TTC染色鑒定葡萄抗寒性方法的優(yōu)化與應(yīng)用

王涵雅，李 欣，毛 娟，馬宗桓，韋霞霞，陳佰鴻

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，蘭州 730070)

中國北方的冬季低溫會(huì)對葡萄生長造成嚴(yán)重影響[1]。多年來，在葡萄對低溫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)及其應(yīng)答機(jī)制方面開展了大量研究，以期為葡萄抗寒性評價(jià)和抗寒品種選育提供理論依據(jù)。低溫脅迫會(huì)對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞，從而引起電解質(zhì)外滲、相對電導(dǎo)率增加。通過測定不同溫度梯度下植物組織的相對電導(dǎo)率來擬合Logisitic方程，計(jì)算出半致死溫度(LT50)，可有效預(yù)測植物的抗寒性[2]。電導(dǎo)法由于操作簡便，已成為目前植物抗寒性評價(jià)中使用最廣泛的方法之一，在蘋果[3]、梨[4]、葡萄[5]等果樹的抗寒性鑒定中均得到運(yùn)用。然而，此法在具體操作時(shí)易受浸泡時(shí)間、溫度以及空氣中CO2的溶解等因素的影響，會(huì)出現(xiàn)結(jié)果重復(fù)性較差、與田間實(shí)際的抗寒性表現(xiàn)不一致等問題[6]。

氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)是一種顯色劑，有活力的細(xì)胞可在還原酶的作用下將其還原為一種不溶于水的紅色物質(zhì)三苯基甲臢(triphenylmethylzan，TTF)[7]，顯色程度可以用來判斷植株的活力大小。TTC染色指數(shù)法是根據(jù)低溫脅迫后植株TTC染色等級對抗寒性進(jìn)行評估。有學(xué)者對低溫處理后的橡膠枝條進(jìn)行TTC染色，將染色級數(shù)與田間實(shí)際抗寒性進(jìn)行比較，證明TTC染色級數(shù)法準(zhǔn)確可靠[8]。目前此法在核桃[9]、杜仲[10]、葡萄[11]等植物的抗寒性評價(jià)上也有報(bào)道，但仍存在橫截面染料堆積、目測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確等問題。趙瀅等[12]在葡萄枝條中運(yùn)用TTC染色法時(shí)將觀測面由橫切面改為縱切面，并利用掃描儀和圖片處理軟件聯(lián)用的方法將染色結(jié)果進(jìn)行可視化分析和數(shù)據(jù)量化，但仍存在染色時(shí)間較長、掃描圖片不清晰等問題。

單一的生理生化指標(biāo)往往不能準(zhǔn)確反映出植物的實(shí)際抗寒能力，因此通常選取多個(gè)指標(biāo)(如可溶性糖、可溶性淀粉、脯氨酸、水分等)進(jìn)行測定，從而較為全面地反映出植物的真實(shí)抗寒水平，準(zhǔn)確地對植物抗寒性進(jìn)行鑒定。常用的綜合評價(jià)法有主成分分析法和隸屬函數(shù)法。 已在杏[13]、葡萄[14]和獼猴桃[15]等多種果樹中得到應(yīng)用。范宗民等[16]在對葡萄枝條的抗寒性鑒定中測定了可溶性蛋白、脯氨酸、抗氧化酶等多個(gè)指標(biāo)，所得綜合隸屬度可以準(zhǔn)確反映枝條的抗寒性。但此法在鑒定大量種質(zhì)時(shí)相對費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

鑒于以上情況，我們優(yōu)化了葡萄枝條TTC染色條件，并選擇6個(gè)葡萄品種一年生枝條為試材，以低溫脅迫后枝段縱切面染色面積為判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合Logistic方程對其抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)；同時(shí)與電導(dǎo)法、隸屬函數(shù)法獲得的抗寒性評價(jià)結(jié)果進(jìn)行比較，以此來驗(yàn)證用枝段縱切面染色面積擬合LT50進(jìn)行抗寒性鑒定的可行性和準(zhǔn)確性，旨在建立一種簡便、可靠的葡萄休眠期抗寒性評價(jià)方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從甘肅省武威市林業(yè)科學(xué)研究院釀酒葡萄品種園采集 ‘左山1號’、‘黑比諾’、101-14、3309C、140R和SO4 6個(gè)葡萄品種和砧木。該區(qū)地處河西走廊東端(38°02′32″N，102°42′19″E)，海拔1 632 m，屬溫帶大陸干旱性氣候，以沙質(zhì)土壤為主。年平均溫度7.8 ℃，無霜期150 d，年蒸發(fā)量2 135 mm，年均日照時(shí)數(shù)2 725 h。葡萄株行距為0.7 m×3.0 m，淺溝栽植，溝深30 cm，溝寬80 cm，溝長70 m，東西行向，單臂籬架整形，架高1.7 m。

1.2 材料低溫處理

于2020年11月上旬采集各品種長勢一致的一年生枝各50枝，每枝長40 cm，室外沙藏30 d備用。材料的低溫處理參照張倩等[17]的方法，并稍作改動(dòng)。供試材料表面清理干凈后用保鮮膜包裹，添加標(biāo)簽，放入超低溫冰箱，分別在0 ℃、-14 ℃、-19 ℃、-24 ℃、-29 ℃和-34 ℃的溫度下冷凍，緩慢降溫至目標(biāo)溫度后放置24 h，隨后緩慢升溫到4 ℃后放置8 h，然后于室溫下再放置8 h，升降溫速率均為4 ℃/h。分別刮取韌皮部與木質(zhì)部，在液氮中速凍后迅速移至-80 ℃冰箱保存，用于后面生理指標(biāo)的測定。隨機(jī)抽取3個(gè)枝條為1個(gè)處理，重復(fù)3次，以0 ℃處理下的材料為對照。

1.3 相對電導(dǎo)率擬合葡萄枝條半致死溫度

Y=K/(1+ae-bx)

方程中Y代表相對電導(dǎo)率，a、b是方程參數(shù)，K為常數(shù)，由于Y是累積頻率，此處K取100，LT50即方程拐點(diǎn)，計(jì)算方式為：LT50=-(lna/b)

1.4 TTC活力染色面積擬合葡萄枝條半致死溫度

1.4.1 葡萄枝條TTC活力染色條件優(yōu)化選擇長勢良好和粗細(xì)均勻的一年生枝條清洗干凈，避開芽眼剪成0.5 cm厚的莖段，取8個(gè)放入10 mL離心管中，加入0.5% TTC-0.1 mol/L磷酸緩沖染色液沒過枝條。分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下各依次浸泡12、24、36、48、72和96 h，取出后將各浸泡時(shí)間枝條縱切，在體視顯微鏡成像系統(tǒng)下觀察染色情況并拍照，確定最佳染色溫度和浸泡時(shí)間。

1.4.2 葡萄枝條低溫脅迫后優(yōu)化TTC法活力染色為了觀察低溫脅迫后葡萄枝條的TTC活力染色情況，利用優(yōu)化的TTC染色條件對1.2中低溫梯度脅迫處理后的葡萄枝條進(jìn)行活力染色，染色后用蒸餾水洗滌3～5次，縱切面在體視顯微鏡下成像拍照。然后，染色圖片用Image J軟件進(jìn)行選定圖像的面積統(tǒng)計(jì)，在圖像選定時(shí)避開髓部。

1.4.3 TTC染色面積擬合Logistic方程采用1.3 中電導(dǎo)法擬合Logistic方程的方法，先擬合方程，然后依據(jù)Logistic方程計(jì)算葡萄枝條半致死溫度LT50。

1.5 葡萄枝條韌皮部、木質(zhì)部生理指標(biāo)測定及抗寒性綜合評價(jià)

首先，對1.2中低溫梯度處理后的各葡萄品種枝條的韌皮部和木質(zhì)部的生理指標(biāo)進(jìn)行測定。其中，可溶性糖和淀粉含量用蒽酮法測定[19]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[19]，脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定[19]，總水含量采用烘干法測定，自由水含量采用馬林契克法[19]，然后計(jì)算出束縛水含量以及束縛水與自由水比例(束自比)。

其次，參照抗寒綜合評價(jià)模型[20-21]，對6個(gè)葡萄品種的韌皮部和木質(zhì)部進(jìn)行抗寒性評價(jià)。具體公式如下：

Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)(正相關(guān))

林德叉車（中國）有限公司在“進(jìn)博會(huì)”上推出了引領(lǐng)潮流的智能化設(shè)備-林德物料搬運(yùn)機(jī)器人L-Matic AC，環(huán)保節(jié)能的新能源叉車——?dú)潆姵睾弯囯姵夭孳?，以及專注車?duì)運(yùn)營管理數(shù)字化的林德智聯(lián)系統(tǒng)Linde Smartlink等，和與會(huì)展商、觀眾分享智能化、數(shù)字化、新能源轉(zhuǎn)型經(jīng)驗(yàn)，集中展現(xiàn)了林德的可持續(xù)發(fā)展之路。

或Uij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)(負(fù)相關(guān))

式中，U為抗寒隸屬函數(shù)值，X為各品種不同指標(biāo)的測定值，Xjmin為j指標(biāo)的最小值，Xjmax為j指標(biāo)的最大值，i代表品種，j代表指標(biāo)。

參照高振等的方法[22]，將葡萄砧木的抗寒性分為以下5個(gè)級別：1級，平均隸屬度處于0.70～1.00之間的歸為高抗寒(high resistance，HR)；2級，平均隸屬度處于0.60～0.69之間的歸為抗寒(resistance，R)；3級，平均隸屬度處于0.40～0.59之間的歸為中抗寒性(middle resistance，MR)；4級，平均隸屬度處于0.30～0.39之間的歸為低抗寒性(low resistance，LR)；5級，平均隸屬度處于0～0.29之間的歸為不抗寒(susceptible，S)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010進(jìn)行處理和作圖，用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析與相關(guān)性分析。相關(guān)系數(shù)采用Pearson方式進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC染色法確定葡萄枝條低溫半致死溫度

2.1.1 葡萄枝條TTC染色條件優(yōu)化由于‘黑比諾’品種的抗寒性最弱，因此用其一年生枝條來進(jìn)行TTC染色條件的優(yōu)化。將0.4～0.6 cm枝條用0.5% TTC-0.1 mol/L磷酸緩沖液染色(用水浸泡枝條作為對照)，縱切面染色結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)染色溫度與染色時(shí)間均對染色結(jié)果有一定影響。用Image J軟件將圖片進(jìn)行處理后(圖1)可以看出，不同溫度下染色面積達(dá)到95%以上時(shí)的時(shí)間有所不同，在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃染色溫度下分別為72、72、48、36和36 h，在35 ℃及40 ℃時(shí)用時(shí)明顯較短。尤其是在35 ℃染色36 h后，切面顏色最深且能達(dá)到全紅。因此，優(yōu)化獲得葡萄枝條的最佳染色條件為：0.5% TTC-0.1 mmol/L磷酸緩沖液在35 ℃下避光染色36 h。

2.1.2 不同品種低溫處理后枝條活力比較用優(yōu)化獲得的葡萄枝條最佳TTC法染色條件將不同低溫處理過的枝條進(jìn)行染色。染色結(jié)果(圖2)顯示，在0 ℃條件下，各個(gè)葡萄品種枝條染色面積均接近100%，全部染成深紅色。在-14 ℃低溫處理下，除‘黑比諾’枝條外，其余各品種枝條染色面積也大于90%，從著色程度來看‘黑比諾’枝條染色程度也明顯比其他5個(gè)品種淺。在-19 ℃低溫處理時(shí)，‘黑比諾’與140R染色相近，均染色較淺，比其余品種低50%左右。在-24 ℃低溫處理時(shí)，枝條染色面積從大到小依次為：‘左山1號’、101-14、3309C、SO4、140R和‘黑比諾’。

圖2 低溫處理后不同品種枝條縱切面的TTC染色結(jié)果

2.1.3 TTC染色法確定枝條低溫半致死溫度由表1可知，用上述方法獲得的枝條染色面積來確定葡萄枝條的低溫半致死溫度(LT50)，擬合度R2最低在0.9264，證明用TTC染色法結(jié)合Logistic方程來擬合葡萄枝條LT50是合理的。根據(jù)LT50值的大小對6個(gè)葡萄品種的抗寒性進(jìn)行排序，結(jié)果表現(xiàn)為：‘左山1號’ > 101-14 > 3309C > SO4 > 140R > ‘黑比諾’。

表1 利用枝條染色面積計(jì)算不同葡萄品種的低溫半致死溫度

2.2 低溫脅迫下各品種枝條相對電導(dǎo)率和半致死溫度

圖3顯示，隨著處理溫度的降低，各葡萄品種枝條的相對電導(dǎo)率均不斷升高，均在-34 ℃時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)‘左山1號’、‘黑比諾’、101-14、3309C、140R和SO4的枝條相對電導(dǎo)率分別為79.08%、61.89%、66.98%、67.58%、70.18%和73.98%。在整個(gè)低溫脅迫過程中，‘黑比諾’的相對電導(dǎo)率增幅最大(51.93%)，而‘左山1號’的增幅最低(44.07%)。

圖3 低溫處理下不同品種葡萄枝條相對電導(dǎo)率

同時(shí)，在每一個(gè)處理溫度下，‘左山1號’的相對電導(dǎo)率始終最低。除-24 ℃處理外，‘黑比諾’的相對電導(dǎo)率均高于同一溫度的其余品種。根據(jù)“相對電導(dǎo)率變化越大，抗寒性越弱”的標(biāo)準(zhǔn)來判斷，6個(gè)葡萄品種枝條的抗寒性排序?yàn)椋骸笊?號’ > 101-14 > 3309C > SO4 > 140R > ‘黑比諾’。這與上述TTC染色法所得各葡萄品種抗寒性順序一致。

同時(shí)，利用相對電導(dǎo)率擬合Logistic方程得出供試材料半致死溫度(LT50)可以看出(表2)，6個(gè)供試材料的LT50在-31 ℃～-17 ℃之間，決定系數(shù)均較高，證明用不同溫度下的電解質(zhì)滲出率來擬合半致死溫度是合理的。根據(jù)“LT50越小，抗寒性越強(qiáng)”的標(biāo)準(zhǔn)判斷，6個(gè)葡萄品種抗寒性排序表現(xiàn)為‘左山1號’ > 101-14 > 3309C > SO4 > 140R > ‘黑比諾’，他們的LT50值分別為：-30.02 ℃、-26.40 ℃、-25.75 ℃、-23.16 ℃、-21.13 ℃和-17.72 ℃。

表2 利用相對電導(dǎo)率計(jì)算不同葡萄品種的低溫半致死溫度

2.3 低溫脅迫下各葡萄品種枝條抗寒性的隸屬函數(shù)法綜合評價(jià)

6個(gè)葡萄品種間抗寒性不同，同一品種不同部位抗寒性也有所差異，每一個(gè)葡萄品種韌皮部隸屬函數(shù)值均大于其相應(yīng)木質(zhì)部(表3)。其中，品種101-14、3309C和140R韌皮部的抗寒等級分別為高抗寒、高抗寒和低抗寒，而這3個(gè)品種的木質(zhì)部抗寒等級也有所不同，分別為抗寒、抗寒以及不抗寒。‘左山1號’、SO4和‘黑比諾’這3個(gè)品種枝條木質(zhì)部和韌皮部的隸屬函數(shù)值不同，但抗寒等級相同，均分別為高抗寒、中抗寒和不抗寒。無論韌皮部還是木質(zhì)部，各品種隸屬函數(shù)值從大到小都依次為：‘左山1號’、101-14、3309C、SO4、140R和‘黑比諾’。

表3 基于隸屬函數(shù)綜合評價(jià)不同品種葡萄枝條的抗寒性

2.4 不同抗寒性鑒定方法之間的相關(guān)性分析

運(yùn)用TTC染色指數(shù)和相對電導(dǎo)率分別求得的低溫半致死溫度與枝條韌皮部、木質(zhì)部的綜合隸屬函數(shù)值之間的相關(guān)性如表4所示，不同的抗寒性評價(jià)方式所得結(jié)果之間均達(dá)到極顯著相關(guān)。通過TTC染色面積和相對電導(dǎo)率求得的低溫半致死溫度相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.983。枝條韌皮部和木質(zhì)部抗寒性有所差異，但不同部位求得的平均隸屬度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.987。TTC染色面積擬合LT50與韌皮部和木質(zhì)部的隸屬函數(shù)值均為極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.938和-0.945。

表4 半致死溫度與隸屬函數(shù)法綜合評價(jià)結(jié)果的相關(guān)性分析

2.5 低溫處理對枝條生長恢復(fù)的影響

低溫處理后扦插枝條的萌芽率和生根率均能夠有效的反應(yīng)植物的耐寒能力。如圖4所示，隨著處理溫度的降低，各個(gè)品種的萌芽率和生根率均降低。0 ℃是6個(gè)品種的萌芽率和生根率均接近100%。在-24 ℃下，‘左山1號’和101-14的萌芽率和生根率均高于50%，而140R和‘黑比諾’的生根率和出芽率均低于40%。溫度繼續(xù)降低至-29 ℃時(shí)，‘黑比諾’的萌芽率和生根率均為0，140R的萌芽率低至8%而生根率為0，而‘左山1號’的生根率和萌芽率還在50%作用。當(dāng)處理溫度為-34 ℃時(shí)，‘左山1號’生根率和萌芽率仍然能達(dá)到30%，其余品種的萌芽率和生根率均接近0。從萌芽率和生根率可以明顯的看出‘左山1號’的耐寒性高于其他5個(gè)品種，而‘黑比諾’的抗寒性低于其他品種。

圖4 低溫處理后各葡萄品種枝條萌芽率和生根率

3 討 論

植物細(xì)胞因低溫傷害受損后，生物膜會(huì)被破壞，造成電解質(zhì)外滲。因此，測定不同低溫下電解質(zhì)滲出率可以了解膜受損程度。用電解質(zhì)滲出率結(jié)合Logistic曲線方程，可對各品種的LT50進(jìn)行預(yù)測，拐點(diǎn)溫度可以用來衡量植物抗凍性的強(qiáng)弱，預(yù)測結(jié)果和田間調(diào)查結(jié)果基本接近。在本研究中，葡萄枝條相對電導(dǎo)率隨著處理溫度的降低逐漸增大，增幅越大，抗寒性越弱，反之則越強(qiáng)；同時(shí)，LT50越大，表明抗寒性越弱。因此，利用上述方法得出了6個(gè)葡萄品種的抗寒性排序?yàn)椋骸笊?號’ > 101-14 > 3309C > SO4 > 140R > ‘黑比諾’，部分品種抗寒性排名與劉鈺璽等[23]的研究結(jié)果一致。

TTC染色法能簡單快速地檢測出超低溫保存中莖尖的活力，并且在生產(chǎn)中能用TTC法測定種子的生活力來判斷種子潛在的發(fā)芽能力和種子質(zhì)量[24]。由于染色溫度和時(shí)間均會(huì)對染色結(jié)果有所影響，在植物枝條中應(yīng)用TTC染色法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化并獲得了葡萄枝條的最佳染色條件，并結(jié)合Image J軟件將TTC染色面積量化分析，發(fā)現(xiàn)用染色面積擬合Logistic方程獲得的拐點(diǎn)溫度與相對電導(dǎo)率擬合的LT50之間的相關(guān)系數(shù)較高(0.983)，表明此方法在葡萄枝條的抗寒性鑒定方面準(zhǔn)確性較高，這一研究結(jié)果與趙瀅等[12]的研究結(jié)果相一致，類似結(jié)果在橡膠樹[8]、板栗[25]等樹種上均得到了驗(yàn)證。進(jìn)一步利用此法獲得的不同葡萄品種枝條的抗寒性排序與根據(jù)電導(dǎo)法得到的抗寒性結(jié)果一致，再次證明TTC染色法結(jié)合半致死溫度來評價(jià)葡萄枝條抗寒性具有直觀可靠等優(yōu)點(diǎn)。

植物在面臨低溫時(shí)，其機(jī)體內(nèi)保護(hù)物質(zhì)會(huì)增加。在低溫脅迫下蘋果砧木的電導(dǎo)率會(huì)升高，伴隨丙二醛、可溶性糖、游離脯氨酸含量會(huì)驟然增加[26]。單一指標(biāo)衡量葡萄枝條抗寒性具有一定局限性，根據(jù)報(bào)道通過多個(gè)指標(biāo)結(jié)合模糊隸屬函數(shù)法來綜合評價(jià)抗寒性更加合理[27]。本研究通過模糊隸屬函數(shù)法獲得的隸屬值從高到低依次為：‘左山1號’、101-14、3309C、SO4、140R和‘黑比諾’，與通過電導(dǎo)率和TTC染色法確定的抗寒性排序結(jié)果一致。另外，本研究利用綜合隸屬函數(shù)法對葡萄枝條不同部位進(jìn)行抗寒性評價(jià)，發(fā)現(xiàn)韌皮部的抗寒性強(qiáng)于木質(zhì)部，這可能是因?yàn)槟举|(zhì)部中的細(xì)胞間隙大于韌皮部，通透性較強(qiáng)，且韌皮部代謝能力發(fā)達(dá)， 所以韌皮部對低溫的抵抗能力強(qiáng)于木質(zhì)部。

4 結(jié) 論

本研究以6個(gè)葡萄品種枝條為材料，在對TTC染色法的染色溫度和染色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用優(yōu)化的TTC染色枝條縱切面積擬合半致死溫度得到不同葡萄品種枝條的抗寒性，其抗寒性排序與電導(dǎo)法擬合半致死溫度、生理指標(biāo)綜合隸屬函數(shù)綜合評價(jià)法獲得的結(jié)果一致。與其他方法相比，改良的TTC染色面積擬合半致死溫度能更加直觀和準(zhǔn)確地預(yù)測葡萄枝條的抗寒性。