響應(yīng)面法優(yōu)化余甘子果渣沒食子酸的提取工藝

孟曉，唐鳴躍，袁昌益，劉秋妍，王娟，蔣麗施

成都中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（成都 611137）

余甘子，為大戟科葉下珠屬植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.）的果實(shí)，主要生長于亞洲的熱帶或亞熱帶地區(qū)，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳的功效[1-2]，也是具有特色的藥食同源品種與經(jīng)濟(jì)作物?，F(xiàn)代大量研究證明，余甘子具有大量的多酚、黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）等活性成分，并具有預(yù)防腫瘤、降血脂、降血糖、抗菌消炎及其他多種人體特殊的生理功能[3-5]。余甘子中的主要藥用生理活性物質(zhì)成分中又以沒食子酸含量居多，研究已證明沒食子酸確實(shí)具有天然抗菌抗炎、抗氧化、抗腫瘤等特殊功能作用[6-8]，被廣泛應(yīng)用于各種藥品、保健品、食品、食品添加劑生產(chǎn)等行業(yè)[9-10]。

提取沒食子酸常見的方法有離子萃取法、回流法、浸漬法、酸堿水解法等[11-13]。其中：回流法、浸漬法的提取時(shí)間一般較長，且生產(chǎn)成本較高；離子萃取法生產(chǎn)成本低，但溫度較高，對產(chǎn)物的活性有影響；酸水解法、堿水解法可得到大量沒食子酸，提取率高，但二者提取工藝復(fù)雜，工業(yè)化生產(chǎn)成本較高；與其他方法相比，水提法使用的設(shè)備成本低、操作簡便、安全系數(shù)高、適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)[11]。

以余甘子果渣對研究對象，采用水提法，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化余甘子果渣沒食子酸提取的最佳工藝條件，為余甘子及其副產(chǎn)物的綜合開發(fā)利用提供一定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮余甘子（市售）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）；福林酚、無水碳酸鈉（分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

JD300-3分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；L2S可見光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9240 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝

新鮮余甘子榨汁→過濾后得濾渣→稱取果渣移入錐形瓶中→加入蒸餾水→水浴鍋浸提→抽濾→濾液回收→蒸餾水定容→以蒸餾水為參比液測吸光度

1.3.2 沒食子酸的測定

1.3.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取25 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶化，定容至250 mL容量瓶中，調(diào)配成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用移液管依次吸取0，1，2，3，4和5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL棕色容量瓶中，分別加入1 ml福林酚混合，靜置5 min，再分別加入2 mL的15%碳酸鈉溶液，充分混合后定容，配成終質(zhì)量濃度依次為0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL的對照品溶液，以空白樣做參比，并于760 nm測其吸光度，反復(fù)測量3次，參照式（1）進(jìn)行計(jì)算[14]。

1.3.2.2 沒食子酸提取率的計(jì)算

式中：A0為樣品吸光度；V為樣品濾液定容后的體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g；Q為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 提取時(shí)間對提取率的影響

在提取溫度80 ℃、料液比1∶30（g/mL）、提取2次條件下，研究不同提取時(shí)間（30，40，50，60和70 min）對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響。

1.3.3.2 提取溫度對提取率的影響

在提取時(shí)間60 min、料液比1∶30（g/mL）、提取2次條件下，研究不同提取溫度（60，70，80，90和100 ℃）對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響。

1.3.3.3 料液比對提取率的影響

在提取溫度80 ℃、提取時(shí)間60 min、提取2次條件下，研究不同料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響。

1.3.3.4 提取次數(shù)對提取率的影響

在提取溫度80 ℃、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間60 min條件下，研究不同提取次數(shù)（1，2，3，4和5次）對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 12.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以提取溫度、提取時(shí)間及料液比為考察對象，以沒食子酸提取率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因子水平

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

從余甘子果渣中提取沒食子酸的單因素試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。使用 Microsoft Office Excel 2013處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用SPSS 25.0和Design-Expert 12.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可以得到，以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對其做線性回歸得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=109.97x+0.006 8，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2，表明在0.000～0.010 mg/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同提取次數(shù)對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響

從圖2可知，提取次數(shù)從1次增加到2次，余甘子果渣沒食子酸的提取率明顯升高，提取次數(shù)為2次時(shí)，與提取1次相比余甘子果渣沒食子酸提取率有顯著差異（P＜0.05），為3.49%±0.20%，但是提取2次后提取次數(shù)的增加對沒食子酸提取率無顯著影響（P＞0.05），說明余甘子果渣中的沒食子酸2次基本提取完畢，考慮到成本、耗時(shí)等綜合因素，確定余甘子果渣沒食子酸的最佳提取次數(shù)為2次。

圖2 提取次數(shù)對沒食子酸提取率的影響

2.2.2 不同提取時(shí)間對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響

從圖3可知，隨著提取時(shí)間從30 min延長到60 min，余甘子果渣的沒食子酸提取率逐漸增加。提取時(shí)間為60 min時(shí)，與提取時(shí)間50 min時(shí)相比，其提取率顯著升高（P＜0.05），為3.18%±0.03%。但是，60 min后，繼續(xù)延長提取時(shí)間，余甘子果渣的沒食子酸提取率出現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05）。原因可能是提取時(shí)間過短時(shí)沒食子酸未能充分溶出，隨著提取時(shí)間的延長，沒食子酸溶解充分，提取率升高。60 min之后提取時(shí)間進(jìn)一步增加，沒食子酸結(jié)構(gòu)可能被分解破壞，造成提取率降低[15]。因此，余甘子果渣沒食子酸的最佳提取時(shí)間為60 min。

圖3 提取時(shí)間對沒食子酸提取率的影響

2.2.3 不同提取溫度對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響

從圖4可知，提取溫度在60 ℃時(shí)沒食子酸提取率最低，隨著提取溫度逐漸增加，沒食子酸提取率不斷升高，提取溫度在90 ℃時(shí)沒食子酸提取率達(dá)到最大。余甘子主要含多酚類物質(zhì)，其中可水解鞣質(zhì)能夠受酸、堿等催化而水解，加熱過程中，由于多酚等物質(zhì)的作用，提取物處于酸性狀態(tài)，連續(xù)加熱后發(fā)生水解反應(yīng)，從而生成沒食子酸使得沒食子酸含量上升，提取率增高[15]。因此，余甘子果渣沒食子酸的最佳提取溫度為90 ℃。

圖4 提取溫度對沒食子酸提取率的影響

2.2.4 不同料液比對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響

從圖5可知，料液比從1∶20（g/mL）變化到1∶50（g/mL），余甘子果渣的沒食子酸提取率由下降轉(zhuǎn)為逐漸增加，料液比1∶50（g/mL）時(shí)，與料液比1∶60（g/mL）相比提取率有顯著差異（P＜0.05），該條件下余甘子果渣的沒食子酸提取率最高，為3.78%±0.05%。原因可能是隨著液體占比的增大，沒食子酸溶出，當(dāng)液體占比過大時(shí)，溶劑過多，沒食子酸的溶出已達(dá)極限，其他物質(zhì)溶解增多，沒食子酸提取率降低[16]。因此，余甘子果渣沒食子酸的最佳提取料液比為1∶50（g/mL）。

圖5 料液比對沒食子酸提取率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。根據(jù)表1中的因素和水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

將表2中的數(shù)據(jù)運(yùn)用Design Expert軟件做回歸擬合，得到以余甘子果渣沒食子酸提取率（Y）為響應(yīng)值的目標(biāo)函數(shù)：Y=3.84+0.096 3A-0.031 2B+0.100C+0.030 0AB+0.017 5AC-0.002 5BC-0.277 0A2-0.082 0B2-0.029 5C2。

回歸模型方差分析見表3。利用方差分析結(jié)果建立的回歸模型P＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平，得出R2=0.986 7，Radj2=0.969 7，結(jié)果表明，該模型可以較好地反映響應(yīng)值的變化。失擬項(xiàng)（P=0.705 5）不顯著，表明回歸模型和預(yù)測值之間有較好的擬合度。

表3 回歸模型方差分析

通過料液比、提取時(shí)間、提取溫度的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。二次方程回歸系數(shù)的顯著性表明，因素A提取溫度（P＜0.010）對余甘子果渣沒食子酸提取影響極顯著，因素B提取時(shí)間（P＜0.050）對余甘子果渣沒食子酸提取影響顯著；交互項(xiàng)對余甘子果渣沒食子酸提取影響均不顯著；二次項(xiàng)A2、B2（P＜0.010）對余甘子果渣沒食子酸提取影響極顯著。各因素對從余甘子果渣中提取沒食子酸的影響順序：提取溫度二次項(xiàng)=提取溫度一次項(xiàng)＞提取時(shí)間二次項(xiàng)＞提取時(shí)間一次項(xiàng)＞料液比二次項(xiàng)＞提取時(shí)間和提取溫度交互項(xiàng)＞料液比和提取溫度交互項(xiàng)＞料液比一次項(xiàng)＞料液比和提取時(shí)間交互項(xiàng)。

圖7 提取溫度和料液比對沒食子酸提取率影響的響應(yīng)面及等高線

根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面及等高線，從各個(gè)因素交互作用對響應(yīng)面進(jìn)行分析，從圖6～圖8可知，提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對余甘子果渣沒食子酸提取的影響最顯著。

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對沒食子酸提取率影響的響應(yīng)面及等高線

圖8 提取時(shí)間和料液比對沒食子酸提取率影響的響應(yīng)面及等高線

2.4 最佳工藝條件試驗(yàn)驗(yàn)證

為驗(yàn)證回歸模型的預(yù)測值與試驗(yàn)的真實(shí)值之間的擬合程度，采用余甘子果渣沒食子酸的提取率驗(yàn)證響應(yīng)因素?？紤]到試驗(yàn)的可操作性，選擇響應(yīng)因子：提取溫度91 ℃、提取時(shí)間59 min、料液比1∶51（g/mL）。在該條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，沒食子酸平均提取率為3.84%，與回歸模型預(yù)測值（3.86%）相比，相對誤差小于0.01%。因此，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的余甘子果渣沒食子酸最佳提取工藝條件的回歸模型符合實(shí)際。

3 結(jié)論

以余甘子果渣為研究對象，采用水提法提取余甘子果渣中的沒食子酸，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)進(jìn)行分析研究，得出最優(yōu)提取條件：提取2次、提取溫度91 ℃、提取時(shí)間59 min、料液比1∶51（g/mL）。在該條件下，余甘子果渣沒食子酸的提取率可達(dá)3.84%±0.01%。試驗(yàn)結(jié)果可為余甘子果渣沒食子酸提取工藝的工業(yè)化應(yīng)用提供參數(shù)借鑒。

4 討論

國內(nèi)外研究主要集中在余甘子提取物的生理活性、藥理作用等方面[17-18]，對余甘子沒食子酸的提取大多采用超聲、回流、離子萃取法等，采用水提法對余甘子果渣中沒食子酸的提取研究較少。

水提法是傳統(tǒng)的提取方法，唐遠(yuǎn)江等[19]在加33.5倍水、90 ℃下回流提取4.2 h、提取2次的條件下提取地榆中的沒食子酸，經(jīng)真空濃縮后，其提取率可達(dá)4.21%，試驗(yàn)的提取溫度與其研究的提取溫度基本一致，90 ℃的高溫有利于沒食子酸的溶解，但其提取時(shí)間更長，有利于一系列水解反應(yīng)生成更多的沒食子酸，而試驗(yàn)提取工藝較簡單，提取時(shí)間較短，余甘子中的單寧酸類物質(zhì)未完全轉(zhuǎn)化成沒食子酸。吳春燕[20]采用離子萃取法，從芒果葉中提取沒食子酸，在提取溫度100 ℃、NaHCO3濃度0.16%、溶劑倍量90 mL/g、浸提60 min條件下，沒食子酸的提取率為1.74%；趙仕花等[21]使用超聲輔助提取芒果皮中的沒食子酸，在超聲頻率20 kHz、超聲波輸出功率350 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、浸提時(shí)間70 min、浸提溫度50 ℃及料液比1∶40（g/mL）的條件下，沒食子酸提取率為2.42%。離子萃取法和超聲輔助提取法均利于有效成分的析出，減少浸提時(shí)間，也增加產(chǎn)物的提取率，但對芒果廢棄物中沒食子酸的提取來說，提取效率并不高，且二者研究的提取率均不及試驗(yàn)的提取率高，這或許與試驗(yàn)研究的對象差異有關(guān)。研究表明，芒果葉中沒食子酸含量為0.23%[22]，芒果核仁中沒食子酸含量為2.45%[23]，相比芒果廢棄物中的沒食子酸而言，余甘子果渣中沒食子酸的含量更高，余甘子大部分有效成分主要集中在果肉，果核中脂肪酸類成分占比較高[24]，但仍含有一定量的鞣質(zhì)、酚酸等功能性成分。試驗(yàn)操作更簡便，材料易得，效率更高。

與酸、堿水解等其他提取沒食子酸的方法相比，得到的沒食子酸提取率較低，但試驗(yàn)采用水提法提取余甘子果渣中的沒食子酸，以水為溶劑，廉價(jià)易得，使用安全，沒有化學(xué)污染，得到的沒食子酸在安全性上有保障，可用于食品、藥品、化妝品和食品添加劑等行業(yè)。另外，余甘子果渣作為廢棄物，極易發(fā)生褐變反應(yīng)。余甘子酶促褐變以沒食子酸為底物，經(jīng)多酚氧化酶等酶氧化，形成褐變物質(zhì)[25]。隨著果渣貯存時(shí)間的變化，沒食子酸提取率也有明顯變化，因此，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中可進(jìn)一步優(yōu)化果渣的貯存條件，以提高沒食子酸提取率。