孔 蘭，林榕燕，樊榮輝，林 兵，方能炎，鐘淮欽*

(1 福建省農(nóng)業(yè)科學院 作物研究所, 福州 350013; 2 福建省特色花卉工程技術研究中心, 福州 350013)

雜交蘭(Cymbidiumhybrid)通常指蘭屬中大花蕙蘭與國蘭種間雜交培育而成的一類蘭花，其兼具了親本的‘色、香、韻、姿’。該雜交種適應性強，具有發(fā)芽性好，易開花、耐熱性好、抗性較強、易規(guī)?；a(chǎn)等特點，深受消費者和商家的追捧和喜愛，具有廣闊的開發(fā)和應用前景[1-2]。目前，國內(nèi)外關于它的研究多集中于栽培技術[3-4]、組織快繁[5-6]、花芽分化[7]、香氣成分測定[8]和葉藝理化與分子生物學研究[9-12]等方面。

花色決定了雜交蘭的觀賞價值和經(jīng)濟價值，開發(fā)新型花色是雜交蘭育種的主要目標之一，也是古往今來研究的焦點[13]。研究表明，植物花色主要由3類物質(zhì)決定：類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿，其中類黃酮又包括花青素、黃酮(醇)、二氫黃酮(醇)、異黃酮、黃烷酮、查爾酮等化合物[14-15]。花青素是主要的顯色物質(zhì)，呈現(xiàn)出紅色、橙紅色、藍紫色；其余黃酮類化合物為輔助色素，呈現(xiàn)出白色、黃色、淺黃色[16-18]。常見的雜交蘭花色有白色、黃色、紅色、綠色及復合色[2]。但關于雜交蘭花色素的研究相對較少，僅見對部分品種色素含量或花青素苷成分的分析[1,19-20]。因此，研究雜交蘭花色素類型和組分對其新花色品種的培育具有重要意義。本研究通過顏色特征反應、紫外-可見光譜分析和靶向代謝組學方法，對7個雜交蘭品種的花色素類型、組分和含量進行了研究，初步分析了雜交蘭花色形成的不同組分及其花色差異原因，以期為品種花色改良和育種工作提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

7個雜交蘭材料為黃色系‘雙藝雅鳳’和‘玉鳳’，紅色系‘香蘭’、‘櫻花’、‘紅寶石’、‘福韻紅霞’和‘紅貴妃’(圖1)，均保存于福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所花卉研究室特色蘭花種質(zhì)資源圃中。

A.雙藝雅鳳；B.玉鳳；C.香蘭；D.櫻花；E.紅寶石；F.福韻紅霞；G.紅貴妃

于盛花期采集盛開的花朵，每個樣品分別取3株混合，以鋁箔紙包裹，部分液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫徊糠钟?20 ℃冷存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 花色素類型的定性分析將7個品種盛花期花瓣經(jīng)液氮充分研磨后，各取0.2 g粉末加至含有5 mL石油醚、10%鹽酸溶液和30%氨水溶液的三角瓶中，4 ℃靜提24 h，觀察并記錄顏色變化[21]。

1.2.2 類黃酮的顯色反應取新鮮花瓣各0.5 g左右，剪碎，放置于50 mL三角瓶，加入20 mL 1.0%鹽酸甲醇溶液(濃鹽酸∶甲醇=1∶99)，4 ℃靜置提取60 h，過濾，定容至25 mL。各取2 mL提取液進行下列顏色反應。1)濃鹽酸-鋅粉反應：加入少量鋅粉和10滴濃鹽酸(約500 μL)，混勻，靜置1 h；2)濃鹽酸-鎂粉反應：加入少量鎂粉和5滴濃鹽酸(約250 μL)，混勻，靜置1 h；3)三氯化鋁反應：加入2 mL 1.0% AlCl3·6H2O甲醇溶液，混勻；4)濃硫酸反應：緩慢加入1.5 mL濃硫酸溶液，混勻，沸水浴5 min；5)堿性反應：加入3 mL 5.0% Na2CO3溶液，混勻，密閉靜置30 min，然后通氣10 min；6)硼酸反應：依次加入10滴1.0% H2O2C4·2H2O溶液和3 mL 2.0% H3BO3溶液，混勻[22]。

1.2.3 紫外-可見光譜分析取新鮮花瓣各0.5 g左右，剪碎，放置于50 mL三角瓶中，加入20 mL 80%丙酮溶液，4 ℃靜置提取60 h，過濾，定容至25 mL。分別取甲醇提取液和丙酮提取液，在200～700和400～700 nm掃描，1.0%鹽酸甲醇溶液和80%丙酮溶液為相應的空白對照。類胡蘿卜素的特征吸收峰出現(xiàn)在440和470 nm附近；花青素的特征吸收峰出現(xiàn)在530 nm附近；類黃酮的特征吸收峰出現(xiàn)在240～285和300～550 nm附近[22-23]。

1.2.4 代謝組分析對冷凍干燥后的樣品進行研磨，取0.1 g粉末溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液中，每隔30 min旋轉(zhuǎn)30 s，重復6次后置于4 ℃冰箱過夜；離心、過濾，取上清液用于UPLC-MS分析。

使用UPLC-ESI-MS/MS系統(tǒng)(UPLC，日本SHIMADZU公司，Nexera X2；MS，美國Applied Biosystems公司，4500 Q TRAP)分析樣品提取物。所用色譜柱為SB-C18色譜柱(美國Applied Biosystems公司，1.8 μm×2.1 mm×100 mm)。流動相A：0.1%甲酸純水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫梯度：以95% A相和5% B相為起始，9 min內(nèi)B相線性增加至95%，A相降至5%，此狀態(tài)維持1 min，隨后1.1 min內(nèi)B相降至5%，A相增加至95%，維持2.9 min；流速為0.35 mL/min，柱溫為40 ℃；進樣量為4 μL。使用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，通過三重四級桿質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式(MRM，multiple reaction monitoring)進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。離子流參數(shù)：離子源為渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓+5500 V/-4500 V；離子源氣體Ⅰ(GSⅠ)，氣體Ⅱ(GSⅡ)和簾氣(CUR)壓力分別設置為50、60和25.0 psi[24]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理基于福州貝瑞思生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫和二級譜信息進行物質(zhì)定性分析，然后利用MRM模式完成代謝物定量。通過三重四級桿篩選出每個物質(zhì)的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號強度(CPS)，用MultiaQuant軟件打開樣本下機質(zhì)譜文件，進行色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積(Area)代表對應物質(zhì)的相對含量，最后導出所有色譜峰面積積分數(shù)據(jù)。為了比較代謝物在不同樣本中的物質(zhì)含量差異，根據(jù)代謝物保留時間和峰型的信息，對相應的質(zhì)譜峰進行校正，并將數(shù)據(jù)導入R軟件進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)?；贠PLS-DA結(jié)果，采取變量重要性投影(variable importance in projection)VIP≥1結(jié)合差異倍數(shù)fold change≥2和fold change≤0.5(3個生物學重復)的標準篩選不同品種間差異顯著的代謝物；利用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫對差異顯著代謝物進行注釋和通路富集分析[25-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交蘭花色素定性分析

石油醚測試結(jié)果(表1)顯示，7個雜交蘭品種的提取液均表現(xiàn)出無色，表明這些品種花瓣中均不含類胡蘿卜素。鹽酸測試顯示，‘福韻紅霞’、‘櫻花’、‘紅寶石’、‘紅貴妃’和‘香蘭’5個品種的提取液表現(xiàn)出不同程度紅色和粉紅色，表明其花瓣中含有花青素，且花青素含量存在差異；而‘雙藝雅鳳’和‘玉鳳’的提取液表現(xiàn)出不同程度的黃色，表明其花瓣中不含花青素。氨水測試中，7個品種呈現(xiàn)出鐵銹黃或亮黃色，表明所有花中均含有黃酮類化合物(表1)。綜上所述，7個蘭屬雜交種花瓣中均含黃酮類物質(zhì)，不含類胡蘿卜素，除‘雙藝雅鳳’和‘玉鳳’外，均含有花青素。

表1 蘭屬雜交種花色素類型測試的顏色反應

2.2 類黃酮特征顏色反應

濃鹽酸-鋅粉反應：黃色系‘雙藝雅鳳’和‘玉鳳’表現(xiàn)出無色，可能含有異黃酮、查爾酮；紅色系5個品種呈現(xiàn)不同程度的紅色(表2)，說明含有黃酮、黃酮醇和花青素化合物。

濃鹽酸-鎂粉反應：紅色系‘福韻紅霞’、‘櫻花’、‘紅貴妃’、‘紅寶石’和‘香蘭’表現(xiàn)出不同程度的紅色(表2)，說明可能含有黃酮(醇)、二氫黃酮(醇)和花青素苷。

三氯化鋁反應：黃色系‘雙藝雅鳳’和‘玉鳳’表現(xiàn)出淺黃色，說明含有黃酮化合物；其他品種表現(xiàn)出不同程度紅色(表2)，說明含有花青素苷。

硼酸反應：‘雙藝雅鳳’和‘玉鳳’表現(xiàn)出無色、粉色或淺粉色(表2)，說明黃酮中均不含C5-OH。

濃硫酸反應：‘福韻紅霞’、‘紅貴妃’和‘紅寶石’表現(xiàn)出紅褐色，說明含有花青素苷，其他品種表現(xiàn)出不同程度的棕色(表2)，說明含有黃酮(醇)化合物。

堿性試劑反應：‘雙藝雅鳳’、‘玉鳳’和‘香蘭’表現(xiàn)出黃色，通氣后顏色不發(fā)生變化(表2)，說明可能含二氫黃酮(醇)。

表2 不同品種的特征性顏色反應

2.3 雜交蘭花色素的紫外-可見光譜分析

紫外-可見光譜分析表明(表3)，7份雜交蘭丙酮提取液在440和470 nm附近均無吸收峰，表明這些品種花中不含類胡蘿卜素；在甲醇提取液中，7個品種在240～285和300～550 nm處均有吸收峰，表明它們含有查爾酮、二氫黃酮醇等黃酮類化合物；此外，‘福韻紅霞’、‘櫻花’、‘紅貴妃’、‘紅寶石’和‘香蘭’5個品種的甲醇提取液在530 nm附近具有吸收峰，說明含有花青素苷。該結(jié)果(表3)與顏色反應結(jié)果相一致，再次證實了7個品種色素成分主要為黃酮類物質(zhì)。

表3 色素成分的紫外-可見光譜測定結(jié)果

2.4 黃酮類代謝物的定性定量分析

以‘玉鳳’的黃色花和‘福韻紅霞’的紅色花為材料，進行了類黃酮代謝組分析，共檢測到286種代謝產(chǎn)物(100種黃酮類、100種黃酮醇類、15種二氫黃酮類、14種黃烷醇類、12種花青素類、12種黃酮碳糖苷類、11種查爾酮類、9種二氫黃酮醇類、8種異黃酮類、1種二氫異黃酮、1種橙黃酮、1種原花青素、1種鞣質(zhì)和1種其他類黃酮)?！ｍ嵓t霞’花瓣中共包含269種代謝物，‘玉鳳’花瓣中共包含270種代謝物?？偦ㄇ嗨仡惔x物在‘福韻紅霞’紅色花瓣中的相對含量高于‘玉鳳’黃色花瓣中的相對含量；總黃酮醇類、黃酮類、二氫黃酮醇類、黃酮碳糖苷類、二氫黃酮類、異黃酮類和查爾酮類代謝物相對含量在‘玉鳳’黃色花瓣中均高于‘福韻紅霞’(圖2)。結(jié)果表明，不同花色雜交蘭中黃酮類物質(zhì)的積累方式存在明顯差異。

圖2 ‘玉鳳’和‘福韻紅霞’中類黃酮化合物相對含量

2.5 差異代謝物分析

基于OPLS-DA模型的VIP值(VIP≥1)結(jié)合fold change(fold change≥2和fold change≤0.5)的方法篩選差異顯著的代謝物。與‘玉鳳’相比，‘福韻紅霞’中共篩選到160種顯著差異的代謝物，上調(diào)的代謝物有65種，其中矢車菊素-3-O-(2″-O-葡萄糖基)葡萄糖苷是差異倍數(shù)最大的上調(diào)代謝物；下調(diào)的代謝物有95種，其中6-羥基山奈酚-7-O-葡萄糖苷是差異倍數(shù)最大的下調(diào)代謝物(圖3)。在‘福韻紅霞’中篩選到了12個花青素苷差異代謝物，除飛燕草素-3-O-(6″-O-咖啡酰)葡萄糖苷外，其余11個代謝物的相對含量明顯高于‘玉鳳’中的(表4)。其中，7種花青素衍生物(矢車菊素-3-O-(2″-O-葡萄糖基)葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖基蕓香糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-(6″-O-對香豆酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷)是‘福韻紅霞’中特有的，它們可能是‘福韻紅霞’花瓣呈色的主要色素。在‘玉鳳’中，黃酮醇類、黃酮類、二氫黃酮醇類和黃酮碳糖苷類代謝物的相對含量較高。其中黃酮醇類代謝物以異鼠李素衍生物和異槲皮素衍生物為主，包括異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、異鼠李素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮素-7-O-(6″-丙二酰)葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-桑布雙糖苷等；黃酮類代謝物主要包括怪柳黃素衍生物和金圣草素衍生物；二氫黃酮醇類代謝物主要包括二氫楊梅素和二氫楊梅素-3-O-葡萄糖苷。此外，‘玉鳳’黃色花瓣中有15種代謝物在‘福韻紅霞’花瓣中未檢測到，其中差異倍數(shù)較大的6-羥基山奈酚-7-O-葡萄糖苷、山野豌豆苷(山奈酚-3-O-甘露糖苷)、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷和6-C-甲基槲皮素-3-O-蕓香糖苷、棉黃素-3-O-(6″-丙二酰)葡萄糖苷屬于黃酮醇類物質(zhì)。該結(jié)果表明這些代謝物種類和含量上的差異可能是導致雜交蘭花色差異的關鍵物質(zhì)。

圖3 ‘福韻紅霞’與‘玉鳳’的前20位差異代謝物

表4 花青素相關差異代謝物

2.6 差異代謝物的KEGG通路分析

根據(jù)差異代謝物結(jié)果，進行KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示，差異代謝物共分布在6個代謝通路上，其中花青素生物合成途徑與黃酮和黃酮醇生物合成途徑富集較為顯著(圖4)。類黃酮合成途徑上代謝物的注釋與展示如圖5所示。類黃酮合成第1階段中，香豆酰CoA和丙二酰CoA經(jīng)過一系列催化酶作用合成查爾酮、柚皮素、圣草酚、五羥基黃酮和二氫山奈酚，在‘玉鳳’花瓣中五羥基黃酮經(jīng)催化后合成了橙皮素(黃酮類)和二氫楊梅素(二氫黃酮醇類)，‘福韻紅霞’花瓣中圣草酚經(jīng)催化后合成了木犀草素(黃酮類)和二氫槲皮素(二氫黃酮醇類)；類黃酮合成第2階段中，楊梅素、山奈酚和槲皮素的含量在兩個品種間無明顯差異，‘福韻紅霞’花瓣中二氫槲皮素經(jīng)一系列酶催化合成矢車菊素衍生物和芍藥素衍生物，而‘玉鳳’花瓣中二氫槲皮素經(jīng)黃酮醇合成酶催化合成異鼠李素和異槲皮素等槲皮素類衍生物。綜上所述，花青素生物合成途徑上矢車菊素類代謝產(chǎn)物的積累是‘福韻紅霞’花朵呈現(xiàn)紅色的主要原因，而黃酮和黃酮醇生物合成途徑上槲皮素類代謝產(chǎn)物的積累使‘玉鳳’花朵呈現(xiàn)黃色。

圖4 差異代謝物的KEGG富集圖

紅色方框代表該物質(zhì)上調(diào)，綠色方框代表該物質(zhì)下調(diào)，藍色方框代表該物質(zhì)無差異

3 討 論

本研究花色素定性分析中發(fā)現(xiàn)7個所試材料花瓣中均含有黃酮類物質(zhì)，因此進一步利用靶向代謝組學方法對雜交蘭花瓣中黃酮類代謝產(chǎn)物進行了分析，共檢測到286種代謝產(chǎn)物，分為14個亞組，其中包括100種黃酮醇類和12種花青素類代謝產(chǎn)物。該研究首次提供了雜交蘭中參與花色形成的較為完整的代謝產(chǎn)物，而前期研究只強調(diào)了花青素在花瓣中的作用[19]?；ㄉ氐姆N類和含量與植物花瓣的最終呈色密切相關[27-28]。本研究中紅色系品種‘福韻紅霞’含有12種花青素，其中矢車菊素-3-O-(2″-O-葡萄糖基)葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖基蕓香糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-(6″-O-對香豆酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷是紅色系品種‘福韻紅霞’特有的；黃色系品種‘玉鳳’只有5種花青素，除飛燕草素-3-O-(6″-O-咖啡酰)葡萄糖苷外，其余4種花青素代謝產(chǎn)物的相對含量也只有紅色系品種‘福韻紅霞’中相對含量的1/1130～1/273，暗示了矢車菊素衍生物和芍藥素衍生物是紅色系雜交蘭品種花瓣呈色的物質(zhì)基礎，在花青素代謝途徑中以矢車菊素-芍藥素代謝分支為主，與前人研究的矢車菊素、飛燕草素和芍藥素是蘭科植物主要花色素的結(jié)果一致[29-30]。同樣，在玫瑰[31]、荷花[32]、杜鵑[33]、梅[34]中也證實矢車菊素和芍藥素是它們花瓣呈現(xiàn)紅色的主要原因。此外，木樨草素衍生物、山奈酚衍生物、芹菜素衍生物等黃酮類代謝產(chǎn)物的含量在‘福韻紅霞’中也顯著積累，它們可能作為輔助色素，使其顏色加深從而呈現(xiàn)出紅紫色。

類黃酮和類胡蘿卜素是植物中重要的黃色色素，但黃色系雜交蘭品種花瓣中未檢測到類胡蘿卜素，這表明類胡蘿卜素不是使其呈現(xiàn)黃色的主要色素，小蒼蘭黃花中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[35]，但與文心蘭[36]和蝴蝶石斛蘭[18]黃色花中主要色素為類胡蘿卜素不同。研究表明，荷花[32,37]、蓮花[38]、金花茶[39]、桔梗[40]中黃色花的形成與黃酮醇有關。本研究中，檢測到100種黃酮醇類代謝產(chǎn)物，其中55種黃酮醇類代謝產(chǎn)物的含量在兩個品種中差異顯著，尤其是異鼠李素衍生物和槲皮素衍生物的相對含量在黃色系品種‘玉鳳’中顯著高于紅色系品種‘福韻紅霞’。此外，顏色特征反應和紫外-可見光譜分析結(jié)果顯示‘玉鳳’中不含花青素，代謝組中也僅檢測到少量的芍藥花色苷和飛燕草素苷。以上結(jié)果暗示了槲皮素類黃酮醇代謝物可能在‘玉鳳’黃色花瓣形成中具有重要作用。

綜合以上結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)花青素和黃酮醇生物合成的分流可能是導致紅色品種‘福韻紅霞’和黃色品種‘玉鳳’之間花瓣呈色差異的主要原因。近年來，高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術已廣泛應用于蘭屬植物的研究，控制花色形成的代謝途徑也被闡明。未來的研究可將類黃酮途徑上關鍵差異代謝物與關鍵基因相結(jié)合，深入分析花色形成的分子基礎，為蘭屬雜交種花色育種和定向改良提供理論依據(jù)。