谷子單籽粒醇溶蛋白提取方法的建立及其在雜交種純度鑒定中的應(yīng)用

崔燕嬌， 劉 丹， 趙子龍， 李素英， 張 靜， 劉正理

(1.唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 唐山 063000； 2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物研究所，天津市農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

谷子[Setariaitalica(L.) P. Beauv]是起源于中國(guó)的一種古老作物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含人體所需的多種維生素、氨基酸和礦物質(zhì)，具有抗旱、耐瘠薄、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，尤其適合在北方干旱和半干旱地區(qū)種植。雜種優(yōu)勢(shì)利用已經(jīng)成為提高作物產(chǎn)量的有效途徑，在谷子雜交種應(yīng)用方面已經(jīng)獲得了一定突破[1-2]。谷子雜交種是由不育系母本和恢復(fù)系父本配組育成的兩系雜交種，且母本具有5%左右的自交結(jié)實(shí)率，因此在制種過(guò)程中不可避免地會(huì)導(dǎo)致雜交種中混雜一定的不育系自交種。此外，由于授粉時(shí)雜株花粉的污染、收獲時(shí)的機(jī)械混雜以及收獲后的處理程序等原因，也會(huì)導(dǎo)致雜交種中混有恢復(fù)系和其他假雜交種，從而嚴(yán)重影響谷子雜交種的純度[3-4]。這些假雜種或者幾乎沒(méi)有產(chǎn)量，或者產(chǎn)量明顯低于真雜交種，它們的存在必然導(dǎo)致雜交種增產(chǎn)潛力得不到充分發(fā)揮。因此，如何有效地鑒定谷子雜交種的純度，成為保證雜交種增產(chǎn)效果的重要一環(huán)。

目前，雜交種純度的鑒定方法仍以田間小區(qū)種植鑒定為主，該方法主要是基于雜交種和親本的形態(tài)特征和生理特性，如幼苗顏色和除草劑抗性等。20世紀(jì)90年代以前，通常以苗色較深的谷子恢復(fù)系做父本，苗色較淺的不育系做母本，以此來(lái)區(qū)別混雜在雜交種中的母本。20世紀(jì)90年代末，隨著抗烯禾啶除草劑恢復(fù)系的培育和應(yīng)用，通過(guò)對(duì)谷子苗進(jìn)行除草劑噴施處理，可以鑒別和去除混雜在雜交種中的不抗烯禾啶的不育系。然而，這2種方法均不能辨別出雜交種中混入的恢復(fù)系和其他假雜種，并且這些形態(tài)和生理指標(biāo)易受環(huán)境條件影響，雜交種純度難以準(zhǔn)確鑒定。

近年來(lái)，隨著功能基因組學(xué)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記在種子純度鑒定方面的應(yīng)用日益廣泛。這一方法不受環(huán)境影響、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是要求引物應(yīng)達(dá)到一定數(shù)量、且多態(tài)性好，成本較高、操作也比較復(fù)雜，因而不適于進(jìn)行大規(guī)模的雜交種純度鑒定，難以適應(yīng)商業(yè)化開(kāi)發(fā)[5]。所以，建立一種更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的雜交種純度鑒定方法，已成為當(dāng)務(wù)之急。

自20世紀(jì)80年代末以來(lái)，醇溶蛋白電泳技術(shù)成為作物品種鑒定、遺傳多樣性分析和雜交種純度鑒定的有效手段，在小麥、玉米、水稻和高粱等作物中得到廣泛應(yīng)用。醇溶蛋白是禾本科作物種子胚乳中的一種主要貯藏蛋白，其蛋白質(zhì)譜帶完全受基因型控制，不受環(huán)境條件和栽培措施的影響，在品種間的多態(tài)性穩(wěn)定豐富，并且在進(jìn)化中更為保守，可以作為品種的“生化指紋”[6-7]。在谷子中，醇溶蛋白約占種子總蛋白的40%～60%，相對(duì)分子質(zhì)量大小在1.3×104～5.5×104[8-11]。過(guò)去10年中，研究人員曾嘗試?yán)迷谛←溨袕V泛應(yīng)用的方法從谷子籽粒中分離醇溶蛋白并檢測(cè)其電泳圖譜[11-13]。然而，由于谷子粒小、蛋白質(zhì)含量低、醇溶蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小且存在一定差別，小麥醇溶蛋白的提取方法很難直接應(yīng)用于分離谷子醇溶蛋白，更不能從單粒谷子籽粒中提取醇溶蛋白用于雜交種純度鑒定。酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acidic polyacrylamide-gel electrophoresis，A-PAGE)是國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)推薦的用于小麥品種鑒定和純度檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[14]，但是將其凝膠濃度和強(qiáng)度應(yīng)用于谷子很難獲得理想的醇溶蛋白電泳圖譜[11]。因此，本研究對(duì)現(xiàn)有的醇溶蛋白提取方法和A-PAGE電泳技術(shù)進(jìn)行改良，建立一種快速、易操作、成本低、準(zhǔn)確性高的谷子單籽粒醇溶蛋白提取和電泳檢測(cè)方法，為谷子雜交種的純度檢測(cè)和種子管理提供一條簡(jiǎn)便、可行的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交谷子品種唐雜谷56229，其母本和父本分別為谷56A和HK229。2個(gè)常規(guī)谷子品種，冀谷31和冀谷32。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 醇溶蛋白提取 谷子醇溶蛋白提取液中含有20%N,N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF)、20%蔗糖、50%異丙醇和去離子水。選取飽滿的單粒谷子籽粒，置于2 ml離心管中，利用組織研磨儀將籽粒研磨成粉末狀。向離心管中加入50 μl提取液，渦旋振蕩混勻后置于65 ℃烘箱中過(guò)夜。取出離心管，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5 ml離心管中，在4 ℃冰箱中保存用于A-PAGE電泳。

1.2.2 制膠 用于A-PAGE電泳的酸性聚丙烯酰胺凝膠溶液中含有15.000 0%丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺(Acr/Bis=29)、6.000 0%尿素、0.004 0%硫酸亞鐵、0.150 0%抗壞血酸、0.062 5%甘氨酸、1.250 0%冰醋酸、0.006 0%過(guò)氧化氫。

1.2.3 電泳 取30 μl谷子籽粒醇溶蛋白提取液，加入含有30 μl上樣緩沖液(80.00%甘油、0.02%甲基綠染料和去離子水)的1.5 ml離心管中，12 000 r/min離心1 min，振蕩混勻，重復(fù)離心1 min，4 ℃冰箱保存過(guò)夜后取10 μl加入點(diǎn)樣孔，以0.04%甘氨酸+0.40%冰醋酸溶液為電極液，在500 V電壓下電泳90 min。

1.2.4 染色與脫色 電泳后將凝膠置于含有0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250、25.0%異丙醇、10.0%冰醋酸的溶液中染色10～20 min，漂洗后照相。

1.2.5 烯禾啶除草劑處理 唐雜谷56229雜交種和其父本HK229對(duì)烯禾啶除草劑具有抗性，而母本谷56A不抗烯禾啶除草劑，因此可以利用苗期除草劑噴施處理去除雜交種中混雜的母本，鑒定雜交種純度。取200粒唐雜谷56229的種子播種于土壤中，在4葉期噴施烯禾啶除草劑，在處理前和處理后7 d分別觀察谷子苗的生長(zhǎng)和存活情況，并拍照記錄表型。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適于谷子單籽粒醇溶蛋白提取方法的建立

與玉米、小麥、高粱、水稻等作物相比，谷子的籽粒更小，其醇溶蛋白含量低，且相對(duì)分子質(zhì)量小[11]，而進(jìn)行雜交種純度鑒定必須以單粒種子為樣品。因此，對(duì)于利用谷子醇溶蛋白的多態(tài)性進(jìn)行雜交種純度鑒定來(lái)說(shuō)，提高醇溶蛋白的溶解性和提取效率至關(guān)重要，而這又與蛋白質(zhì)提取所用的有機(jī)溶劑種類(lèi)密切相關(guān)。在前人的研究中，異丙醇、DMF、乙醇、叔丁醇等溶劑曾用于谷子[12,15]、大麥[16-17]、小麥[6,18-22]、玉米[23]、珍珠稷[24]、黍[25]等作物籽粒醇溶蛋白的提取。在本研究中，為了建立適于谷子單籽粒醇溶蛋白提取的方法，我們?cè)谇叭艘援惐紴橛袡C(jī)溶劑提取谷子醇溶蛋白的基礎(chǔ)上，嘗試在提取液中加入DMF，利用含有不同種類(lèi)和不同濃度溶劑的提取液進(jìn)行醇溶蛋白提取，并通過(guò)A-PAGE進(jìn)行電泳分離。結(jié)果表明，當(dāng)提取液中只含有DMF或異丙醇一種溶劑時(shí)，醇溶蛋白溶解度較低，提取效率不高。相比之下，同時(shí)含有DMF和異丙醇的提取液能夠從單粒谷子籽粒中提取出更多的、相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍廣的醇溶蛋白，并且DMF和異丙醇的最適濃度分別為20%和50%。此外，為了增加提取液和谷子籽粒的接觸面積、促進(jìn)醇溶蛋白的溶解，我們將谷子籽粒與提取液加入離心管后首先通過(guò)渦旋振蕩的方法使二者充分接觸、混合均勻，然后置于65 ℃烘箱中過(guò)夜，在高溫下促進(jìn)醇溶蛋白與提取液的反應(yīng)。結(jié)果表明，這些操作均有助于從單粒谷子籽粒中提取出醇溶蛋白。

2.2 醇溶蛋白多態(tài)性分析

除了醇溶蛋白的提取效率之外，A-PAGE電泳的條件，如上樣量、凝膠濃度、催化劑的用量等，也影響著最終的電泳效果。在本研究中，為了確保提取的籽粒醇溶蛋白盡可能多地沉積到點(diǎn)樣孔中，我們?cè)贏-PAGE電泳前向醇溶蛋白樣品中首先加入適宜劑量(30 μl)的含有80.00%甘油和0.02%甲基綠的上樣緩沖液。其次，將凝膠濃度由前人應(yīng)用的12.5%[12,15]提高至15.0%，以獲得盡可能多的不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的醇溶蛋白清晰譜帶，充分反映供試樣品醇溶蛋白的多態(tài)性。有研究結(jié)果表明，抗壞血酸、硫酸亞鐵和過(guò)氧化氫等凝膠催化劑的用量是影響凝膠強(qiáng)度、聚合時(shí)間、形成網(wǎng)眼的孔徑大小等的關(guān)鍵因素，而這些因素進(jìn)一步又影響著醇溶蛋白電泳譜帶的分辨率[26]。因此，在本研究中，我們以0.004%的硫酸亞鐵和0.006%的過(guò)氧化氫作為催化劑，通過(guò)提高催化劑的用量來(lái)增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度，以獲得更高的醇溶蛋白譜帶分辨率和更明顯的電泳分離效果。此外，凝膠強(qiáng)度的提高也使凝膠與玻璃板更易分離，從而降低起板時(shí)的凝膠損傷率，維持凝膠的完整性。

在本研究中，我們利用同時(shí)含有20% DMF和50%異丙醇的提取液，從唐雜谷56229雜交種和其母本谷56A、父本HK229單粒籽粒中提取醇溶蛋白，以上述經(jīng)過(guò)改良的A-PAGE條件進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，獲得的醇溶蛋白譜帶豐富，帶型清晰、明顯，且雜交種和親本間帶型表現(xiàn)出明顯的差異，具有較高的醇溶蛋白多態(tài)性和譜帶分辨率，表明通過(guò)單籽粒醇溶蛋白提取和A-PAGE電泳的方法可以對(duì)谷子品種進(jìn)行有效的鑒定。

2.3 基于醇溶蛋白多態(tài)性的谷子雜交種純度鑒定

為了將建立的新方法應(yīng)用于谷子雜交種純度鑒定，分別選取297粒和298粒來(lái)自于河北省邢臺(tái)市柏鄉(xiāng)縣上京村和白樓村的唐雜谷56229籽粒作為供試樣本，以來(lái)自于唐山師范學(xué)院遷西谷子科研實(shí)驗(yàn)站的母本谷56A和父本HK229籽粒作為對(duì)照，提取單粒醇溶蛋白，通過(guò)A-PAGE電泳進(jìn)行雜交種純度鑒定。通過(guò)將供試雜交種材料的醇溶蛋白譜帶與對(duì)照進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)來(lái)自于上京村和白樓村的供試樣本中分別有18.52%和32.55%的籽粒醇溶蛋白具有唐雜谷56229的特異譜帶，表明其為真雜交種；供試樣本中分別有70.71%和54.7%的籽粒醇溶蛋白譜帶與母本谷56A對(duì)照一致，表明其為樣本中混雜的母本；供試樣本中分別有10.77%和12.75%的籽粒醇溶蛋白譜帶與父本HK229相同，表明其為樣本中混雜的父本。從總體看，在所有供試雜交種材料中，平均真雜交種純度為25.55%，假雜種百分率為74.45%，包括混雜的母本(平均62.69%)和父本(平均11.76%)種子。

2.4 基于除草劑處理的谷子雜交種純度鑒定

為了對(duì)上述雜交種鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)相同來(lái)源的唐雜谷56229雜交種材料進(jìn)行除草劑噴施處理，通過(guò)田間鑒定方法進(jìn)行雜交種純度檢測(cè)。結(jié)果表明，噴施烯禾啶除草劑7 d后，來(lái)自于上京村和白樓村的雜交種供試材料中，分別有77.36%和55.63%的幼苗生長(zhǎng)明顯受到了抑制，平均為66.50%，表明這些材料對(duì)烯禾啶除草劑沒(méi)有抗性，是混入雜交種中的母本，這一結(jié)果與基于籽粒醇溶蛋白多態(tài)性的鑒定結(jié)果(62.69%)基本一致，證明我們建立的醇溶蛋白提取和A-PAGE電泳方法用于谷子雜交種純度鑒定是可行且可靠的。在2份供試雜交種材料中，分別有22.64%(上京村)和44.37%(白樓村)的幼苗在噴施烯禾啶除草劑后仍然能夠正常生長(zhǎng)，平均為33.51%。這一結(jié)果與基于籽粒醇溶蛋白多態(tài)性的鑒定結(jié)果(25.55%)存在一定偏差，主要原因在于該方法不能區(qū)分雜交種和恢復(fù)系等抗烯禾啶除草劑的假雜種，由此也證明通過(guò)籽粒醇溶蛋白的多態(tài)性進(jìn)行谷子雜交種純度鑒定的結(jié)果更為準(zhǔn)確。

3 討 論

張雜谷5號(hào)和唐雜谷5695的高產(chǎn)紀(jì)錄表明雜種優(yōu)勢(shì)是提高谷子產(chǎn)量的有效途徑[1-2]，但是，雜交種中不育系、恢復(fù)系以及其他假雜種的混雜嚴(yán)重限制了雜交種的增產(chǎn)潛力及其推廣應(yīng)用[3-4]。因此，要保證雜交種的增產(chǎn)效果，就必須鑒定雜交種純度，從而準(zhǔn)確計(jì)算雜交種的適宜播種量。醇溶蛋白的A-PAGE電泳技術(shù)已經(jīng)在小麥等作物的雜交種純度鑒定中得到應(yīng)用，但是由于谷子粒小、蛋白含量低、醇溶蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小等特點(diǎn)，現(xiàn)有方法很難適用于谷子籽粒醇溶蛋白的提取和電泳分離。盡管一些研究人員曾嘗試將小麥醇溶蛋白電泳技術(shù)應(yīng)用于谷子品種鑒定和遺傳多樣性分析，但是均需要10粒以上的種子才能夠提取到足夠的醇溶蛋白[12,15]，顯然這無(wú)法滿足雜交種純度鑒定必須以單粒種子為樣本的要求。本研究建立了一種適用于谷子的單籽粒醇溶蛋白提取方法和相應(yīng)的A-PAGE電泳技術(shù)，并利用醇溶蛋白多態(tài)性鑒定谷子雜交種純度。在2019年和2020年，利用這一方法對(duì)河北豐苑種業(yè)有限公司生產(chǎn)的唐谷雜56229雜交種進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果分別為22.83%和25.55%。2020年，對(duì)河北衡研種業(yè)有限公司生產(chǎn)的唐雜谷5695雜交種進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果為22.93%。據(jù)此設(shè)計(jì)兩雜交種的播種量為7.5 kg/hm2，預(yù)計(jì)真雜交種出苗數(shù)約為1 hm24.6×105～5.1×105株，通過(guò)田間噴施間苗劑去除假雜種后，均可以達(dá)到1 hm24.5×105～5.2×105株的大田留苗密度。利用這一方法可以準(zhǔn)確鑒定種子純度，從而維持谷子雜交種的增產(chǎn)效果，促進(jìn)谷子雜種優(yōu)勢(shì)利用。

醇溶蛋白因其溶于醇類(lèi)而得名[27]，乙醇、異丙醇、叔丁醇等醇類(lèi)曾用于多種作物籽粒醇溶蛋白的提取[6,16-17,21-25]。有研究結(jié)果表明，對(duì)谷子醇溶蛋白提取來(lái)說(shuō)，異丙醇是比2-氯乙醇更適合的溶劑[15]，但仍很難從單粒籽粒中提取高濃度的醇溶蛋白用于多態(tài)性檢測(cè)。DMF可以增加蛋白質(zhì)溶解度，也曾在一些研究中用于小麥醇溶蛋白的提取。因此，本研究以含有20% DMF和50%異丙醇2種溶劑的提取液進(jìn)行谷子醇溶蛋白提取，發(fā)現(xiàn)獲得的醇溶蛋白濃度更高、譜帶更豐富。此外，醇類(lèi)物質(zhì)通常會(huì)吸收凝膠中的水分而導(dǎo)致膠孔彎曲、電泳條帶不整齊，而本研究建立的方法可以很好地解決這一問(wèn)題，使醇溶蛋白譜帶更易觀察、多態(tài)性更易分析。

醇溶蛋白圖譜由遺傳因子決定，不受外界環(huán)境的影響，且在品種間存在差異，因而是遺傳多樣性分析和品種鑒定的理想“指紋”和遺傳標(biāo)記[6]。本研究發(fā)現(xiàn)谷子雜交種的醇溶蛋白圖譜中呈現(xiàn)出不同于親本的特異譜帶，表明利用醇溶蛋白多態(tài)性可以區(qū)別混雜于雜交種中的親本，從而鑒定種子純度。在本研究中，利用醇溶蛋白多態(tài)性鑒定雜交種中混入的母本百分率與通過(guò)特定除草劑處理檢測(cè)的雜交種中混入的母本百分率相似，證明我們建立的谷子雜交種純度鑒定方法是可靠、有效的。根據(jù)谷子苗對(duì)除草劑處理的耐受性只能鑒別出雜交種中混雜的母本，而無(wú)法去除同樣具有除草劑抗性的父本材料，根據(jù)醇溶蛋白多態(tài)性則可以同時(shí)將雜交種中混雜的父本和母本材料鑒別出來(lái)，因此鑒定結(jié)果更為精確。此外，除草劑處理等田間鑒定方法往往周期較長(zhǎng)，需要經(jīng)歷育苗過(guò)程，且結(jié)果易受出苗率的影響。而基于醇溶蛋白多態(tài)性的鑒定方法只需以種子為樣本，在短短幾天內(nèi)即可完成檢測(cè)，且結(jié)果不受溫度、土壤水分等環(huán)境和栽培條件的影響。因此，本研究建立的谷子單籽粒醇溶蛋白提取方法和A-PAGE電泳分離技術(shù)為谷子和其他作物的雜交種純度鑒定提供了一種更為簡(jiǎn)便易行、快速精確的有力工具，有助于提高雜交種的增產(chǎn)潛力，促進(jìn)雜交種的推廣應(yīng)用。