阮 鑫 董曉英

卵泡(follicle)是育齡女性生殖系統(tǒng)的核心功能單位，其發(fā)育的最終目的是產(chǎn)生一個(gè)可育的卵子，能夠完成受精和胚胎發(fā)育的過程[1]?，F(xiàn)代社會(huì)由于環(huán)境因素、精神壓力等導(dǎo)致原始卵泡池過早耗竭，從而導(dǎo)致卵巢功能過早衰退，引發(fā)卵巢儲(chǔ)備功能下降(diminished ovarian reserve, DOR)、早發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency, POI)、最終卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)，嚴(yán)重影響了女性的生殖能力。生育能力的衰退給女性群體帶來了沉重的生理和心理負(fù)擔(dān)，故維持卵泡的正常發(fā)育對女性生殖尤為重要。卵母細(xì)胞(oocyte)與顆粒細(xì)胞(granulosa cell, GC)通過一系列自分泌或旁分泌的方式調(diào)控著卵泡的正常發(fā)育。另有研究發(fā)現(xiàn)，旁分泌途徑依賴于連接蛋白介導(dǎo)的間隙連接進(jìn)行細(xì)胞間通訊使卵泡得到了良好的生長發(fā)育和成熟[1,2]。本文將從能量代謝、細(xì)胞因子、信號通路3個(gè)方面探討間隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊對卵泡發(fā)育的影響。

一、卵泡的生長發(fā)育是衡量卵巢功能的標(biāo)志

卵泡是卵巢中最主要的功能單位，它是由一個(gè)卵母細(xì)胞及包圍卵母細(xì)胞的卵泡細(xì)胞組成。一個(gè)成熟卵泡由原始卵泡啟動(dòng)后經(jīng)歷初級卵泡、次級卵泡和三級卵泡發(fā)育而來，這一過程稱為卵泡發(fā)育(follicular development)。女性的卵泡數(shù)量從一出生就固定了，因其不可再生性，卵泡數(shù)量及其發(fā)育狀態(tài)決定了卵巢的生育潛能。若受到年齡、環(huán)境等因素影響，會(huì)加重卵泡的過早耗竭。

1.GC的增殖分化影響不同階段的卵泡發(fā)育：卵泡發(fā)育與顆粒細(xì)胞增殖密切相關(guān)。從原始卵泡向初級卵泡發(fā)育的過程中，GC的形態(tài)從單層扁平狀增殖為復(fù)層立方形，并且之后隨著卵泡發(fā)育不斷增殖。在此過程中，顆粒細(xì)胞自身分泌表達(dá)kit配體(KITL)，通過與卵母細(xì)胞上的kit受體結(jié)合使卵母細(xì)胞在出生后不久開始生長，因此顆粒細(xì)胞有助于啟動(dòng)原始卵泡開始生長。在有腔卵泡階段，卵丘顆粒細(xì)胞通過幫助卵母細(xì)胞代謝葡萄糖和膽固醇，運(yùn)輸氨基酸等物質(zhì)參與維持卵母細(xì)胞的生長發(fā)育及代謝活動(dòng)。此外，在卵泡發(fā)育的后期階段，顆粒細(xì)胞通過調(diào)節(jié)自身分泌的成熟抑制因子環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的濃度抑制卵母細(xì)胞中以環(huán)磷酸腺苷(cAMP)為導(dǎo)向的磷酸二酯酶(PDE3A)的活性，從而維持卵母細(xì)胞中高濃度的cAMP防止減數(shù)分裂過早成熟以調(diào)控卵泡發(fā)育[2]。

2.卵母細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中的核心作用：卵母細(xì)胞是卵泡中的核心細(xì)胞，卵母細(xì)胞的生長與卵泡發(fā)育相協(xié)調(diào)，故卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟也標(biāo)志著卵泡的成熟。卵母細(xì)胞起源的一系列因子在負(fù)責(zé)指導(dǎo)原始卵泡庫的形成和激活、顆粒細(xì)胞的增殖分化、卵母細(xì)胞的成熟方面具有重要意義。如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族(包括生長分化因子9、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族)，卵母細(xì)胞通過表達(dá)GDF-9和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15,也稱GDF9B)，促進(jìn)GC不斷增殖、分化促進(jìn)卵泡從初級向次級、從腔前向有腔階段的轉(zhuǎn)變[2]。在卵泡的發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞處于優(yōu)勢支配地位，發(fā)揮著積極主動(dòng)的作用，并且這一角色貫穿整個(gè)卵泡發(fā)育的過程。且在發(fā)育的過程中，卵母細(xì)胞中最重要且獨(dú)特的細(xì)胞器——線粒體，是支持卵泡發(fā)育過程中最重要的能量來源[3]。

3.細(xì)胞間通訊是影響卵泡發(fā)育的重要因素：原始卵泡能否最終發(fā)育為一個(gè)優(yōu)勢卵泡并順利排出受到很多因素的影響，如卵泡微環(huán)境、細(xì)胞因子、內(nèi)分泌代謝等。其中卵泡在發(fā)育的過程中的代謝活動(dòng)以自分泌以及旁分泌的方式進(jìn)行，這種旁分泌途徑依賴于卵母細(xì)胞或GC分泌的細(xì)胞因子以及由連接蛋白(Cx)介導(dǎo)的間隙連接來進(jìn)行卵泡內(nèi)物質(zhì)傳遞和信息交流。研究表明，卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)從卵泡中分離并完整培養(yǎng)與在卵母細(xì)胞和GC共培養(yǎng)中提供GC這種方式比較，前者的卵母細(xì)胞生長速度更快，卵泡中卵母細(xì)胞的生長速度與卵泡中COC中所含的GC的數(shù)量呈正比[4]。這在一定程度上能夠說明卵泡中的卵母細(xì)胞與GC之間的物理接觸有促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用，這兩種細(xì)胞通過物理接觸在卵泡內(nèi)進(jìn)行交流的方式稱作細(xì)胞間通訊(intercellular communication, IC)。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的雙向運(yùn)作，共同調(diào)控了卵泡的生長和發(fā)育。

二、卵泡發(fā)育過程中的細(xì)胞間通訊

細(xì)胞間通訊是指細(xì)胞之間通過不同的方式進(jìn)行通訊并且傳遞各種信息[5]。在哺乳動(dòng)物卵泡中同樣也存在著這種能夠進(jìn)行信息交換、物質(zhì)交流的通訊方式——間隙連接(gap junction, GJ)。GJ是介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)直接交換的唯一通道，這個(gè)過程稱為GJIC[6]。

1.GJ與Cx是細(xì)胞間通訊的主要橋梁：卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間通過GJ進(jìn)行細(xì)胞間通訊。GJ是一種細(xì)胞間通道，允許耦聯(lián)細(xì)胞間交換高達(dá)1kDa分子，其基本單位是連接子，它由6個(gè)Cx組成，6個(gè)連接蛋白寡聚體形成半通道，相鄰細(xì)胞的半通道對接產(chǎn)生間隙連接，允許特定的小分子(丙酮酸、核酸、肌醇等)、離子(鈣離子等)和信號通路分子(cAMP、cGMP、IP3等)在細(xì)胞間迅速交換[2，4，7]。哺乳動(dòng)物中的連接蛋白是一個(gè)完整的膜蛋白家族，大約由20個(gè)基因編碼，所以間隙連接中存在的蛋白亞型會(huì)影響其特性，從而影響其細(xì)胞間通訊的類型和效率。在哺乳動(dòng)物卵巢卵泡發(fā)生及卵母細(xì)胞成熟的所有階段中Cx37和Cx43起關(guān)鍵作用，其中Cx37在卵泡發(fā)育的所有階段都存在于卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中，主要參與卵母細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞之間的縫隙連接，而Cx43在顆粒細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，主要參與GC之間的交流以及調(diào)節(jié)自身的增殖與分化[4]。在連接蛋白敲除小鼠的研究中已經(jīng)證明了連接蛋白在卵巢發(fā)育和卵泡發(fā)生過程中的重要性，有研究表明，Cx37的缺失會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞之間的偶合消失，在竇腔形成階段破壞卵泡發(fā)育，使得卵泡的進(jìn)展不會(huì)超過竇前晚期；Cx43的缺失則會(huì)通過影響顆粒細(xì)胞的增殖與分化，使卵母細(xì)胞外圍的顆粒細(xì)胞不能發(fā)展到第2層，此時(shí)的卵泡被認(rèn)為是初級卵泡[8]。Zhang等[7]通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測到在COC中存在著Cx37的表達(dá)，從而證明卵母細(xì)胞與GC之間通過Cx37介導(dǎo)的連接通道進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流促進(jìn)卵泡發(fā)育。

2.Cx43介導(dǎo)的GC間通訊促進(jìn)GC增殖與分化：Cx43被發(fā)現(xiàn)是負(fù)責(zé)人類GC之間連接的主要蛋白類型，它在卵泡發(fā)育的所有階段都在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，主要調(diào)節(jié)體細(xì)胞之間的聯(lián)系，隨著卵泡的發(fā)育，Cx43型的間隙連接數(shù)目會(huì)相應(yīng)的增加以適應(yīng)不斷增殖的體細(xì)胞，其數(shù)量在卵泡后期達(dá)到最大值。Cx43在卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞中的循環(huán)表達(dá)受到激素和發(fā)育的調(diào)節(jié)。在對大鼠的研究中，Cx43的表達(dá)與血清促性腺激素的變化呈正相關(guān)，發(fā)現(xiàn)促性腺激素(FSH)能夠通過上調(diào)Cx43mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)來介導(dǎo)GC之間的交流，從而促進(jìn)GC的增殖與分化[9]。

3.Cx37促進(jìn)GC與卵母細(xì)胞的通訊交流：哺乳動(dòng)物卵泡的發(fā)育是通過所有卵泡結(jié)構(gòu)之間的緊密協(xié)調(diào)和相互作用而發(fā)生的。在卵泡生長早期階段，由于卵泡細(xì)胞中缺乏FSH受體，故卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的串?dāng)_和相互作用對原始卵泡生長的開始很重要[9]。Cx37是連接顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間最主要的蛋白。Teilmann等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠單層的第3階段到多層第4階段卵泡的過渡期間，卵母細(xì)胞表面Cx37間隙連接的數(shù)量顯著增加，且在卵泡發(fā)育的前竇階段達(dá)到最大值，與小鼠卵母細(xì)胞獲得減數(shù)分裂能力的階段一致，且他們還發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞周邊有組織的Cx37定位丟失是卵泡閉鎖的早期跡象，這表明卵母細(xì)胞和體細(xì)胞之間完整的的細(xì)胞通訊對于卵泡健康是必不可少的。此外，在卵泡發(fā)育過程中，GC還為卵母細(xì)胞提供重要的代謝物和能量，從而幫助卵母細(xì)胞發(fā)育。

三、通過細(xì)胞間通訊影響卵泡發(fā)育的途徑

1.能量代謝：卵母細(xì)胞作為最大的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，與體細(xì)胞比較，它的發(fā)育更加消耗能量，所以卵母細(xì)胞平衡的能量代謝對卵泡的良好發(fā)育以及形成一個(gè)可育的胚胎來說至關(guān)重要[11]。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要依賴葡萄糖進(jìn)行供能，但由于卵母細(xì)胞內(nèi)磷酸果糖激酶和乳酸脫氫酶活性較低，因此本身代謝葡萄糖的能力低下，需要依賴GC先將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸和乳酸，然后將代謝物進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至卵母細(xì)胞的線粒體中，卵母細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化(OXPHOS)產(chǎn)生ATP[12]。反過來，卵母細(xì)胞又通過其自身分泌的旁分泌因子上調(diào)GC中的糖酵解基因來保證為其自身輸送大量的丙酮酸[11]。故在卵泡發(fā)育的過程中，卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟主要依賴于GC為其提供能量底物從而進(jìn)行分解供能。

2.細(xì)胞因子：細(xì)胞因子調(diào)控著細(xì)胞的生長發(fā)育，在卵泡的發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞通過間隙連接開始發(fā)送信號，可能與膜相關(guān)kit配體有關(guān)，也被稱為干細(xì)胞因子，它能觸發(fā)靜息期原始卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞開始生長。同樣以互補(bǔ)的方式，處于生長中的卵母細(xì)胞也會(huì)釋放特定的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育，生長分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15，它們屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，是顆粒細(xì)胞正確增殖與分化并誘導(dǎo)竇腔形成的所必需的兩種生長因子[8]。研究表明，缺乏BMP15和GDF9的小鼠表現(xiàn)出較低的表皮生長因子受體(EGFR)的表達(dá)，從而不能促進(jìn)正確的卵丘擴(kuò)張以及改善自身在卵泡中的減數(shù)分裂成熟和發(fā)育能力[13]。此外，Alam等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BMP15和GDF9能夠誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合物(OGC)形成竇狀結(jié)構(gòu)，促進(jìn)卵泡發(fā)育。

3.信號通路：卵泡發(fā)育的過程中涉及多條信號通路。在初始卵泡激活階段，PI3K/AKT被認(rèn)為是調(diào)節(jié)卵巢休眠的主要信號通路，該通路的激活會(huì)導(dǎo)致其下游蛋白FOXO3的磷酸化和核輸出，從而觸發(fā)原始卵泡的激活[15]。在之后的卵泡發(fā)育過程中，GC不斷增殖依賴于卵母細(xì)胞分泌的一系列生長因子，其中TGF-β超家族成員BMP與SMAD通路關(guān)系密切，同時(shí)也與促性腺激素第二信使cAMP共同參與GC的增殖與分化[16]。

(1)cAMP信號通路調(diào)控全階段的細(xì)胞間通訊：卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂前期的長期停滯和隨后減數(shù)分裂的恢復(fù)與卵母細(xì)胞內(nèi)第二信使 3′,5′-單磷酸腺苷(cAMP)的水平相關(guān)[17]。哺乳動(dòng)物排卵前的減數(shù)分裂進(jìn)程由卵母細(xì)胞周圍的GC調(diào)控。顆粒細(xì)胞中產(chǎn)生的cGMP通過GJ擴(kuò)散到卵母細(xì)胞中，cGMP通過抑制卵母細(xì)胞裂解物中的cAMP磷酸二酯酶(PDE3A)的活性抑制cAMP水解，使卵母細(xì)胞中cAMP的含量保持在高濃度水平，從而維持減數(shù)分裂前期停滯[18]。而之后在黃體生成素(LH)激增的作用下破壞GJ使得cGMP轉(zhuǎn)移至卵母細(xì)胞的過程被中斷[19]。因此卵母細(xì)胞特異性PDE3A增加導(dǎo)致卵母細(xì)胞中cAMP水平降低，促進(jìn)減數(shù)分裂的恢復(fù)。同時(shí)LH水平的激增也會(huì)導(dǎo)致C型利鈉肽(CNP)的含量開始下降從而降低鳥苷酸環(huán)化酶利鈉肽受體2(NPR2，也稱為鳥苷酸環(huán)化酶B)的活性使cGMP 的水平降低，恢復(fù)減數(shù)分裂促進(jìn)排卵[20]。

(2)SMAD通路調(diào)節(jié)排卵前的細(xì)胞間通訊：細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族在卵泡的發(fā)育和成熟過程中有著非常重要的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(BMP6)屬于TGF-β的一員，源自卵母細(xì)胞和GC的BMP配體，在預(yù)防排卵前卵泡過早黃體化方面起著關(guān)鍵作用[21]。卵母細(xì)胞或顆粒細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)排卵期的細(xì)胞間通訊來預(yù)防過早黃體化，抑制作用機(jī)制可能為ALK2/ALK3介導(dǎo)的SMAD1/SMAD5-SMAD4信號通路所驅(qū)動(dòng)的[22]。

(3)PTK2通路維持細(xì)胞間通訊的穩(wěn)定性：卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞區(qū)室之間最初的連接為黏附接觸，隨著卵泡的發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)轲じ竭B接參與毛囊組織，并穩(wěn)定細(xì)胞間接觸，促進(jìn)GJ的形成。黏著斑激酶(PTK2)能夠充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外信號的主要整合器，其在建立或維持卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞連接中起著關(guān)鍵作用，PTK2能夠促進(jìn)或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞骨架元件的組裝，這些元件能夠穩(wěn)定Cx，使細(xì)胞間間隙連接更加穩(wěn)定，從而更好地轉(zhuǎn)導(dǎo)卵母細(xì)胞與GC之間的通訊信號[23]。

(4)kit通路調(diào)控排卵前的細(xì)胞間通訊：kit受體(也稱CD117)是Ⅲ型酪氨酸激酶，配體是干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF),kit受體和KITL都在發(fā)育中和排卵前的卵泡中表達(dá)。KITL為卵泡內(nèi)旁分泌因子，由顆粒細(xì)胞分泌，其依賴卵泡刺激素(FSH)的調(diào)節(jié)，低濃度的FSH增加GC分泌KITL2以刺激卵母細(xì)胞中的kit受體激活和下游PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長和卵泡發(fā)育[24]。

四、展 望

間隙連接是參與卵泡內(nèi)細(xì)胞間通訊的一種重要的交流方式。在Munakata等[25]對卵母細(xì)胞周圍細(xì)胞數(shù)量與卵母細(xì)胞能量狀態(tài)的關(guān)系的研究中得到了證實(shí)，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞通過間隙連接為卵母細(xì)胞提供代謝底物使其進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生供給自身發(fā)育的能量，卵母細(xì)胞周圍的GC數(shù)量將決定卵母細(xì)胞的能量充足性。此外，在Alam等[14]研究中發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞又通過GJ為顆粒細(xì)胞提供生長分化的細(xì)胞因子促進(jìn)其不斷增殖進(jìn)而調(diào)控卵泡的發(fā)育。因此可以認(rèn)為，間隙連接在卵泡內(nèi)的能量代謝、細(xì)胞增殖分化、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程等卵泡的發(fā)育過程中至關(guān)重要。但當(dāng)透明帶形成以后，其外圍的GC如何與卵母細(xì)胞取得聯(lián)系從而促進(jìn)卵泡進(jìn)一步發(fā)育，通過細(xì)胞間通訊如何改善卵泡的發(fā)育，以及恢復(fù)卵巢功能下降患者的生殖能力尚缺乏深入研究。故通過探索顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的雙向通訊為進(jìn)一步揭示卵泡發(fā)育機(jī)制，解決因卵巢功能下降導(dǎo)致的卵泡發(fā)育障礙，最終為改善女性的生殖能力提供新思路。