去除無細(xì)胞百日咳疫苗絲狀血凝素純化液中內(nèi)毒素TritonX-114液相分離法的建立及其效果評價

溫嘉納，王虓宇，張光賢，陳林濤，張曉華，趙宸，李娜，孫明波，梁疆莉

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650118

百日咳疫苗生產(chǎn)過程中，細(xì)菌會產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，該成分稱為脂多糖，破碎細(xì)菌獲得蛋白抗原的同時，細(xì)胞壁的內(nèi)毒素會釋放至蛋白溶液中?！稓W洲藥典》8.0版中規(guī)定，無細(xì)胞百白破-脊髓灰質(zhì)炎聯(lián)合疫苗的內(nèi)毒素含量應(yīng)＜100 EU／劑［1］，根據(jù)該要求推算百日咳疫苗中絲狀血凝素（filamentous hemagglutinin，F(xiàn)HA）、百日咳毒素（pertussis toxin PT）及69 kD外膜蛋白（pertactin，PRN）3種原液的內(nèi)毒素含量應(yīng)均＜100 EU／mg，因此必須采取合理有效的方法去除內(nèi)毒素。

通常去除內(nèi)毒素的方法有化學(xué)萃取法（如TritonX-114液相分離法）和離子交換層析法（如離子交換層析）［2-3］。TritonX-114液相分離法經(jīng)濟(jì)高效，已廣泛應(yīng)用于生物制品中內(nèi)毒素的去除［4-5］。1990年，AIDA等［6］采用Triton X-114液相分離法去除重組蛋白溶液中的內(nèi)毒素，隨后有研究采用該方法去除其他生物制品中的內(nèi)毒素，效果均較好［7-8］。TritonX-114是一種非離子型表面活性劑［9-11］，在低溫時成水溶性，溫度升高后變?yōu)橹苄裕哂休^低的臨界膠束濃度，于4℃可與水溶液互溶，并與脂多糖分子結(jié)合；25℃以上能攜帶脂多糖分子從水相中析出。利用TritonX-114的特性，本研究建立適合于百日咳疫苗FHA純化液去除內(nèi)毒素的TritonX-114液相分離法，并評價其去除效果。

1 材料與方法

1.1 純化液 無細(xì)胞百日咳疫苗FHA純化液（批號：20200901-01、20201101-01、20201101-02、20201101-03）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備。

1.2 主要試劑TritonX-114及Lowry蛋白測定試劑盒均購自北京Solarbio公司；內(nèi)毒素鱟試劑購自湛江安度斯生物有限公司。

1.3 正交試驗FHA純化液（20200901-01）中加入一定濃度的TritonX-114，4℃振蕩混勻，37℃靜止分層，經(jīng)16 743×g離心后，含有內(nèi)毒素的液相位于下層，提取上層液相，去除下層液相，達(dá)到去除內(nèi)毒素目的。根據(jù)TritonX-114液相分離法所需條件，設(shè)計4因素［TritonX-114加入量（A）、4℃混勻時間（B）、37℃分層時間（C）、25℃16 743×g離心時間（D）］及3水平，共12組正交試驗，見表1和表2。以純化液回收率作為因變量確定各因素的最佳值。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)正交設(shè)計、線性模型單變量分析、主體間效應(yīng)檢驗、四因素同回收率檢驗，依據(jù)純化液蛋白回收率及P值結(jié)果，確定最佳內(nèi)毒素去除條件（以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。

表1 正交試驗因素及水平Tab.1 Factors and levels in orthogonal test

表2 正交試驗設(shè)計Tab.2 Design of orthogonal test

1.4 內(nèi)毒素去除效果的評價 以正交試驗確定的最佳條件去除3批無細(xì)胞百日咳疫苗FHA純化液（批號：20201101-01、20201101-02、20201101-03）的內(nèi)毒素，檢測去除內(nèi)毒素后純化液的FHA蛋白含量、內(nèi)毒素含量及TritonX-114殘留量。同時將去除內(nèi)毒素前后的FHA純化液進(jìn)行10%SDS-PAGE分析。

1.5 內(nèi)毒素及FHA蛋白含量的檢測 分別按照《中國藥典》三部（2015版）中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測凝膠法及Lowry蛋白檢測法進(jìn)行檢測［12］。

1.6 TritonX-114殘留量檢測 參照文獻(xiàn)［13］的濁度法檢測樣品的TritonX-114殘留量，其原理為TritonX-114與苯酚反應(yīng)可產(chǎn)生一定濁度的復(fù)合物，濁度與TritonX-114的濃度成正比，通過測定A340計算TritonX-114殘留量。

2 結(jié) 果

2.1 正交試驗結(jié)果 加入不同TritonX-114的FHA純化液蛋白回收率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中，加入量為1%時蛋白回收率最高，因此選擇1%為最佳TritonX-114加入量。隨著4℃混勻時間、37℃分層時間、25℃16 743×g離心時間的變化，純化液回收率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)4℃混勻時間為30 min，37℃分層時間為60 min，25℃167 43×g離心時間為10 min時，蛋白回收率最高，見表3和表4。因此確定該條件為最佳檢測條件。

2.2 內(nèi)毒素去除效果20201101-01、20201101-02、20201101-03批無細(xì)胞百日咳疫苗FHA純化液在最佳條件下去除內(nèi)毒素后，內(nèi)毒素含量均＜0.25 EU／mL，去除率均＞99%；TtitonX-114殘留量均值為0.183%；蛋白回收率均值為91.04%。見表5。表明FHA生物活性在去除內(nèi)毒素前后無變化。10%SDS-PAGE分析顯示，去除內(nèi)毒素前后FHA純化液均可見相對分子質(zhì)量約220 000的目的蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，純度＞95%，符合FHA純化液的純度要求，見圖1。

表3 正交試驗結(jié)果Tab.3 Result of orthogonal test

表4 正交設(shè)計的方差分析表Tab.4 Variance analysis of orthogonal design

表5 去除內(nèi)毒素后無細(xì)胞百日咳疫苗FHA純化液的檢測結(jié)果Tab.5 Test result of purified FHA of acellular pertussis vaccine after removal of endotoxin

圖1 FHA純化液的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE profile of purified FHA

3 討 論

本研究通過正交試驗確定了TritonX-114去除百日咳疫苗FHA純化液中內(nèi)毒素的最佳條件為：TritonX-114加入量為1%，4℃混勻時間為30 min，37℃分層時間為60 min，25℃16 743×g離心時間為10 min。采用優(yōu)化的最佳條件去除無細(xì)胞百日咳疫苗FHA純化液中的內(nèi)毒素后，內(nèi)毒素含量＜0.25 EU／mL，優(yōu)于《歐洲藥典》8.0版中對內(nèi)毒素要求［1］；蛋白回收率為91.04%，且SDS-PAGE純度較高。

本課題組前期研究采用柱層析法去除FHA原液內(nèi)毒素，結(jié)果表明，使用Capto adhere層析柱可將FHA純化液中內(nèi)毒素降至100 EU／mL以下，蛋白回收率＜75%［14］，且在該方法操作中需考慮抽提物的質(zhì)量濃度、層析法的緩沖體系、pH條件、柱床比例、流速等諸多因素。與該結(jié)果比較，本研究采用TritonX-114液相分離法在內(nèi)毒素去除及蛋白回收率上占有一定優(yōu)勢，且縮短了處理時間，簡化了處理流程。同時TritonX-114液相分離法由于投入成本低，涉及物料簡單，可較好地控制研發(fā)生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。

《中國藥典》三部（2015版）中未對TritonX-114殘留量進(jìn)行規(guī)定，參照重組乙型肝炎疫苗半成品對表面活性劑TritonX-100的含量要求（＜15μg／mL），TritonX-114對FHA原液抽提后殘留量＜1 ng／mL，遠(yuǎn)低于該版《中國藥典》中其他疫苗的要求［12］。有報道表明，以TritonX-114液相分離法提取的RNA對BALB／c小鼠無不良反應(yīng)，對家兔也無發(fā)熱作用［15］，表明TritonX-114具有較好的安全性。

綜上所述，采用TritonX-114液相分離法去除無細(xì)胞百日咳疫苗FHA純化液內(nèi)毒素，內(nèi)毒素可降低至0.25 EU／mL，且TritonX-114殘留量＜1 ng／mL，該方法具有良好的應(yīng)用前景。另外，TritonX-114是否適用于無細(xì)胞百日咳疫苗其他兩組分PT及PRN內(nèi)毒素的去除有待進(jìn)一步深入研究。