Dickkopf家族蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制中的作用

鄒璐蔚 李宗宇 劉春萍 杜曉玲 呂湛

(川北醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川 南充637000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多種心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，它由多種病理因素參與，包括內(nèi)皮損傷及功能異常、慢性炎癥、脂質(zhì)浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞的形成等[1]。近年有研究發(fā)現(xiàn)了多種與AS發(fā)生機(jī)制相關(guān)的信號(hào)通路，其中Wnt信號(hào)通路得到了越來(lái)越多的關(guān)注，隨著研究的深入，Dickkopf(DKK)家族蛋白作為Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子，與AS的關(guān)系也得到重視?，F(xiàn)對(duì)DKK家族蛋白在AS發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用做一綜述，進(jìn)而探討DKK成為心血管疾病新型干預(yù)靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物的可能性。

1 DKK家族蛋白

DKK家族蛋白[2]是一類保守的分泌型糖蛋白。在脊椎動(dòng)物中，DKK家族蛋白由255～350個(gè)氨基酸組成，共有DKK1～4四個(gè)成員，所有DKK家族蛋白均包含2個(gè)保守的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，其中DKK1、DKK2和DKK4結(jié)構(gòu)高度相似，除此之外，DKK3還擁有一個(gè)位于N端的Soggy蛋白，這也導(dǎo)致了它與其他成員在功能上存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，DKK家族蛋白可參與正常組織器官發(fā)育及多種疾病病理過(guò)程，例如發(fā)育缺陷、AS、癌癥、神經(jīng)退行性疾病和關(guān)節(jié)炎等。

2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路簡(jiǎn)介

Wnt信號(hào)通路分為β-catenin依賴型信號(hào)通路(經(jīng)典Wnt信號(hào)通路)和非β-catenin依賴型信號(hào)通路(非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路)，它參與許多復(fù)雜的生理病理活動(dòng)和生化反應(yīng)，失調(diào)的Wnt信號(hào)通路不僅可能促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖和遷移，還可能參與心血管疾病的發(fā)病[3]。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路是通過(guò)Wnt信號(hào)配體與7次跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled受體，F(xiàn)z受體)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)三者結(jié)合，信號(hào)傳遞后可減弱由β-catenin與軸蛋白、糖原合成酶激酶-3β、結(jié)直腸腺瘤性息肉基因組成的降解復(fù)合物(后稱泛素-蛋白酶體系統(tǒng))的穩(wěn)定性，阻止β-catenin被磷酸化降解，促進(jìn)β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積聚，從而使大量游離的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，參與調(diào)控下游基因表達(dá)。

目前許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究[4]表明，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路可能作為重要一環(huán)參與AS的發(fā)生。Du等[5]通過(guò)測(cè)定大鼠AS模型中炎癥細(xì)胞因子含量以及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，與對(duì)照組對(duì)比得出，AS導(dǎo)致的炎癥環(huán)境可激活動(dòng)脈壁中的Wnt信號(hào)通路，并導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，破壞血管內(nèi)皮的屏障功能。

3 DKK1

DKK1作為DKK家族蛋白代表型成員，在腫瘤學(xué)領(lǐng)域中被認(rèn)為是很有希望的一類抗癌治療靶點(diǎn)，隨著對(duì)其深入的研究，發(fā)現(xiàn)DKK1也參與到脂質(zhì)浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能減退、炎癥反應(yīng)、血管鈣化等AS病理過(guò)程中，進(jìn)而開始探討它作為AS治療新靶點(diǎn)和心血管疾病預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)的可能性。

3.1 DKK1與Wnt信號(hào)通路

DKK1主要通過(guò)兩種方式負(fù)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路[6]：(1)競(jìng)爭(zhēng)性抑制LRP5/6，從而減少經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的配體-Fz-LRP5/6三元復(fù)合物形成；(2)DKK1與LRP5/6、跨膜蛋白Krm(Kremen)形成三元復(fù)合物，同時(shí)觸發(fā)內(nèi)吞并降解LRP5/6，導(dǎo)致細(xì)胞膜上的LRP5/6含量降低。通過(guò)以上兩種途徑，DKK1可抑制Wnt信號(hào)，一旦Wnt信號(hào)無(wú)法下傳，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活化并降解β-catenin，從而使其不能入核參與調(diào)控基因表達(dá)[7]。細(xì)胞膜上LRP5/6水平的降低可導(dǎo)致脂質(zhì)及糖類代謝紊亂，引起人體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯和血糖水平升高[8]。此外，DKK1還有可能通過(guò)直接或間接的方式改變經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的平衡，進(jìn)而影響非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，但其具體方式尚未明確[9]。

3.2 DKK1與AS

Ueland等[10]分別測(cè)定了心絞痛組和健康對(duì)照組中的血清DKK1水平，發(fā)現(xiàn)心絞痛組(特別是不穩(wěn)定型心絞痛患者組)顯著高于健康對(duì)照組；他們還分別測(cè)定了心絞痛組與健康對(duì)照組在血小板缺乏的血漿中的DKK1水平，發(fā)現(xiàn)兩組水平無(wú)顯著差異，從而推論心絞痛患者的血小板在聚集激活過(guò)程中可迅速釋放大量DKK1。同時(shí)，Ueland等[10]在對(duì)患者斑塊破裂部位的血小板以及有癥狀的頸動(dòng)脈斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫染色后，觀察到DKK1染色陽(yáng)性，提示DKK1可能參與AS的發(fā)生發(fā)展，由此國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始對(duì)DKK1在心血管疾病特別是AS中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

3.2.1 DKK1參與脂質(zhì)浸潤(rùn)

巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白，形成泡沫細(xì)胞，刺激平滑肌細(xì)胞遷移并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分，進(jìn)而形成纖維帽。在Borrell-Pagès等[11]的實(shí)驗(yàn)中，將小鼠分為lrp5-/-小鼠組與正常小鼠組，并將每一組內(nèi)的小鼠分為普通飲食組和高脂飲食組，喂養(yǎng)8周后，對(duì)小鼠血清膽固醇及AS病變程度進(jìn)行量化，觀察到高脂飲食的lrp5-/-小鼠血液中膽固醇水平的總體增長(zhǎng)比高脂飲食的正常小鼠更明顯。同時(shí)，還觀察到無(wú)論是lrp5-/-小鼠組，還是正常小鼠組，經(jīng)高脂喂養(yǎng)后，小鼠的胸主動(dòng)脈區(qū)域脂質(zhì)沉積都有增加，其中l(wèi)rp5-/-小鼠組較正常小鼠組更明顯。這提示了DKK1誘導(dǎo)脂質(zhì)浸潤(rùn)的一種潛在機(jī)制，即DKK1可通過(guò)觸發(fā)內(nèi)吞和降解LRP5/6，導(dǎo)致細(xì)胞膜上的LRP5/6含量降低，從而參與脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞在血管壁中的滯留。

3.2.2 DKK1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增高，促炎因子積聚，炎性反應(yīng)增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致易損斑塊形成和破裂。Di等[12]在AS小鼠模型中分別過(guò)度表達(dá)DKK1和沉默表達(dá)DKK1，并在一段時(shí)間的高脂飲食喂養(yǎng)后，觀測(cè)到過(guò)度表達(dá)組小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的面積比沉默表達(dá)組明顯增大，且內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，加劇了斑塊不穩(wěn)定性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DKK1是通過(guò)抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，并激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，隨后激活I(lǐng)RE1α和eIF2α/CHOP通路，最后通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)斑塊形成并增加其脆性。

3.2.3 DKK1參與炎癥反應(yīng)

炎癥機(jī)制參與了AS發(fā)生發(fā)展全過(guò)程，增加斑塊的不穩(wěn)定性，貫穿內(nèi)皮損傷、斑塊形成與破裂等階段。Ueland等[10]研究DKK1是否參與炎癥反應(yīng)，通過(guò)沉默DKK1的表達(dá)后測(cè)量評(píng)估人體炎性因子水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)處理后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白-1、白介素(IL)-8和IL-6水平顯著降低，提示DKK1參與血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥作用。同時(shí)，在Lattanzio等[13]的一項(xiàng)橫斷面研究中，將214例2型糖尿病患者與30例健康人進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示糖尿病組的血漿DKK1水平顯著高于健康對(duì)照組。之后還將這214例糖尿病患者分為接受低劑量阿司匹林治療組(阿司匹林100 mg/d)與未接受低劑量阿司匹林治療組，發(fā)現(xiàn)前者血漿DKK1水平較后者明顯降低，提示DKK1參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。還有研究[14]，在一些急性感染性疾病(如肺炎、病毒感染等)和慢性炎癥(如結(jié)腸炎等)中，也都觀察到不同程度的DKK1水平升高。綜上，DKK1參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)微環(huán)境的形成。

3.2.4 DKK1與血管鈣化

血管鈣化是心血管疾病的常見病理類型，涉及動(dòng)脈中礦物質(zhì)沉積等復(fù)雜過(guò)程并受多種途徑的調(diào)節(jié)，其中就包括Wnt信號(hào)通路。之后的一系列研究表明，DKK1作為Wnt信號(hào)通路拮抗劑可能參與血管鈣化的形成，還可能影響血管斑塊的穩(wěn)定性。Szulc等[15]在60歲以上的男性人群中觀察到，DKK1水平越低的患者發(fā)生腹主動(dòng)脈鈣化的嚴(yán)重程度越高，在之前對(duì)患有2型糖尿病的非裔美國(guó)人[16]和絕經(jīng)后婦女[17]的研究中也觀察到了血漿DKK1水平與血管鈣化的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果。結(jié)合DKK1在不穩(wěn)定的AS斑塊中含量很高這一現(xiàn)象，提示DKK1可能影響斑塊的組成成分，比如通過(guò)抑制保護(hù)性片狀鈣化的形成來(lái)增加斑塊的不穩(wěn)定性[18]。相反的是，Motovska等[19]的研究發(fā)現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈造影正常的主動(dòng)脈瓣鈣化患者中，血漿DKK1水平與主動(dòng)脈瓣鈣沉積程度呈正相關(guān)。這提示DKK1可能通過(guò)不同機(jī)制影響血管及瓣膜的鈣化，有待進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

3.3 DKK1作為藥物作用靶標(biāo)

基于上述觀點(diǎn)，許多學(xué)者針對(duì)DKK1能否作為新型藥物作用靶標(biāo)進(jìn)行了一系列動(dòng)物研究及體外研究。Pontremoli等[20]對(duì)高脂飲食兔組應(yīng)用阿托伐他汀治療[2.5 mg/(kg·d)]連續(xù)8周，與普食兔組相比，前者的血漿DKK1水平低于后者。進(jìn)一步采用基于蛋白質(zhì)組學(xué)和DKK1基因沉默的聯(lián)合策略，對(duì)照得出阿托伐他汀作為甲羥戊酸途徑抑制劑可通過(guò)抑制Cde42、Rho和Rac蛋白來(lái)影響基因表達(dá)并下調(diào)DKK1蛋白。但Rakipovski等[21]使用DKK1抗體降低AS小鼠模型的DKK1血漿濃度后，發(fā)現(xiàn)并未改變病變處的粥樣斑塊面積，這可能是因?yàn)榘邏K中缺乏DKK1的表達(dá)。目前對(duì)于DKK1能否作為AS治療的新型靶標(biāo)尚無(wú)定論，且在腫瘤學(xué)領(lǐng)域中，DKK1被證明在大多數(shù)腫瘤中可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，這提示針對(duì)DKK1的治療方案具有兩面性，所以還需更深入的研究來(lái)探討DKK1作為藥物作用靶標(biāo)的可能性。

3.4 DKK1預(yù)測(cè)心血管疾病的預(yù)后

近期一些觀察性研究表明了患者血漿DKK1水平可能與心血管疾病預(yù)后有關(guān)。Wang等[22]為評(píng)估DKK1與急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的關(guān)聯(lián)，在對(duì)291例ACS患者為期2年的隨訪中，有44例(15.1%)發(fā)生了主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)，追溯其入院24 h DKK1水平，發(fā)現(xiàn)患者M(jìn)ACE發(fā)生率隨DKK1水平的升高而增加。對(duì)比GRACE評(píng)分中的各項(xiàng)指標(biāo)，其認(rèn)為入院24 h DKK1水平是ACS患者預(yù)后發(fā)生MACE的高風(fēng)險(xiǎn)長(zhǎng)期預(yù)測(cè)因子，并主張將其納入GRACE風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，從而增強(qiáng)對(duì)ACS患者預(yù)后的評(píng)估能力。而Ueland等[23]持不同意見，他們認(rèn)為前者的試驗(yàn)未考慮到其他重要生物標(biāo)志物(例如N末端腦鈉肽前體、高敏肌鈣蛋白T和生長(zhǎng)分化因子15等)的情況，于是收集了5 165例ACS患者在入院、出院、隨訪1個(gè)月和6個(gè)月這四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的DKK1水平，在對(duì)臨床變量及其他重要生物標(biāo)志物進(jìn)行多變量調(diào)整后，觀察到DKK1水平與心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)之間存在獨(dú)立的關(guān)聯(lián)，但隨訪1個(gè)月這一時(shí)間點(diǎn)的DKK1水平變化與未來(lái)的不良結(jié)局無(wú)關(guān)。同樣，Klingenschmid等[24]的研究結(jié)果也證明人血漿DKK1水平與腦卒中、心肌梗死和冠心病等心血管疾病的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)，他們?cè)诨谌巳旱那罢靶訠runeck研究中，對(duì)706例參試者進(jìn)行了為期16年的隨訪，結(jié)果證明DKK1水平越高，罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)越高，因此也主張DKK1有作為預(yù)測(cè)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物的潛力。

4 DKK3

DKK3基因位于染色體11p15.3，在人體心、腦等器官中廣泛表達(dá)，與DKK1、DKK2和DKK4不同，它攜帶一個(gè)特殊的Soggy蛋白，這使得它與其他DKK家族成員在功能上存在差異。之前的研究主要認(rèn)為DKK3是一種潛在的腫瘤抑制因子，在胰腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中展現(xiàn)出了抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。現(xiàn)有研究顯示DKK3還可抑制AS的發(fā)生發(fā)展，對(duì)心血管有保護(hù)性作用。

在一項(xiàng)觀察性研究中，Wang等[25]發(fā)現(xiàn)人體血清DKK3水平與40～60歲無(wú)臨床癥狀中年人患嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈狹窄的風(fēng)險(xiǎn)呈反比，提示DKK3可能在AS發(fā)展過(guò)程中起負(fù)調(diào)節(jié)的作用。這可能與DKK3可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/激活轉(zhuǎn)錄因子6和Wnt信號(hào)通路，誘導(dǎo)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞有關(guān)，在Karamariti等[26]的實(shí)驗(yàn)中，首先通過(guò)比較DKK3-/-/載脂蛋白E-/-小鼠與DKK3+/+/載脂蛋白E-/-小鼠的斑塊質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)前者存在易損斑塊，后者斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少、基質(zhì)蛋白沉積增加、出血減少，這表明DKK3可能影響斑塊的組成和形成。此外通過(guò)體外分化研究，他們發(fā)現(xiàn)DKK3可刺激血管前體干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞，加強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性。同樣，Chen等[27]的研究證明，DKK3能通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子/microRNA-125a-5p/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為功能性內(nèi)皮細(xì)胞，這可能使斑塊破裂出血減少，提高斑塊穩(wěn)定性。此外，Zhu等[28]在對(duì)3 344例缺血性卒中患者的為期3個(gè)月的隨訪中發(fā)現(xiàn)，血清DKK3水平與缺血性卒中后3個(gè)月內(nèi)死亡和血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈反比，這提示DKK3可能是缺血性卒中的預(yù)后生物標(biāo)志物。

目前的證據(jù)表明，DKK3可在動(dòng)脈粥樣斑塊形成的早期階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，影響斑塊的組成，促進(jìn)血管修復(fù)，并減緩AS的進(jìn)展過(guò)程，但其潛在過(guò)程及影響尚不明確，仍需進(jìn)一步的研究來(lái)闡明DKK3在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及相關(guān)機(jī)制。

5 其他DKK家族蛋白

目前在心血管疾病領(lǐng)域，對(duì)于DKK家族蛋白的研究主要集中在DKK1與DKK3，而對(duì)DKK2及DKK4研究相對(duì)較少。研究[29]發(fā)現(xiàn)，DKK4可能與卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤有關(guān)，參與結(jié)直腸癌的化療抵抗。與其他DKK家族成員相比，它在AS中的作用尚不明確。

巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白，進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞。DKK2在激活巨噬細(xì)胞這一過(guò)程中起著重要作用，Zhang等[30]在AS模型小鼠的骨髓衍生巨噬細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了DDK2主要位于巨噬細(xì)胞質(zhì)中，他們進(jìn)一步沉默DKK2的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞的形成明顯減少，這可能與DKK2水平下降后，Wnt信號(hào)通路受到的抑制減少有關(guān)。

目前已知當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞處于紊亂的血流環(huán)境中時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生表型變化，出現(xiàn)通透性及細(xì)胞因子釋放增加，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附，從而促進(jìn)AS。由此，Li等[31]通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，測(cè)定在紊亂的血流狀態(tài)下頸動(dòng)脈內(nèi)的細(xì)胞種類及亞群，發(fā)現(xiàn)在其中一個(gè)亞群中表達(dá)最高的基因是DKK2，這提示DKK2可能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能參與AS的發(fā)生發(fā)展。

綜合上述國(guó)內(nèi)外研究，DKK家族蛋白可能參與AS和心肌梗死等多種心血管疾病的發(fā)生機(jī)制，還可能作為AS潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，或作為生物標(biāo)志物用于對(duì)患者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分層，但由于不同的研究者發(fā)布的研究結(jié)果存在不一致性，甚至存在研究結(jié)論截然相反的情況，因此，對(duì)于DKK家族蛋白參與AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程的確切機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入探究。