鄭艷麗 綜述 賀建霞 審校

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)類型，約占NHL的30%，50歲以上更為常見[1]。DLBCL是一組異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，約60%的患者可用標(biāo)準(zhǔn)一線環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松聯(lián)合利妥昔單抗(R-CHOP)方案治愈，但仍有30%～40%的患者一線治療后失敗，發(fā)展為復(fù)發(fā)或難治性DLBCL(rrDLBCL)，且預(yù)后很差[2]。在R-CHOP治療后存活下來(lái)的耐藥亞克隆在復(fù)發(fā)時(shí)會(huì)變得更加豐富。早期識(shí)別rrDLBCL對(duì)于改善整體疾病的預(yù)后至關(guān)重要。

隨著對(duì)DLBCL的深入研究，表觀遺傳對(duì)其發(fā)生發(fā)展的影響日益受到重視。基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展使識(shí)別具有表觀遺傳改變的特定基因的能力迅速增長(zhǎng)，相關(guān)藥物的研發(fā)及臨床試驗(yàn)的開展也在不斷推進(jìn)。靶向DNA甲基化的藥物能夠通過重新編碼基因表達(dá)過程，影響細(xì)胞發(fā)育、激活機(jī)體免疫反應(yīng)，為DLBCL挽救治療提供可能。本文將DLBCL中有重要意義的DNA甲基化改變及其靶向治療的研究進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化對(duì)DLBCL的影響

1.1 DNA甲基化的平衡調(diào)控

表觀遺傳修飾是指未涉及基因DNA序列變化而導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生改變的遺傳模式。DNA甲基化是研究最深入的表觀遺傳修飾之一，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)和DNA去甲基化酶共同調(diào)控[3]。調(diào)控平衡的破壞參與了DLBCL的發(fā)生，DNMTs及其調(diào)控基因突變或過表達(dá)導(dǎo)致啟動(dòng)子甲基化修飾，高甲基化的啟動(dòng)子區(qū)島通過招募轉(zhuǎn)錄抑制因子阻斷轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致附近基因(如抑癌基因)表達(dá)失控或沉默，而DNA其他區(qū)域則呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)促進(jìn)原癌基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖和凋亡等過程。這體現(xiàn)了人類癌癥呈現(xiàn)整體低甲基化及特異區(qū)域高甲基化的特征，常提示疾病預(yù)后不良。Wedge等[4]將67例原發(fā)DLBCL活檢組織的整體甲基化水平以及74例患者血漿樣本中的循環(huán)游離DNA整體甲基化水平與基線臨床特征和總生存期相關(guān)聯(lián)，證實(shí)無(wú)論是哪種樣本基因組整體低甲基化與DLBCL患者生存不良均密切相關(guān)，是獨(dú)立不良預(yù)后因素，且整體低甲基化與其他基因高甲基化常同時(shí)發(fā)生。

1.2 DNMTs

DNMTs催化完成DNA甲基化，包括DNMT1和DNMT3兩個(gè)家族。DNMT1主要負(fù)責(zé)維持復(fù)制過程中或新生甲基化的活性；而DNMT3催化未甲基化DNA使其從頭甲基化，在甲基化位點(diǎn)的建立中起關(guān)鍵作用。DNMT3包括兩個(gè)從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a、DNMT3b和一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白DNMT3L。既往研究表明，人類癌癥中DNMTs的過表達(dá)與不良預(yù)后之間存在顯著相關(guān)性。Amara等[5]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分析81例DLBCL患者DNMTs表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。分析顯示DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的過表達(dá)率分別為48%、13%和45%，DNMT1和DNMT3b的同時(shí)過表達(dá)與晚期臨床分期和耐藥顯著相關(guān)，生存分析顯示DNMT3b過表達(dá)與較短的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期顯著相關(guān)，且是獨(dú)立的預(yù)后因素。以DNMTs為靶點(diǎn)的甲基化抑制劑根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為核苷和非核苷兩大類。核苷類抑制劑是一類以胞嘧啶核苷為原型的衍生物，其作用機(jī)制是在體內(nèi)代謝形成三磷酸脫氧核苷以代替在DNA復(fù)制過程中的胞嘧啶，因與DNMTs具有很強(qiáng)的結(jié)合力，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制DNMTs活性，阻斷甲基化反應(yīng)。此類藥物主要有阿扎胞苷和地西他濱等。非核苷類藥物不含胞嘧啶核苷結(jié)構(gòu)，其去甲基化作用在藥物臨床試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)，作用機(jī)制尚不明確。近期多項(xiàng)體外研究顯示使用地西他濱處理DLBCL細(xì)胞株有明顯的上調(diào)抑癌基因、抑制細(xì)胞增殖、抑制存活率作用[6-7]。Clozel等[8]在臨床試驗(yàn)中觀察到DLBCL的化療耐藥性與異常的DNA甲基化程序有關(guān)，長(zhǎng)期暴露于低劑量DNMTs抑制劑可使耐藥細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)阿霉素敏感。更重要的是，12例高危初治的老年DLBCL患者在R-CHOP之后連續(xù)使用阿扎胞苷產(chǎn)生了91.7%的臨床完全緩解率，這一數(shù)據(jù)令人鼓舞，但仍需要大樣本數(shù)據(jù)和長(zhǎng)期隨訪進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述，這些觀察結(jié)果提示DNMTs，尤其是DNMT1和DNMT3b過表達(dá)可能與DLBCL患者的較短生存期和化療耐藥有關(guān)，去甲基化治療或成為改善復(fù)發(fā)難治患者預(yù)后的途徑之一。

1.3 TET雙加氧酶

在體細(xì)胞中，TET雙加氧酶家族是催化DNA去甲基化的重要家族，包括TET1、TET2和TET3。TET酶將部分5-甲基胞嘧啶(5-mC)催化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，5-mC和5-hmC在TET酶的作用下氧化為5-羧基胞嘧啶(5-caC)，5-caC被胸腺嘧啶DNA糖基化酶特異性地識(shí)別，進(jìn)行堿基剪切修復(fù)，起到主動(dòng)去甲基化作用。TET基因突變致酶活性降低，導(dǎo)致其催化功能喪失[9]。TET1是一種CpG-DNA結(jié)合蛋白，能夠啟動(dòng)DNA去甲基化程序，是調(diào)節(jié)5-hmC正常含量、防止DNA超甲基化所必需的。Cimmino等[10]發(fā)現(xiàn)TET1的缺失在體內(nèi)增強(qiáng)了干細(xì)胞的自我更新，并與BCL-2過表達(dá)協(xié)同驅(qū)動(dòng)小鼠B淋巴細(xì)胞增多，首次為TET1作為造血系統(tǒng)惡性腫瘤，尤其是B細(xì)胞淋巴瘤的腫瘤抑制因子提供了體內(nèi)證據(jù)。TET2基因位于4q24.1區(qū)域，其突變存在于多種血液系統(tǒng)腫瘤中，以慢性粒單核細(xì)胞白血病、骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病最為常見，僅在2%的B細(xì)胞淋巴瘤中觀察到其突變[11]。TET2和TET3基因調(diào)節(jié)DLBCL的去甲基化，其甲基化缺失與激活誘導(dǎo)脫氨酶介導(dǎo)的B細(xì)胞受體信號(hào)通路突變以及G-四聯(lián)體和R-環(huán)的聚集減少有關(guān)，導(dǎo)致生發(fā)中心來(lái)源的B細(xì)胞淋巴瘤的自發(fā)發(fā)展[12]。目前尚無(wú)大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)表明TET突變和缺失與DLBCL的更高發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)以及更短的無(wú)進(jìn)展生存期有關(guān)。但在López-Moyado等[13]的研究中將TET缺陷的不同類型細(xì)胞如前體B細(xì)胞、T細(xì)胞和造血干細(xì)胞等與癌癥基因組的DNA甲基化模式相比，證明前者同樣有局部高甲基化和廣泛低甲基化的表觀遺傳模式。進(jìn)一步探索TET酶的作用對(duì)拓展DNA去甲基化的認(rèn)識(shí)及尋找淋巴瘤治療新靶點(diǎn)具有潛在意義。

1.4 PCDH10甲基化

PCDH10基因位于4q28.3，其編碼的PCDH10蛋白屬于非聚集原鈣黏蛋白家族δ2型，是一種鈣黏蛋白相關(guān)的跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于成人和胎兒組織中，在細(xì)胞連接、細(xì)胞遷移和軸向引導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。PCDH10在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用，可以通過調(diào)控PCDH10-DEPDC1-Caspase軸激活Caspase凋亡信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。在多種類型NHL中發(fā)現(xiàn)高頻PCDH10基因啟動(dòng)子高甲基化事件，且其高甲基化會(huì)導(dǎo)致NHL細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥性增強(qiáng)[14]。Ying等[15]在80%的DLBCL標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)PCDH10啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致的基因沉默或表達(dá)降低，而在正常淋巴結(jié)中未發(fā)現(xiàn)，提示PCDH10的表觀遺傳變異在DLBCL的發(fā)生中起重要作用。對(duì)TP53通路的研究顯示，PCDH10是TP53基因的新型轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。p53蛋白通過結(jié)合PCDH10啟動(dòng)子區(qū)域的共同結(jié)合位點(diǎn)來(lái)激活PCDH10的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移。野生型TP53可以誘導(dǎo)PCDH10的表達(dá)，而突變型TP53不能誘導(dǎo)PCDH10的表達(dá)[16]。為進(jìn)一步證實(shí)PCDH10甲基化在DLBCL中的意義，Huang等[17]提取了107例DLBCL患者基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。其中檢測(cè)到高達(dá)54.2%(58/107)的PCDH10啟動(dòng)子甲基化比率。生存分析顯示甲基化患者總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均較未甲基化患者縮短。近期國(guó)內(nèi)一項(xiàng)DLBCL組織與炎性增生組織PCDH10甲基化情況對(duì)比研究顯示，DLBCL組織甲基化比率(40/55)明顯高于炎性增生組織(6/23)，且高甲基化水平與患者高IPI評(píng)分、Ann Arbor分期晚有明顯相關(guān)性(P<0.05)，其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)地西他濱能逆轉(zhuǎn)PCDH10的高甲基化、促進(jìn)DLBCL細(xì)胞的凋亡，說(shuō)明PCDH10甲基化狀態(tài)可以作為一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)，有望成為表觀遺傳治療藥物的潛在靶點(diǎn)[18]。

2 DNA甲基化的靶向治療

DLBCL對(duì)標(biāo)準(zhǔn)免疫化療的耐藥性是一個(gè)尚未解決的難題。去甲基化不僅通過各種途徑影響腫瘤DNA，也可起到化療和免疫療法增敏的作用[19-20]。目前臨床上已開始嘗試?yán)冒邢虍惓NA甲基化來(lái)治療某些腫瘤。針對(duì)活化B細(xì)胞型DLBCL患者，在R-CHOP的基礎(chǔ)上追加新的靶向藥物已經(jīng)經(jīng)歷了非常多的嘗試，其中三項(xiàng)較大的全球多中心臨床試驗(yàn)(PHOENIX、REMoDL-B、ROBUST)研究均宣告失敗，提示活化B細(xì)胞型DLBCL患者仍然具有很高的異質(zhì)性。Wright教授團(tuán)隊(duì)從分子機(jī)制的角度將DLBCL分成了7類(MCD、BN2、N1、EZB-MYC+、EZB-MYC-、ST2、A53)，進(jìn)一步揭示了DLBCL的異質(zhì)性，提示制定個(gè)體化靶向治療方案的重要性[21]。相關(guān)研究顯示，突變型TP53與EZH2相互作用會(huì)增強(qiáng)其與染色質(zhì)的關(guān)聯(lián)，增加調(diào)節(jié)細(xì)胞自我更新和分化基因的H3K27三甲基化水平，藥物抑制EZH2會(huì)降低TP53突變DLBCL細(xì)胞的再生潛力[22]。趙維蒞教授團(tuán)隊(duì)在第16屆國(guó)際淋巴瘤大會(huì)上公布了其基于分子分型的DLBCL R-CHOP+X臨床對(duì)照研究(Guidance-01)的初步成果。其研究納入128例初發(fā)的中/高危DLBCL患者，基于分子分型的結(jié)果給予不同的靶向聯(lián)合治療方案。結(jié)果顯示TP53突變/缺失亞型患者聯(lián)合使用地西他濱的完全緩解率顯著高于R-CHOP組(82%vs.60%)，而副作用沒有顯著增加。目前地西他濱單藥治療rrDLBCL的Ⅳ期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行(NCT03579082)。上述研究均顯示出去甲基化藥物的治療潛力，有望推動(dòng)DLBCL進(jìn)入精準(zhǔn)分子治療時(shí)代。

3 小結(jié)與展望

更好地理解淋巴瘤的表觀遺傳改變提高了對(duì)淋巴瘤發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展的認(rèn)識(shí)。DNA甲基化是高度可變的過程，主要通過沉默腫瘤抑制基因起作用，多種靶向藥物可以逆轉(zhuǎn)異常的表觀遺傳修飾進(jìn)而改善疾病預(yù)后。去甲基化藥物在治療骨髓異常增生綜合征及髓系白血病等血液系統(tǒng)疾病方面取得了較好的療效，大量臨床前數(shù)據(jù)表明地西他濱對(duì)淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤也有明顯的抑制作用，臨床研究同樣顯示地西他濱對(duì)rrDLBCL可能具有較好的應(yīng)用潛力和治療活性，這為臨床醫(yī)生提供了新的治療思路。同時(shí)，不同類型表觀修飾抑制劑聯(lián)合用于腫瘤治療的方法也逐漸發(fā)展起來(lái)，例如5-氮雜胞苷與組蛋白脫乙酰酶伏立諾他聯(lián)合用于治療淋巴瘤的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行(NCT00538876和NCT01120834)。開發(fā)新型合理聯(lián)合治療手段為DLBCL治療描繪出更光明的治療前景。