魏玥杉,叢敬
(1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2018級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè),遼寧 沈陽(yáng)110034;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室)
在腎臟生理中,腎單位的上皮細(xì)胞在水和溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及維持穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。跨上皮物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)可以通過(guò)跨細(xì)胞和細(xì)胞旁路途徑來(lái)實(shí)現(xiàn),而細(xì)胞旁路的通透性與緊密連接(tight junction,TJ)密切相關(guān)[1]。TJ是位于上皮細(xì)胞側(cè)面最頂端的細(xì)胞連接,由跨膜蛋白、胞質(zhì)支架蛋白和信號(hào)蛋白構(gòu)成??缒さ鞍滓蚱浼?xì)胞外結(jié)構(gòu)域伸入到細(xì)胞間,進(jìn)而影響細(xì)胞旁路溶質(zhì)運(yùn)動(dòng),成為決定細(xì)胞旁路通透性的關(guān)鍵因素,其中Claudins是TJ中最豐富的跨膜蛋白[1]。本文就Claudins的結(jié)構(gòu)及其生理功能的研究進(jìn)展及其在健康和腎臟疾病中的作用進(jìn)行綜述。
Claudins的分子量為22~25 kDa,有26個(gè)(人類)或27個(gè)(嚙齒類)亞型[2],特異性地表達(dá)在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中。Claudins 1-10,-14,-15,-17和-19共享序列同源性且功能相似,常常被稱為經(jīng)典Claudins[3]。Claudins由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、2個(gè)胞外環(huán)(ECL1和ECL2)、位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)的-N末端和-C末端以及一個(gè)短的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)折組成[4]。在同一細(xì)胞Claudins彼此相互作用形成順式二聚體,或更高的寡聚狀態(tài),然后相鄰細(xì)胞的Claudins之間反式配對(duì)延伸,以此將Claudin寡聚體組裝成TJ鏈。冷凍蝕刻及電子顯微鏡技術(shù)顯示,TJ鏈呈線樣或條索狀,彼此連接吻合成迷路樣的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)[5]。
2.1 Claudins的屏障功能 Claudin-1在腎小囊壁層上皮細(xì)胞(parietal epithelial cells,PECs)的TJ中表達(dá),PECs被認(rèn)為可以限制經(jīng)血管球過(guò)濾后的蛋白質(zhì)逃逸到腎小體周圍空間。PECs間的TJ與細(xì)胞底部的基膜一起成為尿液濾過(guò)的第二道屏障[6]。Ohse等[7]在實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)腎小球腎炎后,發(fā)現(xiàn)TJ蛋白Claudin-1、ZO-1和Occludin表達(dá)水平降低,相鄰PECs間對(duì)與白蛋白大小相似的示蹤劑的通透性增加。
幾個(gè)過(guò)表達(dá)研究將Claudin-1、-3、-5、-11、-14和-19劃分為屏障型Claudins[8-10]。但這類研究的解釋很復(fù)雜,與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同,Claudins在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)發(fā)揮屏障和孔道的作用,且所有的上皮細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)了多個(gè)內(nèi)源性的Claudins,外源性表達(dá)(或被敲除)的Claudins的功能必須疊加在這個(gè)背景上。因此,Claudins的表觀功能高度依賴于宿主細(xì)胞系的特性。
2.2 Claudins的轉(zhuǎn)運(yùn)功能 Claudins可以選擇性地增加細(xì)胞旁路的陽(yáng)離子或陰離子的通透率。相關(guān)研究已經(jīng)建立了Claudins形成的細(xì)胞旁路通道的模型,這是一類直徑為4~7?的新通道,定向垂直于組織平面,連接細(xì)胞頂?shù)變蓚?cè)區(qū)室[11]。每一段腎小管節(jié)段都相應(yīng)地表達(dá)特定的Claudins,這些Claudins賦予該節(jié)段獨(dú)特的細(xì)胞旁路通透性和選擇特性。研究表明,Claudin-4、-5、-8、-11和-14選擇性地降低陽(yáng)離子的通透性,特別是對(duì)Na+、K+、H+和NH4+的通透性[12-13],而Claudin-2和-15則增加陽(yáng)離子的通透性[14]。
Claudin-2主要表達(dá)于近端小管,也被報(bào)道在PECs中表達(dá)[15],對(duì)于近端小管中有效的Na+和水的重吸收以及血壓調(diào)節(jié)至關(guān)重要。Claudin-2介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)占近端小管重吸收總水量的23%~30%[16]。claudin-2基因敲除小鼠(gene knockout,KO)模型顯示,小鼠近端小管S2段的Na+、Cl-和水的跨上皮凈吸收明顯減少[17]。與野生型相比,正常飲食喂養(yǎng)的基因敲除小鼠(Cldn2-/-)體內(nèi)保持著正常的Na+穩(wěn)態(tài),但在靜脈注射2%NaCl后Na+、Cl-的排泄量增加,這表明,在靜息狀態(tài)下,腎臟可以代償Claudin-2介導(dǎo)的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的損失,但在應(yīng)激狀態(tài)下,這種能力是不足的[17]。Pei等[18]從維持腎臟能量效率方面探討了Claudin-2的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)作用,他們認(rèn)為細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)是上皮組織進(jìn)化的一種策略,以最大限度地提高能量效率,近端小管中細(xì)胞旁路鹽重吸收的減少可能導(dǎo)致下游小管跨細(xì)胞鹽重吸收的增加,氧消耗增加,這種額外的能量消耗會(huì)在缺血情況下引起腎小管損傷。除了Claudin-2,近端小管還可以表達(dá)Claudin-17,介導(dǎo)近端小管末段中Cl-的轉(zhuǎn)運(yùn),在該節(jié)段Cl-的重吸收主要是由其濃度梯度驅(qū)動(dòng),經(jīng)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。
髓袢升支粗段(thick ascending limb,TAL)通過(guò)跨細(xì)胞途徑主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和Cl-,經(jīng)細(xì)胞旁路選擇性重吸收Mg2+和Ca2+,可見Claudin-3、-10、-11、-14、-16和-19表達(dá)。Claudin-10b、-14、-16、-19主要負(fù)責(zé)陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和選擇,Claudin-3則發(fā)揮屏障作用[20]。離體灌流Claudin-16-KO小鼠的TAL,TJ對(duì)包括Ca2+和Mg2+在內(nèi)的二價(jià)陽(yáng)離子選擇性嚴(yán)重受損[21]。Claudin-16和Claudin-19在極化上皮細(xì)胞中的共表達(dá)可賦予TJ顯著的陽(yáng)離子選擇性[22]?;蛲蛔儗?dǎo)致Claudin-16和Claudin-19功能喪失是家族性低鎂血癥伴高鈣尿癥和腎鈣質(zhì)沉著癥(FHHNC)的病因[23]。更為重要的是,Claudin-16和Claudin-19相互物理性作用,TJ中失去其中一個(gè)會(huì)導(dǎo)致另一個(gè)被內(nèi)吞[24]。
Claudin-4和-8是參與構(gòu)成Cl-細(xì)胞旁路的主要TJ蛋白。Claudin-4-KO小鼠顯示,尿液NaCl排泄顯著增加,動(dòng)物出現(xiàn)了低氯血癥和低血壓,這與全身細(xì)胞外液體量的減少一致[25]。Claudin-8-KO小鼠不僅在許多方面與Claudin-4-KO小鼠相似,比如鹽和液體量的腎丟失,還出現(xiàn)了更嚴(yán)重的低血壓[26]。這可能與這兩個(gè)分子之間的相互作用有關(guān),有研究證實(shí)它們其中一個(gè)的缺失會(huì)影響另一個(gè)在TJ的定位[27]。Claudin-7也在對(duì)醛固酮敏感的遠(yuǎn)端腎單位節(jié)段表達(dá),但很難斷定表達(dá)Claudin-7是否直接參與Cl-細(xì)胞旁路途徑,因?yàn)樵贚LC-PK1細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)和敲除表達(dá)claudin-7都會(huì)導(dǎo)致Cl-通透性降低[28]。
2.3 Claudins參與腎單位的發(fā)生發(fā)育 Claudin-1從腎單位發(fā)育的S小體期開始在PECs和腎小體內(nèi)的足細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá),卻僅在成熟PECs中持續(xù)存在[7]。足細(xì)胞緊貼于腎小球毛細(xì)血管的外表面,其次級(jí)突起間的裂孔膜(SD)參與構(gòu)成濾過(guò)屏障,是形成原尿的重要結(jié)構(gòu)。在腎單位發(fā)育的逗號(hào)小體和S小體期,足細(xì)胞可能借頂端的TJ相連;隨后進(jìn)入毛細(xì)血管襻期,足細(xì)胞開始建立其特征性的復(fù)雜結(jié)構(gòu),細(xì)胞連接處重新定位,TJ轉(zhuǎn)變?yōu)镾D。盡管二者轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不完全清楚,形態(tài)也截然不同,但SD和TJ對(duì)于離子的高度選擇性濾過(guò)卻極為相似[29],它們都參與了對(duì)頂?shù)讟O化、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和去分化的調(diào)控[30]。Gong等[31]使用claudin-1轉(zhuǎn)基因小鼠模型,在成熟足細(xì)胞中誘導(dǎo)claudin-1基因的表達(dá),引發(fā)嚴(yán)重的蛋白尿;通過(guò)冷凍蝕刻電子顯微鏡技術(shù),發(fā)現(xiàn)SD向TJ轉(zhuǎn)變的超微結(jié)構(gòu)變化,證實(shí)Claudins和TJ在足細(xì)胞病理生理中具有重要作用,Claudins與SD組分的相互作用可能促進(jìn)SD向TJ轉(zhuǎn)變,并提出SD和TJ在發(fā)育和病理?xiàng)l件下可以互換的新概念。
3.1 Claudin-10b與HELIX綜合征 人claudin-10基因位于染色體13q31-q34上,包含5個(gè)外顯子。在第1外顯子中有2個(gè)claudin-10剪接變異體,編碼2個(gè)主要Claudin-10亞型Claudin-10a和Claudin-10b[32]。2017年,三個(gè)獨(dú)立的研究小組描述了claudin-10基因雙等位基因突變的臨床表現(xiàn),首字母縮略詞HELIX(多汗癥、電解質(zhì)紊亂、淚液過(guò)少、魚鱗病、口干癥)被用來(lái)命名這種綜合征[32-34]。所有的HELIX綜合征患者都有汗腺、唾液腺和淚腺的功能缺陷;大多數(shù)患者有血電解質(zhì)異常、高鎂血癥和(或)低鉀血癥;25%的患者有3期慢性腎病,無(wú)腎鈣質(zhì)沉著癥。TAL中claudin-10b缺失的小鼠表現(xiàn)出明顯的高鎂血癥,尿液中Mg2+的排泄分?jǐn)?shù)較低,輕度高磷血癥,輕度多尿,飲水不足時(shí)無(wú)法濃縮尿液,K+排泄分?jǐn)?shù)升高和髓質(zhì)腎鈣質(zhì)沉著癥,同時(shí)腎小球?yàn)V過(guò)率無(wú)明顯受損[35]。而敲除claudin-10b會(huì)導(dǎo)致髓質(zhì)TAL和腎鈣化病中Claudin-16和Claudin-19復(fù)合物的表達(dá)增加,即除多尿和K+排泄分?jǐn)?shù)升高之外,claudin-10b缺失引發(fā)的大多數(shù)癥狀可以通過(guò)同時(shí)敲除claudin-16得到糾正[36]?;蚯贸龑?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Claudin-10b特異性增加細(xì)胞旁路對(duì)Na+的通透性。實(shí)際上,TAL、汗腺和唾液腺中Na+的細(xì)胞旁路通透性較低可能是claudin-10b突變功能喪失的主要臨床后果。在腎髓質(zhì)TAL中,50%的Na+經(jīng)細(xì)胞旁路被動(dòng)地重吸收,Na+的細(xì)胞旁路通透性下降會(huì)影響Na+的重吸收,導(dǎo)致Na+的腎丟失,細(xì)胞外液體耗竭,繼發(fā)性醛固酮增多和K+的腎丟失;較高的跨上皮電壓會(huì)提高M(jìn)g2+和Ca2+在TAL的細(xì)胞旁路重吸收[36-37]。在唾液腺和汗腺導(dǎo)管中,Cl-經(jīng)跨細(xì)胞途徑分泌,Na+沿細(xì)胞旁路途徑被動(dòng)分泌,Claudin-10b功能缺失突變可減少Na+的分泌以及唾液和汗液的形成[20]。
3.2 Claudin-16和Claudin-19與FHHNC 人類claudin-16基因位于染色體3q27上,包含5個(gè)外顯子。人類claudin-19基因位于染色體1p34.2上,也包含5個(gè)外顯子。家族性低鎂血癥伴高鈣尿癥和腎鈣質(zhì)沉著癥(FHHNC)是一種由claudin-16和claudin-19基因變異引起的常染色體隱性遺傳疾病,其特征是尿中鈣和鎂的大量流失,導(dǎo)致低鎂血癥和高鈣尿[23]?;颊哂心I鈣質(zhì)沉著癥(腎實(shí)質(zhì)內(nèi)鈣基晶體沉積)和腎功能衰竭,可能在其生命早期就發(fā)展為終末期腎?。?3]。值得注意的是,低鎂血癥也可以不出現(xiàn)[38]。此外,患者也可能患有反復(fù)尿路感染、多尿、多飲和腎結(jié)石。
Claudin-16和Claudin-19只表達(dá)在TAL,對(duì)于Ca2+和Mg2+在TAL的細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)起關(guān)鍵作用[39]。TAL能夠重吸收腎小管腔內(nèi)液體中25%~40%的Na+、50%~60%的Mg2+和30%~35%的Ca2+[40],這種重吸收由跨上皮鹽濃度梯度產(chǎn)生的管腔正電壓驅(qū)動(dòng)[22]。Claudin-16在低阻力的LLC-PK1細(xì)胞中獨(dú)立表達(dá)時(shí)可以使細(xì)胞旁Na+通透性大幅增加,Mg2+的通透性適度增加,進(jìn)而使選擇性從陰離子選擇性轉(zhuǎn)變?yōu)檩p微的陽(yáng)離子選擇性;Claudin-19在該細(xì)胞系中的表達(dá)也消除了陰離子選擇性,但在這種情況下是通過(guò)降低Cl-的通透性來(lái)實(shí)現(xiàn)的;Claudin-16和Claudin-19的共同表達(dá)導(dǎo)致Na+和Cl-通透性的變化比它們各自單獨(dú)表達(dá)的水平更為顯著,因此表明這兩種Claudins之間存在功能協(xié)同作用[22]。利用蔗糖梯度沉淀和化學(xué)交聯(lián)反應(yīng),Gong等[22]從轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞和Sf9細(xì)胞中分離出穩(wěn)定的由Claudin-16和Claudin-19組成的二聚體。當(dāng)將突變引入Claudin-16和Claudin-19二聚體的任一Claudin中時(shí),所產(chǎn)生的TJ明顯喪失其陽(yáng)離子通透性,表明Claudins相互作用在FHHNC發(fā)病中的作用機(jī)制[21]。與此假設(shè)相符,在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中,claudin-16的缺失可導(dǎo)致Claudin-19從TJ處脫位,反之亦然[41]。采用RNA干擾技術(shù)分別建立了claudin-16-KO、claudin-19-KO小鼠模型則表現(xiàn)出與FHHNC相似的表型,即低鎂血癥和尿鈣排泄增加,但沒(méi)有腎鈣質(zhì)沉著和明顯的腎功能不全[41]。在體外微灌注claudin-16-KO小鼠的TAL,可見Mg2+和Ca2+通透性顯著降低,但陽(yáng)離子選擇性沒(méi)有改變,且由于小鼠血壓降低,血漿醛固酮濃度升高,NaCl的吸收可能因此受到損害[42]。Claudin-19-KO小鼠的腎臟異常和電解質(zhì)失衡尚無(wú)進(jìn)一步報(bào)道。由于Claudin-16和Claudin-19之間的相互作用,預(yù)期Claudin-19也會(huì)在claudin-16-KO小鼠的TAL中表達(dá)缺失,但Claudin-19的表達(dá)不受影響[21]。
3.3 Claudin-14與高鈣尿性腎結(jié)石 人類claudin-14基因位于染色體21q22.3上,編碼由239個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)Claudin-14。在腎臟遺傳性疾病中,并未發(fā)現(xiàn)claudin-14基因的變異體。然而,全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí)claudin-14是高鈣尿性腎結(jié)石(hypercalciuric nephrolithiasis)發(fā)病的主要危險(xiǎn)基因[43]。根據(jù)全基因組標(biāo)準(zhǔn),claudin-14基因位點(diǎn)上的同義突變與腎結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)增加和骨密度降低相關(guān)。常見的同義變異rs219780(C)純合子患者腎結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)計(jì)是非攜帶者的1.64倍;rs219780(C)變異也與尿Ca2+升高、血清甲狀旁腺激素和血清總CO2減少顯著相關(guān),但與血清Ca2+水平無(wú)關(guān)[44]。claudin-14編碼突變的患者可伴有耳聾,這種表型能在claudin-14缺失小鼠中被復(fù)制[45]。
原尿中20%~25%的Ca2+在TAL通過(guò)Claudins-16和-19組成的細(xì)胞旁路被重吸收[46]。Claudin-14主要表達(dá)在TAL,可能作為TAL中二價(jià)陽(yáng)離子通透阻滯劑而發(fā)揮作用[21]。Claudin-14在各種細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)可降低Na+/Cl-的通透比率以及對(duì)Ca2+的通透性,如在轉(zhuǎn)染的LLC-PK1細(xì)胞中,Claudin-14通過(guò)物理作用,可降低Claudin-16的胞外陽(yáng)離子通透性[47]。另一方面,高鈣飲食可提高Claudin-14表達(dá),其調(diào)節(jié)高度依賴于Ca2+敏感受體(Ca2+-sensing receptor,CaSR)活性的改變。實(shí)際上,任何血清Ca2+濃度的升高或使用擬鈣劑改變CaSR敏感性,都會(huì)大大增加Claudin-14的表達(dá)[48]。高鈣血癥引起的Claudin-14的表達(dá)增加可能會(huì)阻止Ca2+的細(xì)胞旁路通透,從而增加Ca2+的尿液排泄,以穩(wěn)定血清Ca2+水平[49]。
在不斷的研究和探索中,人們對(duì)腎臟中的Claudins的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及其在腎臟生理、病理中的作用已有了較深入的認(rèn)識(shí)。但仍有較多的問(wèn)題亟待解決,如對(duì)Claudins功能和表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍不明確,而對(duì)于調(diào)控機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)有可能為離子代謝疾病的治療提供新思路。此外,Claudins在腎臟腫瘤中的作用還有待進(jìn)一步探討。
沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2022年1期