基于三種分子標(biāo)記的栽培金雞菊遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

孫浩男，李 蓉，王 鑫，周欣瑩，李明陽，劉冬云*，李 鶴

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000；2.天津泰達(dá)園藝有限公司，天津 300000)

栽培金雞菊(Coreoopsis)大多為一年生或多年生草本，既包括一些自野外長(zhǎng)期引種篩選用于栽培的原生種，也包括許多人工培育的新品種，其舌狀花呈現(xiàn)白色、黃色、橙色、紅色、粉色、紫色及多種復(fù)色和變色，花徑大小也有不同，具有極高的觀賞價(jià)值，深受園林景觀和家庭園藝的喜愛，大部分栽培金雞菊的適應(yīng)性廣泛，一些園藝品種的花期可自5—6月開至霜凍，花期極長(zhǎng)[1-2]。菊科(Compositae)金雞菊屬植物大多能夠自播，主要原產(chǎn)于北美洲和南美洲，我國(guó)主栽劍葉金雞菊(C.lanceolata)、大花金雞菊(C.grandiflora)和兩色金雞菊(C.tinctoria)等7種，而國(guó)外常栽種的還有耳葉金雞菊(C.auriculata)、萊氏金雞菊(C.leavenworthii)等[3-4]。金雞菊屬植物形態(tài)變異豐富，同種內(nèi)存在較多變異類型，僅憑形態(tài)特征進(jìn)行鑒定不易，我國(guó)一些學(xué)者也常將大花金雞菊、劍葉金雞菊和金鬃金雞菊(C.basalis)混淆，而栽培金雞菊許多園藝品種之間或和原種相比形態(tài)也十分接近，一些品種的遺傳背景也不清晰。我國(guó)的栽培金雞菊種質(zhì)主要依靠國(guó)外引進(jìn)，有部分種質(zhì)來歷不明且存在同名異物的現(xiàn)象，同時(shí)，由于目前國(guó)際上對(duì)于栽培金雞菊也沒有較為系統(tǒng)的遺傳圖譜，許多種質(zhì)的親緣關(guān)系也不明確，這些都限制了金雞菊種質(zhì)資源的利用[5-7]。

栽培金雞菊的園藝品種大多通過遠(yuǎn)緣雜交培育，美國(guó)Terra nova公司利用輪葉金雞菊(C.verticillata)、玫紅金雞菊(C.rosea)等北美原生種培育了一系列遠(yuǎn)緣雜交品種，如花小且繁密的Pie系列，葉片金黃的Lemonade系列，花色豐富且具有一定耐寒性的Hardy Jewel系列等[8-11]，這些也是較早引入我國(guó)的無性系品種，常被稱為“迷你金雞菊”。個(gè)人育種家Probst引入更多原生種，通過6代以上的遠(yuǎn)緣雜交培育了眾多代表性品種，如花大色艷的Big Bang系列和Little Bang系列、葉型纖細(xì)且花色豐富的Satin and Lace系列和PermaThread系列、植株緊湊且耐寒性強(qiáng)的Leading Lady系列、耐熱性強(qiáng)且適宜盆栽的Coloropsis系列等[1,12-15]，這些也是目前國(guó)際上較受歡迎的家庭園藝品種。韓國(guó)Uri Seed公司利用伽馬射線和除草劑對(duì)現(xiàn)有品種未生根的插條進(jìn)行誘變，篩選出了株型緊湊、適宜盆栽且花色和花型組成奇特的Uri Twinklebells系列、Uri Bloomsation系列和Uri Gardenscape系列等[16-19]，主要在日本、韓國(guó)和歐洲推廣。此外，也有一些其它國(guó)家的園藝公司在培育不同大花類型的金雞菊品種，如美國(guó)Ball公司的UpTick系列和‘Superstar’、以色列Danziger公司的Solanna系列，荷蘭Dümmen Orange公司的‘Moonswirl’等[20-22]。一些由野外引種選育的栽培種質(zhì)常用于綠化和藥用栽培，它們通常具有自播性和入侵性較強(qiáng)的缺點(diǎn)[23]。近年來，我國(guó)盆栽觀賞和花境設(shè)計(jì)對(duì)栽培金雞菊品種的類型和數(shù)量要求不斷加大，應(yīng)用較多是籽播類型的大花金雞菊品種如‘Early Sunrise’,‘Sunkiss’等[24-25]，并非上述提到的無性系品種。

DNA是研究植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系常用的標(biāo)記手段，多年以來，有多種分子標(biāo)記在金雞菊屬植物上得到應(yīng)用，如AFLP[26-27]，RAPD[28]，SSR[29-30]，ISSR[31-32]等，此外，還有眾多學(xué)者利用ITS，matK，psbA-trnH，trnL-F，rbcL等序列研究了金雞菊屬和金雞菊族(Coreopsideae)內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳變異[7,33]。ISSR是一種不需要知道DNA序列即可用錨定引物擴(kuò)增的技術(shù)，它同時(shí)結(jié)合了SSR和RAPD兩種分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，具有成本低、操作便捷、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)[34]。核基因ITS、葉綠體基因psbA-trnH和trnL-F序列是常見的DNA條形碼，可作為快速和準(zhǔn)確識(shí)別許多植物物種的有效工具用于園林花卉的栽培溯源和品種分類，其中ITS和ITS2基因更是中國(guó)DNA條形碼植物工作組認(rèn)定的種子植物核心條形碼[35-38]。本研究以課題組收集自國(guó)內(nèi)外的100份金雞菊種質(zhì)為試驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，旨在從分子角度上為栽培金雞菊在分類鑒定、育種及指紋圖譜構(gòu)建等方面提供更多理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試金雞菊種質(zhì)共100份，包括14個(gè)種，78個(gè)園藝品種(24個(gè)籽播系，54個(gè)無性系)，3個(gè)課題組自選育種質(zhì)(1個(gè)籽播系，2個(gè)無性系)，主要收集自世界各國(guó)，詳情見表1。

表1 供試的100份栽培金雞菊的信息

1.2 DNA提取、引物篩選和PCR擴(kuò)增

2020年8月初統(tǒng)一采集植株的成熟葉片，植物基因組DNA試劑盒購(gòu)買自康為世紀(jì)公司，具體步驟按說明書進(jìn)行。使用Nano Drop 2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取的金雞菊DNA濃度，并用1.5%瓊脂糖凝膠(1×TAE緩沖液，120 V，0.5 h)對(duì)DNA母液上樣檢測(cè)，剔除不合格的樣品重新提取直到合格。DNA模板及引物分別稀釋至30 ng·μL-1，10 μmol·L-1備用。

ISSR引物參考哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR引物(http://www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf)進(jìn)行試驗(yàn)，去除無擴(kuò)增產(chǎn)物及彌散嚴(yán)重的引物，初步篩選出27條，再以17個(gè)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的籽播型金雞菊DNA模板進(jìn)行退火溫度試驗(yàn)，復(fù)篩出擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、清晰且多態(tài)性較好的12條引物。反應(yīng)體系20 μL：DNA模板2 μL、2×Es Taq Master Mix 10 μL、引物2 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min、94℃變性45 s、退火45 s(最適溫度)、72℃延伸45 s、32個(gè)循環(huán)、72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)(1×TAE緩沖液，120 V，40 min)，使用FR-2000成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和記錄。

ITS擴(kuò)增正反向引物分別為ITS5-modified(5′-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[39]；psbA-trnH區(qū)正反向引物為psbAF(5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′)和trnHR(5′-CGCGCATGGT GGATTCACAATCC-3′)[40]；trnL-F區(qū)正反向引物為通用引物trnL-c(5′-CGAAATCGGT AG ACGCTACG-3′)和trnL-f(5′-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′)[41]。反應(yīng)體系25 μL：DNA模板2 μL、2×Es Taq Master Mix 12.5 μL、正反向引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變形4 min、94℃變性45 s、退火45 s(ITS為64℃、psbA-trnH和trnL-F為60℃)、72℃延伸1 min、35個(gè)循環(huán)、72℃終延伸10 min。檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收和雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

ISSR電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同位置無條帶或不易分辨的弱帶記為“0”，以此建立原始數(shù)據(jù)矩陣。計(jì)算各引物的擴(kuò)增總帶數(shù)(TB)、多態(tài)性帶數(shù)(PB)、多態(tài)性百分比(PPB)、利用Popgene 32軟件分析群體總觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)。使用NTsys 2.10e軟件，繪制UPMGA聚類圖。利用Popgene 32軟件計(jì)算各材料間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離[42]。

ITS，psbA-trnH和trnL-F基因參照各測(cè)序峰圖，利用BioEdit軟件查看測(cè)序結(jié)果，并對(duì)序列進(jìn)行人工校對(duì)和拼接，修剪兩端后計(jì)算序列長(zhǎng)度、平均序列長(zhǎng)度、GC含量、平均GC含量，由于ITS基因測(cè)序結(jié)果不佳，僅截取ITS2區(qū)進(jìn)行分析。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已發(fā)表的金雞菊相關(guān)基因進(jìn)行Blast比對(duì)，并利用ClustalX 1.08和MEGA 7.0軟件將多序列進(jìn)行對(duì)位排列，對(duì)齊和修剪后的序列導(dǎo)入DNAMAN 8和DNASP 5軟件突變總數(shù)(Total number of mutations，Eta)變異位點(diǎn)(Variable sites，V)、單一突變位點(diǎn)(Singleton sites，S)、簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)(Parsimony-informative sites，Pi)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)、平均核苷酸差異數(shù)(k)、單倍型數(shù)目(Number of haplotypes，h)、單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)、單倍型多樣性方差(Variance of haplotype diversity，Vh)、單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Standard deviation of haplotype diversity，Sh)。最終以同為金雞菊族的紅花大麗花(Dahliacoccinea)為外類群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[43-45]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR分析

2.1.1遺傳多樣性 由圖1和表1可知，100個(gè)栽培金雞菊種質(zhì)的多態(tài)性較高，總共擴(kuò)增出清晰的條帶153個(gè)，多態(tài)性條帶(PB)149個(gè)，多態(tài)性條帶百分比(PPB)為97.39%，每條引物擴(kuò)增的條帶8～16個(gè)不等，平均擴(kuò)增條帶12.75個(gè)，最多的是UBC825，最少的是UBC879。群體總觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)為1.973 9，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.486 5、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.288 6和Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.440 6。

表2 12條ISSR引物的基本信息統(tǒng)計(jì)

圖1 ISSR引物UBC825和UBC868部分PCR擴(kuò)增電泳圖譜

2.1.2聚類分析 遺傳相似系數(shù)介于0.413 8～1之間，平均為0.713 2，有13組達(dá)到了1，如‘中央舞臺(tái)’和‘精彩表演’、‘南瓜派’和‘櫻桃派’等，這些組合或是具有相同的父母本，或是源于同一品種的變異。沙漠金雞菊與大花金雞菊‘太陽之子’、‘陽光’、‘圣達(dá)菲’的遺傳相似系數(shù)最小，為0.542 2，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。遺傳距離整體介于0～0.960 0，平均為0.383 5。有13組為0，如Lemonade系列、‘甜夢(mèng)’與‘天堂之門’等，不能區(qū)分部分同系列的種質(zhì)，也不能用于鑒別變異品種。

根據(jù)ISSR的UPGMA聚類圖(圖2)，在L1(D=0.664)處，100個(gè)金雞菊種質(zhì)可劃分為4類，與金雞菊屬下的分組有一定關(guān)聯(lián)，在L2(D=0.664)處可進(jìn)一步劃分為14個(gè)小組，可進(jìn)一步劃分種一級(jí)的種質(zhì)。第Ⅰ類由部分金雞菊組種質(zhì)組成，分別為金鬃金雞菊(A)和皇冠金雞菊(B)；第Ⅱ類的89個(gè)材料可分為9組，前5組包括兩色組的兩色金雞菊(C)和萊氏金雞菊(G)、歧序組的玫紅金雞菊(D)，還有不可思議系列、Coloropsis系列、Lemonade系列、Pie系列、Uri Dream系列等品種，F(xiàn)組包括了‘月光’和所有輪葉金雞菊雜交品種，第Ⅱ類后4組包括除第Ⅰ類其余金雞菊組的種質(zhì)和Big Bang系列、Little Bang系列、Solanna系列、‘雪莓’等。第Ⅲ類包括僅包括輪葉組的大葉金雞菊、三葉金雞菊、掌葉金雞菊、輪葉金雞菊；第Ⅳ類為異果組的沙漠金雞菊。

圖2 基于ISSR的100份金雞菊種質(zhì)資源的UPGMA聚類圖

2.2 psbA-trnH，trnL-F及ITS2序列分析

2.2.1序列及多態(tài)性分析 根據(jù)部分電泳結(jié)果(圖3)，psbA-trnH序列大小在250～500 bp之間，其中輪葉組的輪葉金雞菊-德國(guó)、大葉金雞菊、掌葉金雞菊、三葉金雞菊和異果組的沙漠金雞菊的序列明顯較長(zhǎng)；trnL-F和ITS序列大小在700～800 bp之間，序列之間大小差異不明顯。部分ITS序列出現(xiàn)非特異性條帶，為通用性引物導(dǎo)致，但都有一條明亮主帶，切取這部分條帶進(jìn)行回收測(cè)序。測(cè)序結(jié)果中，ITS序列GC堿基富集，部分位點(diǎn)出現(xiàn)套峰，部分片段底峰較高，因此僅截取測(cè)序結(jié)果較好的ITS2區(qū)進(jìn)行序列處理和分析。將psbA-trnH，trnL-F及ITS2共300個(gè)序列上傳至NCBI獲得登錄號(hào)(表1)：ON887337～ON887436，ON887437～ON887536，ON887537～ON887636。

圖3 部分ITS、psbA-trnH和trnL-F序列電泳圖譜

序列基本信息見表3，三個(gè)序列按序列平均大小排列為trnL-F>psbA-trnH>ITS2，其中，ITS2和trnL-F序列大小較為穩(wěn)定，ITS2的GC含量存在較大的變異范圍，兩個(gè)葉綠體序列的GC含量較為穩(wěn)定。ITS2的平均GC含量最大，為57.65%，而psbA-trnH最低，為28.51%。在psbA-trnH序列中，所有材料都存在一段長(zhǎng)短不一的poly-T結(jié)構(gòu)，共有8個(gè)材料在此結(jié)構(gòu)后與其余92個(gè)材料的序列同源性較低，有大量堿基無法對(duì)齊，不僅包括電泳結(jié)果中pbsA-trnH序列較長(zhǎng)的5個(gè)材料外，還包括3個(gè)輪葉金雞菊的園藝品種，但后三者部分序列片段丟失。在后續(xù)分析中修剪掉無法對(duì)齊的堿基做后續(xù)分析，ITS2在突變總數(shù)(Eta)、變異位點(diǎn)(V)、單一突變位點(diǎn)(S)等8個(gè)指標(biāo)上遠(yuǎn)大于兩個(gè)葉綠體序列，變異最為豐富，但在單倍型多樣性方差(Vh)和單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)上低于二者。trnL-F在突變總數(shù)(Eta)、變異位點(diǎn)(V)、單一突變位點(diǎn)(S)上雖略大于psbA-trnH，但在簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)(Pi)、核苷酸多樣性(π)等指標(biāo)上更低。

表3 供試金雞菊的ITS,psbA-trnH和trnL-F序列分析

2.2.2基于psbA-trnH及trnL-F序列的母系溯源 將psbA-trnH和trnL-F兩段序列進(jìn)行拼接，合并后的序列在多樣性分析中共定義了9個(gè)單倍型(表1，表3，表4，圖4)，其中由野外引種長(zhǎng)期篩選栽培的種質(zhì)在單倍型上能夠完成部分種一級(jí)或組一級(jí)的劃分：異果組的沙漠金雞菊屬于HA9型；輪葉組的種質(zhì)屬于HA5型；兩色組種質(zhì)中，兩色金雞菊及其品種屬于HA2型，萊氏金雞菊屬于HA8型。金雞菊組的種質(zhì)分布在HA1，HA3，HA4和HA6型中：皇冠金雞菊為HA6型；金鬃金雞菊、劍葉金雞菊為HA1型；大花金雞菊、耳葉金雞菊‘金色精靈’和短毛金雞菊‘陽光超人’為HA3型，但短毛金雞菊‘虹光’和歧序組的玫紅金雞菊同為HA7型。大花金雞菊和劍葉金雞菊的單倍型有區(qū)別，在園藝品種上也存在一定差異，大花金雞菊‘和諧’和大花金雞菊‘旭日’與劍葉金雞菊同為HA1型，而劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’、‘索拉納金杯’和其余大花金雞菊品種單獨(dú)成HA4型。剩余的種質(zhì)僅分布在HA2型和HA7型中，除2個(gè)不可思議系列的種質(zhì)屬于籽播系品種，其余全部為無性系品種，與兩色金雞菊及玫紅金雞菊具有較強(qiáng)的母系遺傳關(guān)系。

表4 基于psbA-trnH和trnL-F序列的9個(gè)金雞菊單倍型類型及差異位點(diǎn)

以紅花大麗花(psbA-trnH：AY215528；trnL-F：MT214749，圖中為101)為外類群構(gòu)建的MP(Maximum Parsimony)系統(tǒng)發(fā)育樹，將一些單位型進(jìn)行了整合(圖4，圖5)。MP系統(tǒng)發(fā)育樹顯示大多無性系的品種與兩色組和歧序組有較強(qiáng)的母系遺傳關(guān)系，在組一級(jí)上的母系溯源更加明確。Ⅲ類和Ⅵ類之間存在7～9個(gè)堿基的差異，而母系與金雞菊組相關(guān)的Ⅳ類和Ⅴ類之間存在7～8個(gè)堿基的差異，可見金雞菊組相關(guān)的栽培金雞菊母系變異更為豐富。輪葉組(Ⅰ類)和異果組(Ⅱ類)的8個(gè)材料較早獨(dú)立于其它4類，它們也是測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)psbA-trnH序列poly-T結(jié)構(gòu)后同源性較低的8個(gè)材料。綜合單倍型網(wǎng)絡(luò)圖和MP系統(tǒng)發(fā)育樹來看，異果組的沙漠金雞菊與其余栽培金雞菊的遺傳距離和親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其次為輪葉組的大葉金雞菊、掌葉金雞菊、三葉金雞菊和輪葉金雞菊(包括園藝品種)。舌狀花主花色為紅色、橙色、粉色、紫色、白色和淺黃色的種質(zhì)在母系溯源中全部與兩色組與歧序組有關(guān)。通常被當(dāng)做輪葉金雞菊和玫紅金雞菊雜交得來的Uri Dream系列、‘中央舞臺(tái)’、‘精彩表演’等園藝品種的母系為兩色組，但舌狀花不具兩色金雞菊的花眼。通常被當(dāng)做輪葉金雞菊品種的‘月光’，‘焦糖布丁’和‘甜蜜果醬’母系全部為歧序組，涉及到遠(yuǎn)緣雜交。

圖4 栽培金雞菊在葉綠體基因psbA-trnH+trnL-F(A)，核基因ITS2(B)上的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖及相關(guān)種質(zhì)的頭狀花形態(tài)

圖5 基于psbA-trnH和trnL-F序列分析的100個(gè)金雞菊種質(zhì)資源的MP系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3基于ITS2序列的聚類分析 100個(gè)ITS2序列中共出現(xiàn)63個(gè)單倍型(表1，表3，圖4)，大多單倍型僅包括1個(gè)品種，一些在ISSR標(biāo)記和葉綠體標(biāo)記中較難區(qū)分的種質(zhì)得到了分型，如‘焦糖布丁’、‘甜蜜果醬’、Lemonade系列和Pie系列等，有部分品種共享1個(gè)單倍型，如輪葉金雞菊‘黃金雨’和輪葉金雞菊‘大花’同為HB19，‘美國(guó)夢(mèng)’和‘天堂之門’同為HB29，‘日落夢(mèng)想’和‘粉色夢(mèng)想’同為HB48等，可能為同一種質(zhì)或發(fā)生突變的種質(zhì)。部分源于同一雜交組合的品種得到了區(qū)分，如‘秋之詩(shī)韻’和‘雪莓’，但無法區(qū)分‘中央舞臺(tái)’和‘精彩表演’。除大花金雞菊‘疊日’和大花金雞菊‘歡歌’外，其它源于美國(guó)的大花金雞菊品種均為HB1型，未能得到區(qū)分，而除大花金雞菊‘太陽之子’外，所有源于德國(guó)的大花金雞菊品種均能通過單倍型分析得到區(qū)分。

通過K2P模型計(jì)算ITS2序列的遺傳距離介于0～0.553 3之間，平均遺傳距離為0.080，有122個(gè)組合的遺傳距離為0，最大的為沙漠金雞菊和‘雪莓’。以紅花大麗花(ITS2：AY561279；圖中為101)為外類群構(gòu)建NJ(Neighbor-Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，100個(gè)金雞菊種質(zhì)可劃分為5類：異果組的沙漠金雞菊最早獨(dú)立為第Ⅰ類，與ISSR和葉綠體母系溯源的結(jié)果一致；第Ⅲ類包括‘秋之詩(shī)韻’、‘雪莓’、‘蔓越莓沙冰’以及Hardy Jewel系列中的‘紅寶石霜’和‘黃水晶’。第Ⅴ類的44個(gè)種質(zhì)主要與金雞菊組有關(guān)，包括所有金雞菊組的種質(zhì)‘焦糖布丁’、‘甜蜜果醬’以及除Ⅲ類外所有金雞菊組遠(yuǎn)緣雜交的品種。第Ⅱ類主要與兩色組與歧序組有關(guān)，包括兩色金雞菊、萊氏金雞菊、玫紅金雞菊、‘甜夢(mèng)’、‘天堂之門’、‘月光’、‘精彩表演’、‘中央舞臺(tái)’等36個(gè)種質(zhì)；第Ⅳ類包括所有輪葉組的種質(zhì)、還有Pie系列中的‘菠蘿派’和‘櫻桃派’、Satin and Lace系列等14個(gè)種質(zhì)。結(jié)合圖4和圖6可知，第Ⅱ類、Ⅳ類和Ⅴ類中相鄰的單倍型大多僅有1～3個(gè)堿基的差異，‘焦糖布丁’(HB53)和‘甜蜜果醬’(HB54)不僅未與輪葉組劃為一組，也未與母系的歧序組劃為一組，而是由某一假設(shè)的(或未取到樣)與金雞菊組相關(guān)緊密的單倍型突變5～6個(gè)堿基得來，此外，此單倍型也經(jīng)過較為復(fù)雜的突變形成了HB34，HB36，HB57，HB58和HB59，這5個(gè)單倍型單獨(dú)聚為Ⅲ類，其頭狀花形態(tài)雖與Ⅴ類較為接近，但在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中較Ⅳ類更早地獨(dú)立出Ⅴ類，存在更遠(yuǎn)的遺傳距離和親緣關(guān)系。

圖6 基于ITS2序列分析的100個(gè)金雞菊種質(zhì)資源的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

前人的研究表明，金雞菊屬植物大多自交不親和[5-6,46-47]，高異交率是金雞菊產(chǎn)生高遺傳多樣性的主要原因[23,48]，野生金雞菊的遺傳多樣性主要集中在種群內(nèi)部，而種群間的較少[26-28]。栽培植物在馴化過程中使用的原生種個(gè)體通常有限，人們對(duì)良種的選擇、長(zhǎng)期的無性繁殖等，均會(huì)導(dǎo)致栽培植物的遺傳多樣性降低[43,49]。栽培金雞菊具有復(fù)雜的遺傳背景，在形態(tài)學(xué)(未發(fā)表)和細(xì)胞學(xué)[2]上也具有較高的遺傳多樣性，但基于ISSR的分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，100個(gè)栽培金雞菊種質(zhì)的平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.288 6，而前人報(bào)道同屬的兩色金雞菊栽培種質(zhì)為0.149 8[32]，均低于牡丹(Paeoniasuffruticosa)0.308 5[50]、矮牽牛(Petuniahybrida)0.374 4[51]、萱草(Hemerocallishybrids)0.455 7[52]等常見觀賞花卉，這可能與其籽播系種質(zhì)來源較為單一，且一些無性系品種的雜交路線趨同有關(guān)，但也可能是分子標(biāo)記類型、所選引物或統(tǒng)計(jì)方法不同等導(dǎo)致的。

在研究被子植物系統(tǒng)發(fā)育時(shí)，由于譜系不完全分選和葉綠體捕獲，母系遺傳的葉綠體基因并不總是與核基因的系統(tǒng)發(fā)育相對(duì)應(yīng)，后者發(fā)生在葉綠體基因的定向基因流下，而前者是一個(gè)隨機(jī)的過程[53-55]。群體之間通過雜交和反復(fù)回交，部分基因會(huì)在不同親本中交換發(fā)生基因漸滲，而原生葉綠體基因組很容易被外來葉綠體基因組所取代發(fā)生葉綠體捕獲，此類種間雜交后代的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)通常來自不同的物種[56]。本研究發(fā)現(xiàn)，基于葉綠體基因psbA-trnH和trnL-F的系統(tǒng)發(fā)育樹與基于核基因ITS2的系統(tǒng)發(fā)育樹存在較大分歧，舌狀花主花色為紅色、橙色、粉色、紫色、白色和淺黃色的種質(zhì)在母系溯源中全部與兩色組與歧序組有關(guān)，而在ITS2的系統(tǒng)發(fā)育樹和ISSR聚類中，此類種質(zhì)部分與輪葉組和金雞菊組有著更近的親緣關(guān)系，可能是在雜交和回交過程中發(fā)生了葉綠體捕獲。在ITS2系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)，‘黃水晶’、‘紅寶石霜’、‘秋之詩(shī)韻’、‘雪莓’和‘蔓越莓沙冰’這五個(gè)材料從Ⅴ類中獨(dú)立成Ⅲ類，它們所對(duì)應(yīng)的HB34,HB36Z,HB57,HB58和HB59單倍型彼此之間具有較大的堿基差異，結(jié)合母系溯源和已發(fā)表的品種專利來看[10-11,57-60]，這五個(gè)品種都是以金雞菊組為父本，兩色組為母系的種質(zhì)。通常被認(rèn)為是輪葉金雞菊的‘焦糖布丁’和‘甜蜜果醬’[61-62]歸為Ⅴ類，其親本包含金雞菊組，二者所對(duì)應(yīng)的HB53和HB54單倍型與相鄰單倍型之間有5～6個(gè)堿基差異，而其余相鄰單倍型之間僅有1～3個(gè)堿基差異，這可能是由于二者引入了輪葉組的基因。ITS2中的Ⅲ類和Ⅴ類種質(zhì)的育種目標(biāo)多為培育大花型和色彩豐富的多年生金雞菊品種，它們通過引入兩色組和歧序組改良花色，在此基礎(chǔ)上與金雞菊組雜交，因此整體上與金雞菊組的親緣關(guān)系更近，它們?cè)诨ú啃誀钌弦哺蛴诮痣u菊組，但也有部分性狀介于Ⅴ類和Ⅱ類之間，如頭狀花直徑大小連續(xù)、花盤上可同時(shí)出現(xiàn)4裂和5裂的管狀花(金雞菊組和輪葉組為5裂，兩色組和歧序組為4裂)等，這些性狀可能為雙親遺傳。

三種標(biāo)記均一致顯示沙漠金雞菊與其它栽培金雞菊種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，部分學(xué)者通過形態(tài)學(xué)和分子證據(jù)也認(rèn)為沙漠金雞菊和木本金雞菊(C.gigantea)等與其余金雞菊屬植物相比親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可劃分為L(zhǎng)eptosyne屬[63]，結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果，沙漠金雞菊可作為一個(gè)栽培金雞菊分類的外類群。ITS2序列和ISSR標(biāo)記在對(duì)栽培金雞菊的劃分也有所差異，與EST-SSR標(biāo)記[30]的結(jié)果相比也存在不同。ISSR標(biāo)記顯示，歧序組、兩色組、‘月光’和所有輪葉金雞菊雜交品種劃為一類，ITS2將其中一部分輪葉金雞菊雜交品種與輪葉組劃為一類，而EST-SSR標(biāo)記將‘月光’、輪葉金雞菊和輪葉金雞菊雜交品種聚一類，最后才與其他輪葉組種質(zhì)聚為一類。Pie系列三個(gè)品種在ISSR標(biāo)記中與兩色組和歧序組聚為一類，和EST-SSR結(jié)果相同[30]，但‘菠蘿派’和‘櫻桃派’在ITS2標(biāo)記中與輪葉組聚為一類，推測(cè)它們的親本‘Little Penny’(‘RP1’)和‘Rum Punch’由輪葉組、兩色組和歧序組的種質(zhì)共同參與了雜交[9,64-65]。

葉綠體標(biāo)記可為一些具有特殊花色的類群在母系溯源上提供有力證據(jù)[66]。舌狀花是栽培金雞菊的主要觀賞部位，豐富的舌狀花主花色是栽培金雞菊遠(yuǎn)緣雜交育種所期望的目標(biāo)性狀之一，在葉綠體溯源研究中發(fā)現(xiàn)，兩色組和歧序組是栽培金雞菊重要的母系材料，與二者相關(guān)的種質(zhì)占整體的66%，具有特殊舌狀花主花色的種質(zhì)在母系溯源中全部與兩色組與歧序組相關(guān)，本研究也首次通過分子手段證明了‘月光’和短毛金雞菊‘虹光’為遠(yuǎn)緣雜交品種，其母系為歧序組，支持了Coombs的推測(cè)[1]。孫浩男等[2]發(fā)現(xiàn)，栽培金雞菊中可能存在大量非整倍體和異源多倍體，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以x=12，13，14呈整數(shù)倍疊加的非整倍體和異源多倍體品種在母系溯源中主要與兩色組相關(guān)，這些品種可能也包括歧序組基因，但歧序組不為母系，而不以整數(shù)倍疊加的非整倍體品種母系全部為歧序組，這可能與單倍型HA7的‘甜夢(mèng)’與‘天堂之門’參與雜交有關(guān)[2]。

本次試驗(yàn)還欠缺個(gè)別表現(xiàn)優(yōu)異，但目前并未在商業(yè)上得到大面積推廣的種質(zhì)，如沼生金雞菊(C.palustris)、長(zhǎng)葉金雞菊(C.gladiata)及全緣葉金雞菊(C.integrifolia)等[1]，它們大多源于歧序組，但鮮有用于雜交育種的報(bào)道，目前已有報(bào)道確認(rèn)的栽培金雞菊育種親本僅有10余種[1-2,30,67]，整體上看，金雞菊屬內(nèi)還有相當(dāng)一部分物種有待開發(fā)，有關(guān)栽培金雞菊舌狀花花色、頭狀花類型等遺傳規(guī)律也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

三種分子標(biāo)記均顯示栽培金雞菊具有一定的遺傳多樣性，沙漠金雞菊與常見的栽培金雞菊種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究篩選出了12條適用于栽培金雞菊的ISSR引物，在遺傳距離為0.664時(shí)可將整體分為4類。栽培金雞菊ITS2，psbA-trnH和trnL-F序列大小分別為171～175 bp，252～426 bp和698～703 bp，ITS2和trnL-F序列長(zhǎng)度較為穩(wěn)定，ITS2序列較psbA-trnH和trnL-F序列具有更豐富的變異。葉綠體基因psbA-trnH和trnL-F母系溯源顯示，兩色組及歧序組是栽培金雞菊重要的母系資源，有66%的種質(zhì)與兩者相關(guān)，序列合并后定義了9個(gè)單倍型，HA2和HA7單倍型的種質(zhì)適宜作為母系培育具有特殊舌狀花花色的新品種，同時(shí)，本研究首次從分子角度確認(rèn)了‘月光’及短毛金雞菊‘虹光’等為歧序組的遠(yuǎn)緣雜交品種。ITS2序列可將整體分為5類，共定義了63個(gè)單倍型，ITS2有望作為栽培金雞菊品種鑒定的DNA條形碼。本研究為栽培金雞菊在分類鑒定、親本溯源、雜交育種及指紋圖譜的構(gòu)建等方面提供了有力的分子證據(jù)。