史恒川 孔姍

胃癌(gastric cancer，GC)是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有腫瘤中占第6位，而死亡率位居第3位[1]。研究顯示，50%的胃腸道癌病例發(fā)生在中國，其中胃癌所占比例最大，五年總生存率小于35%[2]。幽門螺桿菌感染、飲食、飲酒、吸煙等都是致病的因素[3]。在胃癌的治療中主要依靠外科技術(shù)、傳統(tǒng)的放化療和新輔助治療[4]。然而，由于胃癌很少被早期診斷，大多數(shù)病人通常已經(jīng)進(jìn)展到晚期才發(fā)現(xiàn)。內(nèi)鏡檢查和病理檢查是胃癌早期篩查的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有創(chuàng)傷性的缺點(diǎn)；血液癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)水平檢測被認(rèn)為是一種無創(chuàng)的方法，但診斷效率低[5]。這意味著迫切需要尋找一種特異性和敏感性較高的篩選指標(biāo)。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度>200 bp且不具備編碼蛋白能力的RNA[6-7]，它可在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)[8]。近年來研究表明，lncRNA可作為一種生物標(biāo)志物參與調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程，對(duì)腫瘤的早期篩查和診斷具有特殊的臨床意義，但由于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制復(fù)雜，其具體分子機(jī)制尚不清楚[9-10]。

本研究首先通過胃癌高通量測序篩選出在胃癌組織中高表達(dá)2倍以上差異的lncRNA，經(jīng)過TCGA數(shù)據(jù)庫以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)的初步驗(yàn)證，篩選出lncRNA 00707。然后通過比較胃癌病人和健康對(duì)照組血清中的表達(dá)水平差異，監(jiān)測腫瘤動(dòng)態(tài)，探討血清lncRNA 00707是否可作為腫瘤標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年12月至2021年12月經(jīng)病理診斷初診為胃癌的病人40例，其中男23例，女17例，年齡60～89歲，同時(shí)選取經(jīng)胃鏡檢查排除胃部疾病的健康體檢者40例，其中男29例，女11例，年齡60～83歲。

1.2 研究方法

1.2.1 血清標(biāo)本收集：采集入組胃癌病人手術(shù)前后的血清標(biāo)本以及健康體檢者的血清標(biāo)本，用含有分離膠的真空采血管采集血液標(biāo)本，4000 r/min離心6 min，吸取上層血清1mL于無酶EP管中，保存用于檢測lncRNA 00707。同時(shí)用雅培I2000SR全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀檢測胃癌病人及健康體檢者腫瘤指標(biāo)CEA、CA19-9，用雅培C16000全自動(dòng)生化分析儀檢測血清ALT、AST、UA、肌酐(Cr)。

1.2.2 RNA提?。禾崛∥赴┎∪撕徒】刁w檢者以及各細(xì)胞系中的總RNA，采用分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-qPCR ：按照試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將獲得的cDNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。采用Roche 480 PCR儀檢測，循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌細(xì)胞株(BGC-803、MKN-45)培養(yǎng)于含10%FBS和1%三抗溶液的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，胃正常上皮細(xì)胞(GES-1)培養(yǎng)于含10% FBS和1%三抗的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中生長。

2 結(jié)果

2.1 血清lncRNA 00707檢測方法的創(chuàng)新 選擇常用的內(nèi)參18S，采用RT-qPCR方法檢測lncRNA 00707和18S的熔解曲線，可見熔解曲線單峰特異。隨機(jī)混合30例健康體檢者血清，分成10份，同一批次檢測10個(gè)復(fù)孔，檢測 lncRNA 00707的表達(dá)量，計(jì)算批內(nèi)CV；每天提取并檢測一份混合血清中l(wèi)ncRNA 00707的表達(dá)量，計(jì)算批間CV。結(jié)果顯示，RT-qPCR檢測血清中l(wèi)ncRNA 00707有良好的重復(fù)性。將混合血清室溫放置 1、2、3、4、5 h，采用RT-qPCR檢測lncRNA 00707的表達(dá)。結(jié)果顯示，lncRNA 00707的表達(dá)變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；另一方面，將混合血清在-80 ℃條件下反復(fù)凍融 0、1、3、5、10次，采用RT-qPCR檢測lncRNA 00707的表達(dá)，結(jié)果同樣顯示，lncRNA 00707的表達(dá)變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖1)。

圖1 RT-qPCR檢測LNCRNA 00707的方法評(píng)價(jià)

2.2 血清lncRNA 00707在胃癌中的表達(dá)水平 與健康體檢者比較，胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA 00707的表達(dá)水平顯著升高(2.644±0.334比1.271±0.123，P=0.0002)，血清CEA、CA19-9水平也顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 2組生化、腫瘤指標(biāo)水平比較

2.3 血清lncRNA 00707的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示，lncRNA 00707、CEA、CA19-9分別作為診斷指標(biāo)時(shí)，AUC為0.751(95%CI：0.646～0.855)、0.658(95%CI：0.537～0.779)和0.693(95%CI：0.573～0.814)；lncRNA 00707具有最大的診斷效能。將lncRNA00707與CEA聯(lián)合分析，ROC曲線下面積為0.765(95%CI：0.663～0.867)，聯(lián)合診斷時(shí)獲得更大的診斷效能。

2.4 血清lncRNA 00707作為診斷標(biāo)志物的循環(huán)潛力 我們?cè)谖赴┘?xì)胞(BGC-803和MKN-45)培養(yǎng)液和正常胃上皮細(xì)胞(GES-1)培養(yǎng)液中檢測lncRNA 00707的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，lncRNA 00707的表達(dá)水平在一定時(shí)間內(nèi)隨著胃癌培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，而在正常胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，血清中l(wèi)ncRNA 00707可能由腫瘤細(xì)胞釋放入血液(見圖2A)。

動(dòng)態(tài)監(jiān)測20例胃癌初診病人血清lncRNA 00707的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與術(shù)前相比(3.756±0.5473)，胃癌病人術(shù)后血清lncRNA 00707表達(dá)水平總體下降1.883±0.2907，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2B)。

圖2 血清lncRNA 00707的來源和循環(huán)監(jiān)測潛力

3 討論

眾所周知，胃癌是最常見的消化道腫瘤之一。胃癌起病隱匿，如果早發(fā)現(xiàn)大多可以治愈，尋找胃癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療的生物標(biāo)志物具有重要意義。全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)閘ncRNA的研究打開了新的序幕，而lncRNA曾被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的“噪聲”[11]。lncRNA的異常表達(dá)可以引起人類的各種疾病和紊亂[7]，監(jiān)測這些差異表達(dá)的lncRNA有利于感知人體的異常狀態(tài)，從而達(dá)到早期診斷的目的。

近年來，一系列研究證明，lncRNA可以作為診斷癌癥的標(biāo)志物，其中也包括胃癌。Wang等[12]的研究顯示，胸腔積液lncRNA可有效區(qū)分肺癌相關(guān)的惡性胸腔積液與良性胸腔積液。Tantai等[13]證實(shí)，血清 XIST和HIF1A-AS1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)增加，XIST和HIF1A-AS1聯(lián)合診斷獲得更高的陽性診斷率，AUC為 0.931。Li[14]報(bào)道了linc00152對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷準(zhǔn)確率較高，linc00152與CEA聯(lián)合使用比單獨(dú)使用linc00152、CEA的診斷效率更高。所有這些證據(jù)表明lncRNA在血液中可穩(wěn)定存在，并且可以被檢測，可作為癌癥診斷和預(yù)后監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR檢測lncRNA 00707在胃癌病人中的表達(dá)，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。結(jié)果顯示胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA 00707的表達(dá)明顯高于健康體檢者。初步構(gòu)建一種新的診斷模型，將lncRNA 00707與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA聯(lián)合檢測，顯著提高了胃癌病人的診斷效率。此外，手術(shù)后病人血清lncRNA 00707顯著下降，達(dá)到與健康體檢者相似的水平，這在一定程度上預(yù)示著疾病的改善或沒有進(jìn)展。

總之，升高的血清lncRNA 00707可能是一種潛在的胃癌診斷生物標(biāo)志物，并可用于監(jiān)測腫瘤動(dòng)態(tài)。后期我們將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，同時(shí)追蹤隨訪，動(dòng)態(tài)監(jiān)測lncRNA 00707的表達(dá)在放化療治療前后的變化，分析病人的生存時(shí)間與lncRNA 00707表達(dá)水平之間的相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證血清lncRNA 00707檢測的臨床應(yīng)用價(jià)值。