劉磊，董星辰，梁家政，宋旭東，丁漣沭

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 淮安 223001)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦惡性腫瘤，由幾種表型和分子類型不同的腫瘤組成，根據(jù)世界衛(wèi)生組織制訂的分級系統(tǒng)，腦膠質(zhì)瘤分為1級(惡性程度最低、預(yù)后最好)到4級(惡性程度最高、預(yù)后最差)[1]。美國每年新診斷原發(fā)性腦腫瘤約5萬例，其中約50%患者腦腫瘤的組織病理學(xué)分類為膠質(zhì)瘤，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)最具侵襲性。GBM自發(fā)且發(fā)展迅速，幾乎沒有已知的危險因素，與家族遺傳關(guān)系不大(<1%)，患者5年生存率低于5%[2]。目前GBM的治療包括手術(shù)切除、化療、放療、抗血管生成藥物和交變電場、免疫治療等綜合治療，但患者預(yù)后較差。

膠質(zhì)瘤由獨(dú)特的遺傳和表觀遺傳變化導(dǎo)致的關(guān)鍵生物通路上調(diào)或沉默引發(fā)，上述變化的下游效應(yīng)通過調(diào)節(jié)復(fù)雜的信號通路和蛋白質(zhì)之間的相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、侵襲和凋亡。癌癥基因組圖譜提供了低級別膠質(zhì)瘤和GBM基因組特征的詳細(xì)視圖，膠質(zhì)瘤中廣泛的基因突變和信號異常是腫瘤生長、侵襲以及血管生成和抗凋亡的內(nèi)在驅(qū)動因素[3]。根據(jù)基因表達(dá)對GBM診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新定義，有助于針對分子靶點(diǎn)GBM進(jìn)行精準(zhǔn)治療。在眾多的免疫療法中，嵌合抗原受體基因修飾T細(xì)胞(chimeric antigen receptor gene modified T cell，CAR-T細(xì)胞)治療被認(rèn)為是最具潛力和前景的治療方式之一。目前，CAR-T細(xì)胞治療是腫瘤學(xué)中最有效的治療選擇之一，臨床采用其治療CD19陽性白血病和淋巴瘤的效果較好[4]。美國食品藥品管理局已經(jīng)批準(zhǔn)CAR-T細(xì)胞治療用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療[5]?，F(xiàn)就CAR-T細(xì)胞治療GBM的研究進(jìn)展予以綜述。

1 CAR-T細(xì)胞概述

1.1CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu) CAR-T細(xì)胞是一種基因修飾的T細(xì)胞，其表面表達(dá)的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)可識別和降解腫瘤細(xì)胞。CAR由細(xì)胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域(又稱胞外區(qū))、跨膜結(jié)構(gòu)域(又稱鉸鏈區(qū))和細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞信號結(jié)構(gòu)域三個部分組成[6]。胞外區(qū)由單鏈可變區(qū)組成，單鏈可變區(qū)來源于抗體的輕鏈和重鏈，該結(jié)構(gòu)域有助于以非人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)依賴的方式識別腫瘤特異性抗原。鉸鏈區(qū)是連接細(xì)胞外區(qū)和跨膜區(qū)的連接域，來源于IgG4或CD8分子，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由CD3ζ組成，可觸發(fā)和激活免疫反應(yīng)。

1.2CAR-T細(xì)胞迭代歷程 在第一代CAR-T細(xì)胞中，僅CD3ζ可作為胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，只能提供T細(xì)胞活化信號，其難以在體內(nèi)增殖，且抗瘤活性較低。在第二代和第三代CAR-T細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域中加入CD137、CD28、OX40等共刺激分子，第二代由一個共刺激結(jié)構(gòu)域組成，第三代CAR-T細(xì)胞則能夠搭載多個共刺激分子結(jié)構(gòu)域，使CAR-T細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞因子釋放量明顯增加，有效延長了其在體內(nèi)的生存時間，具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。第四代CAR-T細(xì)胞有白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-12和IL-15等額外的基因編碼的抗腫瘤細(xì)胞因子[7]，并在CAR-T細(xì)胞原有基因編碼的基礎(chǔ)上增加了調(diào)控功能，形成自殺啟動型、負(fù)性調(diào)節(jié)型、開關(guān)啟動型CAR-T細(xì)胞，從而更好地控制CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷反應(yīng)。目前，第四代CAR-T細(xì)胞已經(jīng)廣泛用于臨床研究，其功能作用主要依賴于細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

1.3CAR-T細(xì)胞制作過程 CAR-T細(xì)胞治療是一種基于自體細(xì)胞的治療方法，利用白細(xì)胞分離術(shù)分離外周血T細(xì)胞，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將CAR構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到活化的T細(xì)胞中，然后轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞通過體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增，在不同系統(tǒng)產(chǎn)生不同比例的效應(yīng)型、幼稚型或記憶型T細(xì)胞?？梢?，通過改變條件、控制表型即可產(chǎn)生特定的T細(xì)胞子集[8]。

1.4CAR-T細(xì)胞治療的作用機(jī)制 CAR-T細(xì)胞治療是一種定制的腫瘤免疫療法，將體外修改的免疫成分重新注入患者體內(nèi)是CAR-T治療的基礎(chǔ)。CAR-T細(xì)胞識別腫瘤特異性抗原并與其結(jié)合，可活化初級T細(xì)胞，并導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放、溶細(xì)胞性脫顆粒和T細(xì)胞增殖[9]。附加的T細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制和記憶反應(yīng)以依賴于共刺激機(jī)制的方式發(fā)生。因此，CAR-T細(xì)胞能夠誘導(dǎo)確定的腫瘤相關(guān)抗原為靶點(diǎn)的持久的抗腫瘤效應(yīng)[10]。一般情況下，CD8+T細(xì)胞是引起腫瘤細(xì)胞溶解和降解的細(xì)胞毒細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞起輔助作用，可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性[11]。CAR-T細(xì)胞可激活Fas/Fas配體死亡受體途徑并分泌破壞腫瘤細(xì)胞的穿孔素酶，從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用。

1.5CAR-T細(xì)胞抗原靶點(diǎn) 用于CAR-T細(xì)胞治療的抗原靶點(diǎn)包括IL-13受體α2、人表皮生長因子受體2、表皮生長因子受體變異體Ⅲ(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)，上述靶點(diǎn)在GBM呈特異性表達(dá)，且其過表達(dá)多提示患者預(yù)后不良。Wu等[12]發(fā)現(xiàn)，針對IL-13受體α2、人表皮生長因子受體2、EGFRvⅢ的CAR-T細(xì)胞在兒童GBM的臨床治療中表現(xiàn)出良好的療效，且不良事件發(fā)生率較低。此外，其他潛在靶點(diǎn)(人酪氨酸蛋白激酶受體A2、雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、分化抗原簇70等)在GBM中的應(yīng)用尚有待進(jìn)一步臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。

2 GBM治療現(xiàn)狀

GBM是最常見的原發(fā)性腦惡性腫瘤，侵襲性極強(qiáng)、預(yù)后極差。目前GBM的治療方案包括手術(shù)切除、局部和全身化療、放療、抗血管生成藥物和交變電場等，但GBM患者預(yù)后較差，中位總生存期為12～15個月。GBM主要以手術(shù)切除治療，即使術(shù)中完成切除腫瘤，術(shù)后仍會復(fù)發(fā)，且化療的作用也十分有限。GBM是一種高度變異和異質(zhì)性的腫瘤，對化療不敏感，且對正常、健康組織有不良影響。此外，血腦屏障阻止了絕大多數(shù)腫瘤治療藥物進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)[13-14]，這是影響化療成功的另一個主要原因。

腫瘤微環(huán)境的免疫抑制特性會抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖，限制腫瘤細(xì)胞裂解[15]。術(shù)后存在腫瘤殘留的GBM患者，即使接受輔助化療和放療，預(yù)后也較差。除放療外，目前GBM治療還可選擇烷基化和抗血管生成藥物(如替莫唑胺、貝伐單抗)，但其臨床益處和生存率改善作用有限?；诿庖咧委煹难杆侔l(fā)展，尤其是T細(xì)胞代表了抗腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵成分，因其具有異質(zhì)性和突變負(fù)荷的特點(diǎn)，故可作為高度特異的腫瘤細(xì)胞抗原，因此，CAR-T細(xì)胞免疫治療是治療復(fù)發(fā)性GBM的一種新選擇。CAR-T細(xì)胞治療是一種將基因工程、非HLA依賴、抗原特異性受體插入T細(xì)胞的過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法，其可以啟動腫瘤特異性和持續(xù)性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

3 GBM的CAR-T細(xì)胞治療

3.1GBM免疫治療特點(diǎn) 腫瘤細(xì)胞利用免疫系統(tǒng)進(jìn)行增殖和轉(zhuǎn)移。常見的腫瘤免疫逃逸機(jī)制包括抗原性喪失、免疫原性喪失(抗原處理或呈遞缺陷)、免疫抑制特性[如分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)]、癌基因和抑癌基因的遺傳改變以及免疫檢查點(diǎn)[細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4和程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)]的過表達(dá)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)因缺乏功能性的淋巴系統(tǒng)而被認(rèn)為有免疫豁免特權(quán)，不能通過外周免疫進(jìn)行監(jiān)測。研究發(fā)現(xiàn)，硬腦膜中存在淋巴管網(wǎng)絡(luò)[16]。淋巴管通常將間質(zhì)液體從組織中排出，使其降解并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。在感染或癌癥期間，淋巴運(yùn)輸通過向引流淋巴結(jié)提供抗原和抗原前體細(xì)胞建立適應(yīng)性免疫反應(yīng)。大腦通過淋巴回流將腦脊液(攜帶細(xì)胞外蛋白、抗原和溶質(zhì))和間質(zhì)液體進(jìn)行廣泛交換，使間質(zhì)液體被收集并排入頸部淋巴結(jié)[17]，故認(rèn)為大腦受外周免疫系統(tǒng)調(diào)控，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)并沒有獲得免疫特權(quán)[18]。

3.2CAR-T細(xì)胞治療

3.2.1CAR-T細(xì)胞治療的特點(diǎn) CAR-T細(xì)胞治療提供了一種新的方法來繞過缺陷的免疫系統(tǒng)，對抗與GBM相關(guān)的血腦屏障和腫瘤微環(huán)境所造成的各種障礙。T細(xì)胞工程技術(shù)可構(gòu)建一種自體細(xì)胞產(chǎn)物，該產(chǎn)物的單鏈可變片段的靶向親和力高，能夠增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞識別抗原與活化的能力，繼而發(fā)揮抗腫瘤作用[19-20]。CAR-T細(xì)胞治療主要通過結(jié)合顆粒酶/穿孔素裂解途徑與單鏈抗體的特異性介導(dǎo)強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)。

3.2.2CAR-T細(xì)胞治療的優(yōu)勢 傳統(tǒng)的T細(xì)胞受體的激活過程復(fù)雜，需要經(jīng)過抗原處理和抗原呈遞多個步驟，以激活主要組織相容性復(fù)合體依賴的T細(xì)胞，且T細(xì)胞反應(yīng)僅限于多肽抗原。但CAR-T細(xì)胞是一種基因工程受體，可不依賴于主要組織相容性復(fù)合體[20]來誘導(dǎo)抗原的高度特異靶向性。在膠質(zhì)瘤中，主要組織相容性復(fù)合體通常下調(diào)[21]，因此CAR-T細(xì)胞的優(yōu)越性顯得尤為突出。此外，CAR-T細(xì)胞不依賴于HLA和抗原呈遞，也能對非肽類抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答[22]。因此，CAR-T細(xì)胞中存在HLA非依賴的、腫瘤特異性的T細(xì)胞活化和增殖，并可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的溶解和降解。此外，表達(dá)CD28信號域的CAR-T細(xì)胞可以促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生，并維持T細(xì)胞的增殖，且CAR-T細(xì)胞還可以抵抗由TGF-β和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制。

與常規(guī)GBM治療相比，CAR-T細(xì)胞治療具有不可替代的絕對優(yōu)勢。首先，GBM常表現(xiàn)出抗原呈遞和主要組織相容性復(fù)合體呈遞缺陷[23]，且不表達(dá)激活幼稚T細(xì)胞所需的共刺激分子，導(dǎo)致腫瘤特異性T細(xì)胞缺失。然而，CAR-T細(xì)胞治療不需要抗原呈遞，且CAR結(jié)構(gòu)包括共刺激結(jié)構(gòu)域，故無初級免疫反應(yīng)過程。其次，CAR-T細(xì)胞可直接定位于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是一組具有獨(dú)特分子特征的細(xì)胞，可形成腫瘤生態(tài)位，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[24]。體外研究證實(shí)，CAR-T細(xì)胞治療具有對抗膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的有效性[25]。此外，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)的人表皮生長因子受體2、EGFRvⅢ和IL-13受體α2是目前針對GBM中CAR-T細(xì)胞的腫瘤相關(guān)抗原靶標(biāo)的主要研究對象[26]。因此，CAR-T細(xì)胞治療可能有助于清除具有自我更新能力且利于腫瘤增殖的細(xì)胞，而這些細(xì)胞常導(dǎo)致抗腫瘤治療耐藥性的產(chǎn)生。最后，CAR-T細(xì)胞治療避免了HLA分子下調(diào)帶來的影響。HLA分子下調(diào)是腫瘤免疫逃逸的典型機(jī)制，而CAR-T細(xì)胞不需要與HLA分子相互作用。

3.3CAR-T細(xì)胞治療GBM的臨床前研究及應(yīng)用 CAR-T細(xì)胞需克服膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境中各種因素的抑制作用，才能實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向識別和殺傷，其中任何步驟受阻均可能嚴(yán)重影響CAR-T細(xì)胞治療的效果和安全性。CAR-T細(xì)胞成功進(jìn)入膠質(zhì)瘤后會遇到兩個主要障礙：①免疫抑制細(xì)胞和膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境中的抑制分子對CAR-T細(xì)胞的抑制和損害作用；②腫瘤抗原識別的干擾，主要由膠質(zhì)瘤異質(zhì)性和特異抗原不足導(dǎo)致，兩者均是導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞功能失效的重要原因。臨床前研究提示，單靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞治療的臨床效果欠佳，但多靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞以及改善免疫微環(huán)境的復(fù)合型CAR-T細(xì)胞治療的效果較好[27]。非單靶標(biāo)CAR結(jié)構(gòu)(雙靶CAR和多靶CAR等)被廣泛研究，近年研究發(fā)現(xiàn)，非單靶標(biāo)CAR結(jié)構(gòu)可提高CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合效率，避免抗原逃逸[28]。

近年來，CAR-T細(xì)胞治療用于膠質(zhì)瘤治療的研究逐漸增多，特別是對于敲除PD-1的EGFRvⅢ-CAR-T細(xì)胞治療GBM的研究。大多數(shù)GBM表現(xiàn)出EGFR的頻繁擴(kuò)增，提高了GBM的增殖、侵襲能力和治療耐藥性，且EGFRvⅢ作為EGFR改變的子集，約占GBM標(biāo)本的30%[29]。由于EGFRvⅢ在GBM細(xì)胞中表達(dá)，其突變是理想的CAR-T治療靶點(diǎn)[30-31]。程序性細(xì)胞死亡因子配體1表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，包括GBM細(xì)胞[32-35]。腫瘤相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡因子配體1與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞上的PD-1結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞凋亡，從而抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。抑制PD-1的表達(dá)可促進(jìn)抗原特異性CAR-T細(xì)胞的存活，因此PD-1阻斷治療CAR-T細(xì)胞可能為GBM的治療提供新思路[36]。Zhu等[37]發(fā)現(xiàn)，PD-1基因敲除增強(qiáng)了EGFRvⅢ-CAR-T細(xì)胞對程序性細(xì)胞死亡因子配體1的EGFRvⅢ GBM細(xì)胞的裂解活性。

Hegde等[38]設(shè)計了一種CAR，它與人表皮生長因子受體2結(jié)合單鏈可變區(qū)以及IL-13受體α2結(jié)合IL-13突變體相連接形成的串聯(lián)CAR-T細(xì)胞能夠增強(qiáng)小鼠GBM模型T細(xì)胞功能，并減少抗原逃逸。細(xì)胞內(nèi)源性TGF-β是多種實(shí)體腫瘤中的免疫抑制因子。Chang等[39]的研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤治療中，CAR-T細(xì)胞靶向多種可溶性配體(包括TGF-β等)的療效顯著，故TGF-β可作為T細(xì)胞的有效靶點(diǎn)。

常規(guī)CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤面臨多重挑戰(zhàn)，其中包括腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。Tang等[40]采用CRISPR/CAS9技術(shù)完全阻斷TGF-β信號后，不僅有效阻止了CAR-T細(xì)胞的耗竭，還提高了CAR-T細(xì)胞的增殖。敲除TGF-β基因可極大地改善CAR-T細(xì)胞在富含TGF-β的腫瘤環(huán)境中的體內(nèi)外功能，為提高CAR-T細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤的效果提供了一種新方法。綜上所述，通過多靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞或構(gòu)建復(fù)合型CAR-T細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤均獲得了一定的臨床療效。

4 小 結(jié)

目前，CAR-T細(xì)胞治療GBM的臨床應(yīng)用效果尚不明確，仍存在很多問題，如CAR-T細(xì)胞腫瘤浸潤的增強(qiáng)、輸液劑量和頻率的優(yōu)化、免疫抑制腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)以及膠質(zhì)瘤異質(zhì)性和特異抗原的不足等。由于GBM異質(zhì)性以及缺乏相對特異性腫瘤抗原治療靶點(diǎn)，目前需要尋找特異性更強(qiáng)的靶抗原和優(yōu)化的CAR結(jié)構(gòu)，以提高CAR-T細(xì)胞對抗免疫抑制微環(huán)境的能力。此外，由于單一CAR分子修飾T細(xì)胞并不能有效地清除腦腫瘤細(xì)胞，因此必須引入二次基因改造，以產(chǎn)生更有效的CAR-T細(xì)胞，但額外修飾常引發(fā)各種安全性和毒性問題。綜上，使用安全開關(guān)(如自殺基因)誘導(dǎo)或控制CAR系統(tǒng)可能會解決CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的毒性問題。隨著研究的不斷深入，未來CAR-T細(xì)胞將安全有效地用于GBM的臨床治療。