該技術只能檢測到細菌屬水平，不能檢測到種水平及提供相應的細菌藥敏實驗。檢出的病原體尚無法判斷是否為致病菌及是否存活。希望在未來的研究中能夠解決這個問題。