高原蕁麻總黃酮提取工藝及含量分析*

黃國(guó)梁 宗和坤 左昆明 韓興昊

（西藏農(nóng)牧學(xué)院公共教學(xué)部，西藏 林芝 860000）

高原蕁麻，為高寒地帶植物，耐寒、耐瘠，抗逆性強(qiáng)，一般生長(zhǎng)在海拔4200～5000m，但也有部分分布在2000m左右，多產(chǎn)于西藏雅魯藏布江沿岸，四川、新疆、青海等地也有分布。其為一年生、多年生野本植物，自然生長(zhǎng)在草叢和原始森林中。高原蕁麻生長(zhǎng)條件較為苛刻，低海拔植株生長(zhǎng)較為分散［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明該植物含有黃酮類(lèi)、木質(zhì)素類(lèi)、香豆素類(lèi)等有效成分，具有很好的抗炎止痛、皮膚瘙癢、抗風(fēng)濕等藥理活性。蕁麻在世界上廣泛分布，與艾麻屬（Laportea Gandich）有相似親緣關(guān)系［2］，是我國(guó)常用的民間用藥［3，4］，其含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素C 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且在多個(gè)少數(shù)民族中作為豬飼料廣泛使用［5］，裂葉蕁麻中的汞、鉛含量均未超過(guò)蔬菜的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)，屬于可食安全范圍［6］，可列入保健食品資源之一［7］。國(guó)內(nèi)外對(duì)蕁麻屬植物化學(xué)成分進(jìn)行了大量的研究，結(jié)果表明該植物含有黃酮類(lèi)、甾類(lèi)、香豆素、木脂素、有機(jī)酸等成分［8-10］，具有抑制良性前列腺增生、抗風(fēng)濕、降血糖、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗氧化等藥理活性［11-13］，臨床主要用于良性前列腺增生、風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，療效顯著［14-16］。迄今為止有關(guān)高原蕁麻中總黃酮含量的提取報(bào)道較少［17，18］。文章以高原蕁麻為原料，蘆丁含量為指標(biāo)通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)選擇高原蕁麻中總黃酮提取工藝，為研發(fā)藥物等提供參考。

1 材料和藥品

1.1 材料

高原蕁麻（由西藏林芝市特產(chǎn)店提供）、四川蕁麻，洗凈后擦干，置于105℃下殺青，之后置于70℃下干燥，粉碎備用。

1.2 儀器

島津LC-20A 高效液相儀、島津UV-2700 紫外分光光度計(jì)、水浴恒溫鍋、恒溫烘箱、優(yōu)普超純水機(jī)、分析天平。

1.3 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇、等均為AR分析純，甲醇（色譜純），實(shí)驗(yàn)用水均為用去離子水。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 蘆丁顯色劑的選用

結(jié)果表明當(dāng)采用5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、4%氫氧化鈉做顯色劑使用時(shí)顯色效果最佳，但由于顯色穩(wěn)定性較差，固應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用［19］。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的蘆丁試劑標(biāo)準(zhǔn)品10mg，加入70%乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中，搖勻，稱(chēng)作標(biāo)樣0，備用。

2.3 最大吸收峰的測(cè)定

吸取2.2 中的對(duì)照溶液0.00mL、2.5mL 置于10mL具塞量筒，加入70%乙醇溶液至5mL，之后加入5%亞硝酸鈉0.3mL，放置6min 再加入10% 硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，之后加入4%氫氧化鈉4mL，之后用水稀釋至10mL，放置15～20min 顯色。之后以0.00mL 為空白，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量400～800nm的吸收曲線(xiàn)，確定當(dāng)波長(zhǎng)為415nm 時(shí)有最大吸收峰，固選用415nm處測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

用移液槍吸取2.2 中的待測(cè)液，各加70%乙醇至5mL，轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶并編號(hào)，之后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉4mL，再用水稀釋至10mL，放置15～20min。待顯色完畢后，吸取1.5mL 待測(cè)液過(guò)0.45μm 微孔濾膜后，進(jìn)行液相分析，得到線(xiàn)性回歸方程y=584.27x+1742.8，R2=0.9990，如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.5 色譜條件

流動(dòng)相為甲醇－0.4%磷酸水溶液（55∶45）；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)415 nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

2.6 提取工藝優(yōu)化

2.6.1 料液比對(duì)提取的影響。稱(chēng)取蕁麻粉末1.00g 五份，放置在圓底燒瓶中，分別加入70%的乙醇5mL、10mL、15mL、20mL、25mL，在65℃連續(xù)回流2h，之后放冷、抽濾之后，回收乙醇，得到不同料液比下的濃縮液，將濃縮液用石油醚脫脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分，過(guò)濾后將濃縮液蒸發(fā)到10mL 時(shí)，轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到樣品吸取0.2mL 待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進(jìn)入液相測(cè)定，結(jié)果如表1。

表1 料液比對(duì)提取的影響

2.6.2 乙醇濃度對(duì)提取的影響。稱(chēng)取蕁麻粉末1.00g五份，放置于圓底燒瓶中，分別加入60%、65%、70%、75%、80%的乙醇10mL 在65℃連續(xù)回流2h，之后放冷、抽濾之后，回收乙醇，得到不同料液比下的濃縮液，將濃縮液用石油醚脫脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分，過(guò)濾后將濃縮液蒸發(fā)到4～7mL 時(shí)，轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到樣品吸取0.2mL 待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進(jìn)入液相測(cè)定,結(jié)果如表2。

2.6.3 提取溫度對(duì)提取的影響。稱(chēng)取蕁麻粉末1.00g五份，放置在圓底燒瓶中，分別加入70%的乙醇15mL，在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃連續(xù)回流2h，之后放冷、抽濾之后，回收乙醇，得到不同料液比下的濃縮液，將濃縮液用石油醚脫脂3～5次，回收石油醚并用多倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分，過(guò)濾后將濃縮液蒸發(fā)到4～7mL時(shí)，轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到樣品吸取0.2mL待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，按2.4中的方法和2.5中的色譜條件進(jìn)入液相測(cè)定，結(jié)果如表3。

表3 提取溫度對(duì)提取的影響

2.6.4 提取時(shí)間對(duì)提取的影響。稱(chēng)取蕁麻粉末1.00g五份，放置于圓底燒瓶中，分別加入70%乙醇10mL，在65℃水浴中分別加熱回流1h、1.5h、2h、2.5h、3h 之后放冷、抽濾之后，回收乙醇，得到不同料液比下的濃縮液，將濃縮液用石油醚脫脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖及蛋白質(zhì)成分，過(guò)濾后將濃縮液蒸發(fā)到4～7mL 時(shí)，轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到樣品吸取0.2mL 待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色譜條件進(jìn)入液相測(cè)定，結(jié)果如表4。

表4 提取時(shí)間對(duì)提取的影響

2.6.5 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)因素水平表，見(jiàn)表5，選擇料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間作為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以蘆丁含量為指標(biāo)選取最佳工藝。

表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.6.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。高原蕁麻中蘆丁含量提取工藝優(yōu)化3 因素4 水平正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析，見(jiàn)表6，由此可知最佳提取工藝是A2B3C2D2即當(dāng)液料比為1：50，乙醇濃度為70%，浸提時(shí)間為2h。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3 高原蕁麻及四川蕁麻中黃酮含量的對(duì)比

3.1 UV法分析兩種蕁麻黃酮含量

3.1.1 紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取2.2 中的制備液0.00mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL 分別置于10mL 量筒中，各加30%乙醇至5mL，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶并編號(hào)，之后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉4mL，再用水稀釋至10mL，放置15～20min。待顯色完畢后，以0.00mL 為空白，測(cè)定其吸光度，如圖2，得到線(xiàn)性回歸方程y=10.5x -0.487,R2＝0.9950。

圖2 吸光度的線(xiàn)性回歸方程

3.1.2 紫外儀器精密度測(cè)定。取對(duì)照液1 份，在儀器參數(shù)中設(shè)置測(cè)定次數(shù)為5次，每次測(cè)量間隔為2s（空白不更改），重復(fù)測(cè)試后吸光度RSD為0.1%.

3.1.3 兩種蕁麻黃酮含量的對(duì)比。分別取1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)樣品，平行稱(chēng)取3 次，按照2.6 方法進(jìn)行提取、定容后，取1mL 待測(cè)液按照2.4 中的方法定容之后進(jìn)入儀器測(cè)定其吸光度，每份樣品平均測(cè)定3 次，取平均值，帶入3.1.1中線(xiàn)性回歸方程計(jì)算總黃酮量，結(jié)果為紫外分光光度計(jì)所測(cè)定的含量見(jiàn)表7。

表7 紫外分光光度法測(cè)定樣品總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

3.2 HPLC法分析兩種蕁麻黃酮含量

采用相同方法處理溶液100μL，用70%乙醇定容至10mL 容量瓶，過(guò)0.45μm濾膜，上機(jī)測(cè)定，測(cè)量峰值帶入2.4中線(xiàn)性回歸方程計(jì)算濃度，HPLC所測(cè)定含量見(jiàn)表8。

表8 HPLC法測(cè)定樣品總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)果與討論

本研究通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化高原蕁麻中總黃酮的提取工藝，當(dāng)料液比1∶50，乙醇濃度為70%，浸提溫度為60℃，浸提時(shí)間為2h 時(shí)，為最優(yōu)提取工藝。通過(guò)對(duì)兩種蕁麻總黃酮含量的測(cè)定，結(jié)果顯示：紫外分光光度法測(cè)定高原蕁麻中總黃酮含量為3.39mg/g 相較于四川蕁麻2.89mg/g 要高出17.30%.高效液相法測(cè)定高原蕁麻中總黃酮含量為3.19mg/g相較于四川蕁麻2.84mg/g要高出12.32%.

HPLC 測(cè)定高原蕁麻結(jié)果相較紫外測(cè)定結(jié)果普遍偏低，這是由于顯色劑使用堿性鋁離子，其顯色能力隨時(shí)間推移得到減弱，顯色效果在30～90min 內(nèi)最為合適，由于液相測(cè)定所需一定時(shí)間分離后才能通過(guò)uv檢測(cè)器顯示色譜圖，故測(cè)定結(jié)果較紫外結(jié)果偏低且穩(wěn)定性較差，故若使用堿性硝酸鋁作為蘆丁顯色劑時(shí)，在條件允許下，應(yīng)選用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其總黃酮含量，結(jié)果較為準(zhǔn)確。若要使用液相色譜進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)波長(zhǎng)改為360nm［7］處增強(qiáng)穩(wěn)定性。

蘆丁為黃酮類(lèi)化合物，具有廣泛的藥理活性和較低的毒性，是天然藥物研究的熱點(diǎn)之一。若蘆丁不加顯色劑，吸收峰在360nm［7］左右，若蘆丁在弱堿性條件下與Al3+發(fā)生顯色反應(yīng)，則會(huì)紅移至415nm 處，這與其他文獻(xiàn)中510nm［19，20］波長(zhǎng)不符，推測(cè)顯色終點(diǎn)可能與溫度有一定關(guān)系。

考慮到高原地區(qū)光照時(shí)間長(zhǎng)，蕁麻植株受光照面積相較于低海拔地區(qū)更為充足，這也許是其黃酮含量相較于低海拔地區(qū)蕁麻中黃酮含量高的因素之一。