岳薔薇 徐樂(lè) 張東升

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院口腔科，濟(jì)南 250021

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是全身最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率為40%～50%[1]。盡管腫瘤研究飛速進(jìn)展，但HNSCC 總生存率仍未顯著提高[2]，因此亟需新的預(yù)后評(píng)估分子標(biāo)志物。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A） 是真核生物 RNA 中最常見(jiàn)的修飾方式[3-4]，異常表達(dá)的m6A 調(diào)節(jié)基因可能與HNSCC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤生長(zhǎng)的溫床，其中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞如同雙刃劍影響癌細(xì)胞[6]。研究[7-8]證實(shí)m6A RNA 甲基化與免疫功能密切相關(guān)。然而，在HNSCC 中關(guān)于腫瘤m6A RNA 甲基化、免疫功能和腫瘤臨床特征之間的相關(guān)性仍不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA），通過(guò)生物信息學(xué)分析探索了HNSCC 中m6A 調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、功能、臨床意義及其與免疫功能之間的關(guān)系，為HNSCC預(yù)后和治療提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和處理

在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）中下載TCGA-HNSC 隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，其中包括502個(gè)腫瘤樣本和44個(gè)正常對(duì)照組織樣本。臨床數(shù)據(jù)主要包括腫瘤患者相應(yīng)臨床病理特征，包括年齡、性別、病理分級(jí)、腫瘤分期和生存數(shù)據(jù)。

1.2 m6A調(diào)節(jié)因子差異表達(dá)及相互作用分析

使用limma R包篩選腫瘤和正常樣本之間的差異表達(dá)基因，篩選閾值設(shè)定為調(diào)整P值（adjustedPvalue，adj.P） <0.05，且差異倍數(shù)|log2FC|≥1。使用R 語(yǔ)言的ggplot2 軟件包繪制差異基因提琴圖及Pearson相關(guān)分析圖。

1.3 m6A調(diào)節(jié)因子風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型構(gòu)建及評(píng)估

利用單因素COX 分析評(píng)估m(xù)6A 調(diào)節(jié)因子預(yù)后相關(guān)性，然后將P值小于0.05的預(yù)后相關(guān)基因進(jìn)行LASSO 回歸分析構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型。通過(guò)將預(yù)后模型中每個(gè)基因表達(dá)量與相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)的乘積相加，獲得每位患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，HNSCC 患者被均勻地分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。分別使用單因素和多因素獨(dú)立預(yù)后分析評(píng)估m(xù)6A調(diào)節(jié)因子風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型在HNSCC 患者預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值，并使用R 語(yǔ)言的ggplot2 軟件包繪制COX回歸分析樹(shù)葉圖。

1.4 m6A風(fēng)險(xiǎn)組免疫微環(huán)境功能狀態(tài)評(píng)估

使用xCell工具計(jì)算34個(gè)主要的免疫炎癥細(xì)胞的豐度[9]，并繪制了雷達(dá)圖展示了各細(xì)胞類型在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的分布差異。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有統(tǒng)計(jì)分析均在R 語(yǔ)言（版本4.1.2）中進(jìn)行，P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。t檢驗(yàn)和方差分析用于比較連續(xù)變量，卡方檢驗(yàn)用于比較分類臨床病理變量，Pearson 相關(guān)性分析用于滿足正態(tài)分布的連續(xù)變量。

2 結(jié)果

2.1 m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)和相互關(guān)系

HNSCC 正常組織和腫瘤組織之間存在15個(gè)m6A 相關(guān)基因的異常表達(dá)（圖1A）。除YTHDC2表達(dá)下降外，METTL3、METTL14、WTAP、KI‐AA1429、RBM15、FTO、ALKBH5、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 和HNRNPC 基因在腫瘤組織中均表達(dá)升高。15個(gè)差異表達(dá)的m6A 調(diào)節(jié)因子之間相互關(guān)聯(lián)，形成了一個(gè)復(fù)雜的m6A調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖1B）。

圖1 TCGA HNSCC患者m6A調(diào)節(jié)因子差異表達(dá)及相互作用分析Fig 1 The expression profile and interrelation of m6A RNA regulators in TCGA HNSCC cohort

2.2 m6A調(diào)節(jié)因子風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型構(gòu)建及評(píng)估

通過(guò)單因素COX 回歸分析，YTHDC2、IGF-2BP2 和 HNRNPC 與 HNSCC 患者預(yù)后顯著相關(guān)（圖2A）。其中，YTHDC2是HR小于1的保護(hù)基因（HR=0.846），而IGF2BP2（HR=1.015）和HNRN‐PC（HR=1.013）是風(fēng)險(xiǎn)基因。通過(guò)LASSO回歸分析發(fā)現(xiàn)需要 YTHDC2、IGF2BP2 和 HNRNPC 3個(gè)基因共同構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型，并得到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（?0.169）×YTHDC2+（0.010）×IGF2BP2+（0.012）×HNRNPC。根據(jù)個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，分別將200 和186 名HNSCC 患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總生存率顯著降低（P=3.528×105，圖2B）。高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組在性別（P<0.05）、病理分級(jí)（P<0.005）和臨床分期（P<0.05）方面存在顯著差異（表1）。在高風(fēng)險(xiǎn)組中，男性患者比例更高，且腫瘤分期和病理分級(jí)更高。

表1 HNSCC患者m6A風(fēng)險(xiǎn)分組的臨床特征分析Tab 1 Clinical characteristics of HNSCC samples of m6A risk groups

單因素獨(dú)立預(yù)后分析顯示年齡（P=0.034，HR=1.406）、分期（P<0.001，HR=1.399）和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（P=0.001，HR=1.683）與總生存率顯著相關(guān)（圖2C）。進(jìn)一步的多因素獨(dú)立預(yù)后分析將年齡（P=0.035，HR=1.418）、分期 （P<0.001，HR=1.430）和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（P=0.003，HR=1.657）確定為獨(dú)立的預(yù)后因素（圖2D）。

圖2 m6A調(diào)節(jié)因子風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型構(gòu)建及評(píng)估Fig 2 Construction and evaluation of the prognostic signature based on m6A regulators in TCGA HNSCC cohort

2.3 m6A風(fēng)險(xiǎn)組免疫微環(huán)境功能狀態(tài)評(píng)估

在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間共有156個(gè)差異表達(dá)基因，其中35個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，121個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖3A），其中涉及許多免疫相關(guān)基因（圖3B）。為了進(jìn)一步探索腫瘤免疫/炎癥功能狀態(tài)的差異，比較了高、低風(fēng)險(xiǎn)組中各細(xì)胞類型的豐度。如圖3C 所示，其中大多數(shù)免疫細(xì)胞類型富集評(píng)分在高風(fēng)險(xiǎn)組中顯著降低，例如B 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、M1 型巨噬細(xì)胞等。相反，高風(fēng)險(xiǎn)組的前B 細(xì)胞、輔助T 淋巴細(xì)胞富集分?jǐn)?shù)更高。進(jìn)一步挖掘前面所得到的m6A 風(fēng)險(xiǎn)分組相關(guān)的差異基因，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤因子如γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12A 和IL-12B 在高風(fēng)險(xiǎn)組中表達(dá)下調(diào)，而促腫瘤因子CD155 在高風(fēng)險(xiǎn)組中略有上調(diào)（圖3D）。

圖3 m6A風(fēng)險(xiǎn)分組HNSCC患者腫瘤免疫微環(huán)境功能狀態(tài)分析Fig 3 Analysis of tumor immune microenvironment of different m6A risk groups in HNSCC

3 討論

臨床中常用TNM 分期指導(dǎo)腫瘤的診斷治療，但有報(bào)道指出相同臨床分期的HNSCC 患者會(huì)對(duì)治療產(chǎn)生不同的反應(yīng)，導(dǎo)致預(yù)后無(wú)法預(yù)測(cè)[10]，因此亟需提出新的分子標(biāo)志物為HNSCC 預(yù)后評(píng)估和治療選擇提供參考。研究[3]發(fā)現(xiàn)m6A 甲基化在惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，然而在HNSCC 的研究仍不明確。本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)HNSCC 患者轉(zhuǎn)錄組及臨床數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，闡明m6A 甲基化在HNSCC 預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值，為HNSCC臨床治療提供了研究方向。

m6A 甲基化是RNA 中最豐富的修飾方式，其調(diào)節(jié)因子通常在惡性腫瘤中異常表達(dá)。與既往研究[11]結(jié)果相似。其中，甲基化轉(zhuǎn)移酶包括MET‐TL3、 METTL14、 KIAA1427、 RBM15、 WTAP、ZC3H13，去甲基化酶包括FTO、ALKBH5，而m6A 結(jié)合蛋白通過(guò)識(shí)別并結(jié)合m6A 位點(diǎn)，發(fā)揮不同的RNA調(diào)節(jié)作用：維持RNA穩(wěn)定性（IGF2BP1/2/3）、促進(jìn)mRNA 翻譯 （YTHDF1）、調(diào)控RNA 降解（YTHDF2）等。本研究發(fā)現(xiàn)HNSCC 腫瘤組織中m6A 調(diào)節(jié)因子呈現(xiàn)異常表達(dá)，17個(gè)調(diào)節(jié)因子中有15個(gè)表達(dá)失調(diào)，這表明m6A 調(diào)節(jié)因子可能與腫瘤發(fā)生和臨床預(yù)后相關(guān)。而進(jìn)一步相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)這15個(gè)調(diào)節(jié)因子相互之間存在著表達(dá)相關(guān)性，這提示m6A 調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。其中多項(xiàng)研究[12-14]已經(jīng)證實(shí) ALKBH5、METTL3 及 YTHDF1 在HNSCC發(fā)生和化療耐受中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。

然而，大多數(shù)異常表達(dá)的m6A 調(diào)節(jié)因子在HNSCC 中尚未有明確報(bào)道，這需要未來(lái)更深入的研究來(lái)揭示其潛在機(jī)制。

為了進(jìn)一步明確m6A 調(diào)節(jié)因子在HNSCC 中的臨床意義，本研究構(gòu)建了由YTHDC2、IGF2BP2和HNRNPC 組成的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型。根據(jù)m6A 風(fēng)險(xiǎn)模型劃分風(fēng)險(xiǎn)組，發(fā)現(xiàn)與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組患者其腫瘤惡性程度更高，且伴隨著較差的預(yù)后結(jié)果。并且與年齡和臨床分期相同，該風(fēng)險(xiǎn)模型已被驗(yàn)證可以作為獨(dú)立因素評(píng)價(jià)HNSCC 患者的預(yù)后。

在該預(yù)后模型中，YTHDC2 被預(yù)測(cè)為HNSCC預(yù)后評(píng)價(jià)的保護(hù)因子，表明它可能在HNSCC 中發(fā)揮抑癌基因作用。然而，YTHDC2 在腫瘤發(fā)生中的作用目前仍存爭(zhēng)議。研究[15-16]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌及肝癌中YTHDC2發(fā)揮促癌作用，這與本研究中YTH‐DC2 表現(xiàn)出的抑癌作用相矛盾。事實(shí)上，m6A 調(diào)節(jié)基因可能在不同類型癌癥中發(fā)揮不同作用。例如，METTL3 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中充當(dāng)腫瘤抑制基因[17]，而在膀胱癌中卻能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[18]。因此，YTHDC2 在HNSCC 中的作用及機(jī)制需要進(jìn)一步研究明確。與YTHDC2 不同，IGF2BP2 和HNRNPC是HNSCC 腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)因素。抑制HNRNPC通過(guò)抑制下游干擾素反應(yīng)，來(lái)抑制乳腺癌的生長(zhǎng)[19]，而過(guò)表達(dá)HNRNPC 通過(guò)改變選擇性切割和多聚腺苷化（alternative cleavage and polyadenyl‐ation，APA） 表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展[20]；同樣IGF2BP2 可以通過(guò)調(diào)控性別決定區(qū)Y 盒狀蛋白2 （sex determining region Y box protein 2，SOX2）表達(dá)來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展[21]。

盡管關(guān)于腫瘤m6A 修飾的研究日益增多，但其對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的影響尚未闡明。為此本研究比較了m6A 風(fēng)險(xiǎn)組之間的基因表達(dá)譜和免疫細(xì)胞類型富集評(píng)分。結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫評(píng)分較低，且伴有大量細(xì)胞因子、趨化因子和相關(guān)受體表達(dá)失調(diào)。這提示m6A 甲基化修飾與腫瘤免疫調(diào)控密切相關(guān)。

進(jìn)一步分析腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞評(píng)分，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗腫瘤免疫細(xì)胞在m6A 高風(fēng)險(xiǎn)組中浸潤(rùn)減少，主要包括M1 型巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，而免疫抑制性Th2淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增多，這表明m6A 異常調(diào)控與HNSCC 微環(huán)境的促腫瘤免疫狀態(tài)相關(guān)。盡管 YTHDC2、IGF2BP2 和 HNRNPC 的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚未闡明，考慮到m6A 基因是一個(gè)相互關(guān)聯(lián)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其他m6A 調(diào)控基因的免疫調(diào)節(jié)作用可以提供參考。研究[22]發(fā)現(xiàn)YTHDF2 可以通過(guò)CCR7-lncDpf3 參與調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞遷移，并通過(guò)m6A 依賴方式促進(jìn)IFNB 的mRNA 降解，進(jìn)而抑 制 干 擾 素 反 應(yīng)[23]。 除 YTHDF2 外 ， 敲 除YTHDF1 可以顯著提高抗原特異性CD8+T 淋巴細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)以及細(xì)胞程序性死亡-配體1（pro‐grammed cell death ligand 1，PD-L1）阻斷劑的治療效果[8]。而METTL3 可以通過(guò)增加TRIAP、CD40和CD80 的翻譯來(lái)促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞激活[24]。這提示m6A 調(diào)節(jié)基因參與了免疫微環(huán)境調(diào)控。為了探索潛在機(jī)制，分析了m6A 風(fēng)險(xiǎn)組之間的免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)。結(jié)果表明，在高危組中，免疫刺激因子包括IFN-γ、IL-12A/B 的表達(dá)顯著降低，而免疫抑制因子CD155 的表達(dá)略有上調(diào)。這與免疫抑制的腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)相一致，再次驗(yàn)證了m6A 調(diào)節(jié)基因在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，基于m6A調(diào)節(jié)因子YTHDC2、IGF-2BP2 和 HNRNPC 構(gòu)建的 HNSCC 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型可以作為新的生物標(biāo)志物，評(píng)判HNSCC 患者預(yù)后，而異常的m6A 調(diào)節(jié)與腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)密切相關(guān)。因此，m6A RNA 甲基化可能成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，不僅可以殺死腫瘤細(xì)胞，還可以輔助抗腫瘤免疫治療。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。