長鏈非編碼RNA調(diào)控成骨分化對骨代謝疾病影響的研究進展

孫文婷，吳 娟，穆聞君，孔維萍

（1.北京中醫(yī)藥大學 研究生院， 北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 中醫(yī)風濕病科，北京 100029；3.免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029）

長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200bp 的不編碼蛋白質(zhì)的RNA，lncRNA 在早期被認為是無生物學功能的 “轉(zhuǎn)錄噪音”，屬于RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學功能[1]。 隨著人們對lncRNA 的了解加深，發(fā)現(xiàn)lncRNA 在生物發(fā)育、基因表達等眾多生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能，廣泛參與到干細胞分化、 細胞增殖和轉(zhuǎn)移等不同的生物學過程，并與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[1，2]。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種具有多向分化潛能的干細胞，BMSCs 可定向分化為成骨細胞并作為種子細胞在骨形成、維持和重建中發(fā)揮著重要作用[3]。近年來，多項研究表明lncRNA 與BMSCs 成骨分化密切相關， 并參與多種骨代謝疾病的發(fā)生。 本文就有關lncRNA 對BMSCs 成骨分化影響及其在骨代謝研究中最新進展作一綜述，為尋找骨代謝相關疾病的潛在治療靶點提供依據(jù)。

1 lncRNA 在BMSCs 成骨分化中的調(diào)控機制

BMSCs 能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等多種細胞類型，并在細胞生長調(diào)控及組織修復中發(fā)揮重要作用。 BMSCs 分化失衡時則可引起骨質(zhì)疏松、異位骨化等疾病[3]。 lncRNA 的調(diào)控機制十分復雜，具體到BMSCs 成骨分化過程中，主要包括以下3 個方面。

1.1 介導表觀遺傳學調(diào)控

表觀遺傳學調(diào)控是指在不改變DNA 序列的情況下，通過DNA 甲基化、 組氨酸修飾和染色質(zhì)重塑來改變可遺傳的遺傳表型和基因表達。 以lncRNA Gas5 為例，在成骨分化過程中，糖皮質(zhì)激素是骨形成的負性調(diào)節(jié)因子，lncRNA Gas5 通過充當“糖皮質(zhì)激素反應元件”與糖皮質(zhì)激素受體的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合， 從而作為糖皮質(zhì)激素的核糖阻礙物，通過影響糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，抑制受體功能，干預成骨分化過程[4]。

1.2 調(diào)控相關信號通路

成骨分化過程中涉及一系列調(diào)節(jié)因子的參與，它們通過激活或抑制成骨相關信號通路發(fā)揮重要作用。在成骨分化過程中， 成骨分化的核心轉(zhuǎn)錄因子Runx2 受BMP、Wnt蛋白、雌激素和糖皮質(zhì)激素的多重調(diào)節(jié)，導致下游蛋白如β-catenin 和Smads 的磷酸化或表達改變[5]。 以lncRNA AK045490 為例，lncRNA AK045490 可通過抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位，阻斷β-catenin/TCF1/Runx2 信號通路從而下調(diào)T 細胞因子1（TCF1）、淋巴增強因子結(jié)合因子1（LEF1）和Runx2 表達，最終抑制成骨細胞的分化和骨形成[6]。

1.3 作為miRNA 海綿或前體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)

lncRNA 可以競爭性地結(jié)合miRNA 特異性位點，進而在BMSCs 成骨分化過程中調(diào)節(jié)miRNA 水平。 miRNAs 可導致靶mRNA 的翻譯抑制或降解， 調(diào)節(jié)BMSCs 成骨分化相關基因的表達。lncRNA 可充當分子海綿，通過競爭性地結(jié)合miRNAs 來調(diào)控成骨分化[7]。 例如，在BMSCs 成骨分化的調(diào)控過程中，lncRNA KCNQ1OT1 可對miR-214 發(fā)揮海綿吸附作用， 調(diào)控miR-214 的表達， 而miR-214 可與BMP-2 的3'-非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，抑制該蛋白的表達，進而調(diào)控成骨分化過程[8]。

2 通過參與BMSCs 成骨分化調(diào)控骨代謝疾病的lncRNA

2.1 H19

H19 是位于人類11 號染色體上的長度約2.7kb 的非編碼蛋白基因片段，是一種母系表達、父系印記的基因[9]。隨著人們對H19 的日益關注，發(fā)現(xiàn)H19 在BMSCs 成骨分化以及骨代謝疾病中發(fā)揮了重要作用。

在BMSCs 成骨分化過程中， 自成骨分化的d7 開始H19 的表達增加，并從d14 到d28 保持在較高水平，這表明在成骨分化的早期階段H19 發(fā)揮了作用[9]。 在調(diào)控機制方面，Liang 等人[7]研 究發(fā)現(xiàn)，H19 可 與miR141、miR22 發(fā)揮海綿吸附作用，通過與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）競爭性結(jié)合miRNA，調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號通路來促進成骨；此外，H19 與其編碼的miR-675-5p 之間的可形成負反饋環(huán)，miR-675-5p 可直接靶向H19 并抑制成骨細胞分化， 表明miR-675-5p 是成骨的負調(diào)節(jié)劑。 Gan 等人[10]研究發(fā)現(xiàn)，與健康人比較，H19 在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中明顯下調(diào)，而miR-19b-3p 的表達顯著上調(diào)； 過表達H19 可下調(diào)miR-19b-3p， 促進BMSCs 成骨分化，miR-19b-3p 模擬物可逆轉(zhuǎn)H19 上調(diào)誘導的細胞增殖和成骨分化， 證實H19可通過調(diào)節(jié)miR-19b-3p 參與BMSCs 成骨分化的調(diào)節(jié)。

2.2 MEG3

母系表達基因3 （maternally expressed gene 3，MEG3）是位于染色體14q32.3 上的一個lncRNA，在表現(xiàn)遺傳調(diào)控和關鍵信號蛋白相互作用下，協(xié)調(diào)多種細胞生命過程[11]。

隨著人們對MEG3 的了解加深，發(fā)現(xiàn)MEG3 在BMSCs成骨分化方面發(fā)揮著重要作用。 Zhuang 等人[12]發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤患者的BMSCs 在成骨分化過程中MEG3 表達水平較低，MEG3 敲低顯著降低了關鍵成骨標志物Runx2，硬化蛋白（sclerostin，SOST）和骨鈣素的表達，進而抑制成骨分化；MEG3 的過表達可增強成骨相關標志物的表達，促進成骨分化；通過熒光素酶、染色質(zhì)免疫沉淀和RNA 免疫沉淀等實驗發(fā)現(xiàn)，MEG3 通過抑制BMP4 的SOX2 轉(zhuǎn)錄，調(diào)控BMSCs 的成骨分化過程。 然而，Wang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥小鼠模型的BMSCs 中MEG3 高表達，當誘導BMSCs 向成骨細胞分化時，MEG3 和miR-133a-3p的表達顯著降低； 而MEG3 的沉默可導致礦化結(jié)節(jié)增加，提高成骨標志物的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)MEG3 的高表達可通過提高miR-133a-3p 表達下調(diào)SLC39A1， 抑制BMSCs 的成骨分化，從而導致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。 以上不同的結(jié)果可能部分歸因于來自不同疾病模型中的BMSCs 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控特征不同。 因此，MEG3 在BMSCs 的成骨分化中的作用仍有待進一步探究。

2.3 MALAT1

人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1 （metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是lncRNA 家族的經(jīng)典成員。 越來越多的證據(jù)證實了MALAT1 在BMSCs成骨分化中發(fā)揮重要作用[14，15]。

Gao 等[14]研究發(fā)現(xiàn)， 骨質(zhì)疏松癥患者的BMSCs 中MALAT1 的表達較健康人顯著減低，而miR-143 表達則升高； 敲低MALAT1 成骨分化顯著下降， 表明MALAT1 是hBMSCs 成骨分化的正調(diào)節(jié)因子； 進一步通過熒光素酶測定發(fā)現(xiàn)，MALAT1 可以直接結(jié)合miR-143 并對其發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，miR-143 可以直接結(jié)合成骨的關鍵物質(zhì)Osterix（Osx）3'-UTR 上的靶點，抑制Osx 表達，表明MALAT1 通過靶向miR-143 來調(diào)節(jié)Osx 表達，促進BMSCs 成骨分化。Yang 等人[15]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs 衍生的MALAT1 通過與miR-34c 發(fā)生海綿吸附作用， 上調(diào)特異AT 序列結(jié)合蛋白2 （special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2）表達，增強成骨活性，而SATB2 敲低則降低了成骨活性；動物實驗證實，miR-34c 可逆轉(zhuǎn)MALAT1 的作用， 且SATB2可逆轉(zhuǎn)卵巢切除小鼠中miR-34c 的作用， 進而表明BMSCs 衍生的MALAT1 通過介導miR-34c/SATB2 軸增強骨質(zhì)疏松小鼠成骨細胞的活性。 上述研究證實，MALAT1 是成骨分化過程中重要的正向調(diào)節(jié)因子，在hBMSCs 成骨分化中可通過與相應的miRNA 結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用， 有望成為骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點。

2.4 HOTAIR

HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA （HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是HOXC 基因轉(zhuǎn)錄形成的一個lncRNA。 在BMSCs 成骨分化過程中，HOTAIR 可通過多種途徑干預BMSCs 成骨分化[16，17]。

Wei 等人[16]研究發(fā)現(xiàn)，與骨關節(jié)炎患者相比，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者的BMSCs 中HOTAIR 的表達水平較高，敲低HOTAIR 可導致miR-17-5p 表達增加， 同時miR-17-5p 靶基因Smad7 表達降低， 成骨分化標志物RUNX2和COL1A1 的表達和ALP 活性增加，促進成骨分化。 Shen等人[17]研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥患者血清和BMSCs 中HOTAIR 的表達均明顯高于健康對照組，HOTAIR 通過介導Wnt/β-catenin 通路相關蛋白DKK-1 表達參與成骨分化，抑制HOTAIR 的表達可誘導BMSCs 堿性磷酸酶活性升高，成骨標志物表達升高，促進成骨。 總之，HOTAIR 在成骨分化的作用機制多樣，其相關作用需進一步研究。

2.5 Gas5

Gas5 最初從NIH3T3 細胞中分離出來，是編碼淋巴瘤相關染色體位點（1q25）的lncRNA。多項研究證實，Gas5 參與了BMSCs 的成骨分化過程， 影響骨代謝疾病的發(fā)生發(fā)展[18，19]。

Feng 等人[18]測定了骨質(zhì)疏松癥患者和健康對照者BMSCs 中Gas5、miR-498 和RUNX2 的表達水平， 發(fā)現(xiàn)在骨質(zhì)疏松癥患者來源的BMSCs 中，Gas5 和RUNX2 低表達，miR-498 高表達；過表達Gas5 可通過抑制miR-498 并上調(diào)RUNX2 促進BMSCs 的成骨分化，從而緩解骨質(zhì)疏松的發(fā)展。Wang 等人[19]在骨質(zhì)疏松小鼠模型的BMSCs 中，發(fā)現(xiàn)Gas5 和FOXO1 表達降低，miR-135a-5p 表達增加。 在誘導BMSCs 成骨分化過程中，Gas5 和FOXO1 水平升高，miR-135a-5p 表達降低； 過表達Gas5 促進了BMSC 的成骨分化，敲低Gas5 則抑制BMSC 的成骨分化，進一步研究證實，Gas5 通過調(diào)節(jié)miR-135a-5p/FOXO1 軸促進BMSCs成骨?？傊?，根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5 有望成為骨質(zhì)疏松癥診斷和預后的潛在生物標志物。

2.6 通過參與BMSCs 成骨分化干預骨代謝疾病的其他lncRNA

其他與BMSCs 成骨分化相關的lncRNA 還包括HIF1α-AS1、DANCR、Bmcob 和KCNQ1OT1 等。 Xu 等[20]發(fā)現(xiàn)HIF1α-AS1 是沉默調(diào)節(jié)蛋白1 （recombinant sirtuin 1，SIRT1）的靶基因，TGF-β 可抑制BMSCs 中SIRT1 的表達，使HIF1α-AS1 上調(diào)， 通過促進乙?；鰪奌OXD10 的表達，促進人BMSCs 的成骨向分化，認為HIF1α-AS1 有望成為骨關節(jié)炎的治療靶點。 Sun 等[21]在小鼠BMSCs 的成骨分化過程中發(fā)現(xiàn)，Bmcob 的表達水平在早期至中期顯著上調(diào)，Bmcob 的沉默則抑制BMSCs 的成骨細胞分化，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Bmcob 可能通過調(diào)節(jié)SBP2 的核質(zhì)穿梭， 調(diào)節(jié)sepp1 介導BMSCs 的成骨，為骨質(zhì)疏松癥的治療干預提供了新的靶點。 Wang 等[22]研究發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1 可直接與miR-214 結(jié)合，調(diào)控BMP2 表達及其下游Smad 信號，進而通過KCNQ1OT1/miR-214/BMP2 軸干預hBMSCs 成骨分化，促進成骨分化。以上幾種lncRNA 與hBMSCs 成骨分化研究報道較少， 對骨代謝疾病的干預作用有待進一步探究。

3 在骨代謝疾病中的臨床應用

間充質(zhì)干細胞是基因治療的理想細胞載體，具有低免疫原性， 很容易被臨床上廣泛使用的所有病毒載體轉(zhuǎn)染，BMSCs 在骨代謝疾病的治療中表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢[5]。 目前，體內(nèi)BMSC 注射療法在動物實驗和臨床試驗中均已取得了良好效果，針對強直性脊柱炎、難治性類風濕性關節(jié)炎等多種疾病，已經(jīng)開展了BMSC 治療的臨床試驗[23，24]。比如，注射BMSCs 可改善中重度骨關節(jié)炎患者的預后，為骨關節(jié)炎的治療提供了一種有前景的新療法[23]。 隨著近些年lncRNA 的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)從人體中提取出BMSCs，通過對其中的lncRNA 進行靶向修飾， 為治療各種骨代謝相關疾病帶來了潛在的希望。 有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA Bmner 過表達BMSCs 在小鼠模型中對抗衰老相關的骨丟失顯示出良好的治療效果， 并在敲除該lncRNA 后觀察到相反的效果，有望成為未來的治療靶點[25]。

4 總結(jié)與展望

綜上所述， 大量研究證實了lncRNA 作為干細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡的重要組成部分， 通過介導表觀遺傳學調(diào)控、調(diào)控相關信號通路或作為miRNA 海綿或前體結(jié)構(gòu)參與了BMSCs 向成骨細胞的分化的過程。 多種lncRNA 密切參與BMSCs 成骨分化過程，并對骨代謝疾病的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮了作用。一方面，這些lncRNA 的發(fā)現(xiàn)有望成為骨代謝疾病早期診斷的生物標志物。另一方面，隨著研究的深入，靶向lncRNA 的治療也有望在不久的將來發(fā)揮關鍵作用， 為精準醫(yī)學提供新的選擇。