胡陶,王明亮,王武帥,何瀅蓉,楊曦,孫雄山,王強(qiáng)△
(1西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,四川 瀘州 646000;2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科,四川 成都 610083;3西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610031)
根據(jù)《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2021》,冠心病的發(fā)病率和死亡率逐年增高,隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)的廣泛開展,冠心病的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,然而PCI術(shù)后較為常見的并發(fā)癥造影劑相關(guān)急性腎損傷(contrast-associated acute kidney injury,CA-AKI)的發(fā)病率一直居高不下,尤其在糖尿病合并冠心病的患者中高發(fā),嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后[1]。恩格列凈(empagliflozin,EMPA)屬于鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2抑 制 劑(sodium-glucose cotransporter-2 inhibitor,SGLT-2i),通過(guò)抑制腎臟對(duì)葡萄糖的重吸收,使過(guò)量的葡萄糖從尿液中排出,從而發(fā)揮降糖作用。最新一系列研究證實(shí),恩格列凈除降低血糖外,還具有心血管保護(hù)效應(yīng),可顯著降低心力衰竭患者住院率和心血管患者死亡率等,改善了患者的預(yù)后和生存質(zhì)量[2-4]。目前恩格列凈被廣泛應(yīng)用于糖尿病和心血管疾病的治療,然而恩格列凈對(duì)造影劑相關(guān)急性腎損傷的作用尚不清楚。
本研究擬通過(guò)構(gòu)建大鼠CA-AKI模型,觀察恩格列凈對(duì)大鼠造影劑相關(guān)急性腎損傷的防治作用,并初步探討其可能的機(jī)制,旨在為糖尿病合并冠心病患者的CA-AKI防治提供實(shí)驗(yàn)參考。
SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠,雄性,6~8周齡,230~250 g,共40只,購(gòu)自于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(湘)2019-0004,所有程序均符合機(jī)構(gòu)規(guī)定,并經(jīng)中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
碘海醇、N-ω硝基-L-精氨酸甲酯購(gòu)于MedChem-Express;吲哚美辛購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;EMPA購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;TUNEL試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)試盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。
3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理將40只SPF級(jí)6~8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分配為對(duì)照(control)組、EMPA組、CA-AKI組和CA-AKI+EMPA組。所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng),條件為12/12 h明暗循環(huán),濕度為50%~60%,溫度為22~24℃,并提供食物和水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。Control組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后連續(xù)7 d予以生理鹽水(1.5 mg·kg-1·d-1)灌胃;EMPA組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后連續(xù)7 d予以恩格列凈(1.5 mg·kg-1·d-1)灌胃;CA-AKI組大鼠禁水16 h,參照前期方法[5-6]建立CA-AKI模型:首先于尾靜脈注射吲哚美辛(10 mg/kg),其次分別于吲哚美辛注射后15 min和30 min經(jīng)尾靜脈注射N-ω硝基-L-精氨酸甲酯(10 mg/kg)和碘海醇(3g I/kg);EMPA+CA-AKI組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后連續(xù)7 d予以恩格列凈(1.5 mg·kg-1·d-1)灌胃,禁水16 h后,余處理同CA-AKI組造模方式。同時(shí)予以足夠的食物及飲水喂養(yǎng),注射碘海醇后12 h進(jìn)行安樂(lè)死,經(jīng)內(nèi)眥靜脈叢采取血液及摘取雙腎臟。
3.2 腎功能檢測(cè)驗(yàn)證CA-AKI模型穩(wěn)定性經(jīng)內(nèi)眥靜脈叢收集各組血液,靜置20 min,2 464×g離心20 min,收集上層血清。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行血清肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、胱抑素C(cystatin C,Cys-C)及肌酐清除率(creatinine clearance rate,CLCR)水平檢測(cè),CAAKI定義為SCr高于基線值25%[7]。
3.3 腎臟組織HE染色4%多聚甲醛固定腎臟組織,脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟,蘇木精、伊紅染色,脫水封片,于顯微鏡下觀察各組腎臟組織病理改變情況,并進(jìn)行圖像采集。病理學(xué)變化主要包括:腎小管上皮細(xì)胞腫脹、管間出血、刷狀緣丟失、細(xì)胞質(zhì)空泡變性等。隨機(jī)選取10個(gè)髓質(zhì)部視野,根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分(0~4分)[8]:0分:無(wú)腎小管損傷;1分:受損腎小管小于20%;2分:受損腎小管為21%~50%;3分:受損腎小管>50%;4分:所有上皮細(xì)胞完全破壞。
3.4 腎臟組織TUNEL染色固定各組腎臟組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水,石蠟包埋,切片、脫蠟,于超純水中浸泡5 min;檸檬酸微波修復(fù)8 min,PBS洗3次,每次5 min;暗處配制TUNEL熒光孵育液于37℃孵育1 h,PBS洗3次,每次5 min;加DAPI染核15 min,PBS沖洗;甘油明膠封片,掃描并采集圖像,每張切片先于100倍下觀察全部組織,再于400倍視野下采集圖像,并進(jìn)行凋亡細(xì)胞分析,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。
3.5 Western blot分析取各組腎臟組織50 mg,加入1 mL裂解緩沖液,充分碾磨,并于冰上裂解30 min,將其吸入至EP管中,于4℃、12 000×g條件下離心30 min,使用蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。將各組蛋白分別加入電泳道中,通過(guò)10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì),然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5% BSA溶液封閉1 h,按照β-actin(1∶5 000)、Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)、細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-C;1∶1 000)分別稀釋Ⅰ抗孵育,4℃過(guò)夜。次日復(fù)溫30 min,TBST洗膜30 min,Ⅱ抗孵育1 h,再行TBST洗膜30 min,于發(fā)光液下顯影,Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
3.6 免疫組織化學(xué)染色石蠟包埋后切片、脫蠟至水,將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液(PH 6.0),微波爐高火加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù),放入3%雙氧水,室溫10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,滴加山羊血清封閉液封閉20 min,滴加Ⅰ抗,4℃過(guò)夜后PBS洗滌,滴加Ⅱ抗,37℃孵育30 min后再次PBS洗滌,滴加DAB顯色液,室溫顯色,然后蒸餾水洗滌切片,終止顯色。經(jīng)蘇木素復(fù)染3 min,中性樹膠封片,采集圖像,分析數(shù)據(jù)。
3.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)取適量血清標(biāo)本,按照試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)MDA含量及SOD和GSH-Px活性。使用分光光度儀分別檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm、532 nm、600 nm、560 nm、412 nm處的吸光度(A)值,并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組之間的差異通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估,多組之間通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行比較。以P<0.05為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
分別于不同時(shí)點(diǎn)(造影劑注射前及造影劑注射后6 h、12 h和24 h)檢測(cè)大鼠SCr、BUN、Cys-C和CLCR的水平。大鼠SCr、Cys-C和BUN水平在造影劑注射后逐漸升高,于造影劑注射12 h后達(dá)到高峰,后逐漸下降,CLCR在造影劑注射后逐漸下降,于造影劑注射后12 h后達(dá)到最低,后逐漸升高,見圖1。HE染色結(jié)果顯示,腎小管病理?yè)p傷程度于造影劑注射后逐漸加重,于造影劑注射12 h后病理?yè)p傷明顯,出現(xiàn)腎小囊腔擴(kuò)張,腎小球萎縮壞死,腎小管彌漫性脂肪變性、擴(kuò)張,局部間質(zhì)血管、腎小球毛細(xì)血管充血、淤血等現(xiàn)象,見圖2。
Figure 1.Effect of contrast medium on renal function in rats.The levels of SCr(A),BUN(B),Cys-C(C)and CLCR(D)before and after injected with contrast medium at different time points(0,6,12 and 24 h)in the rats.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs 0 h group.圖1 造影劑對(duì)大鼠腎臟功能的影響
與CA-AKI組比較,恩格列凈干預(yù)后,大鼠血清SCr,BUN和Cys-C水平下降(P<0.05),CLCR水平上升(P<0.01),見圖3。HE染色顯示:與CA-AKI組比較,恩格列凈干預(yù)后,腎小管病理?yè)p傷評(píng)分顯著降低(P<0.01),見圖4。
通過(guò)TUNEL染色觀察腎臟細(xì)胞凋亡情況顯示,造影劑注射引起大鼠腎臟細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.01);與CA-AKI組比較,恩格列凈干預(yù)后,大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.01),見圖5。進(jìn)一步通過(guò)Western blot和免疫組化染色檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,造影劑注射后導(dǎo)致大鼠腎臟促凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、Bax和Cyt-C)表達(dá)上調(diào)(P<0.05);而恩格列凈可顯著降低大鼠腎臟促凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、Bax和Cyt-C)的表達(dá),并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(P<0.01),見圖6、7。
Figure 2.Effect of contrast medium on renal pathological damage in rats(HE staining,scale bar=20μm).Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs 0 h group.圖2 造影劑對(duì)大鼠腎臟的病理?yè)p傷
Figure 3.Effect of empagliflozin(EMPA)on renal function in rats.The levels of SCr(A),BUN(B),Cys-C(C)and CLCR(D)with different treatments in the rats.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs CA-AKI group.圖3 恩格列凈對(duì)大鼠CA-AKI腎功能的影響
Figure 4.Effect of empagliflozin(EMPA)on contrast-induced renal pathological damage in rats(HE staining,scale bar=20μm).Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs CA-AKI group.圖4 恩格列凈對(duì)大鼠腎小管病理?yè)p傷的影響
Figure 5.Effect of empagliflozin(EMPA)on contrast-induced renal cell apoptosis in rats(TUNEL staining,scale bar=20μm).Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs CA-AKI group.圖5 TUNEL染色分析恩格列凈對(duì)大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響
Figure 6.Effects of empagliflozin(EMPA)on apoptosis-related proteins(Bax,Cyt-C,caspase-3 and Bcl-2)in kidneys detected by Western blot.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs CA-AKI group.圖6 恩格列凈對(duì)腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
通過(guò)相應(yīng)試劑盒檢測(cè)SOD、GSH-Px活性和MDA含量評(píng)估大鼠腎臟的氧化應(yīng)激情況,造影劑注射引起大鼠腎臟組織MDA水平顯著增加、SOD和GSH-Px活性降低(P<0.01);與CA-AKI組比較,恩格列凈顯著增加大鼠腎臟SOD和GSH-Px活性,并降低MDA水平(P<0.01),見圖8。
Figure 7.Immunohistochemical staining detection of renal apoptosis-related proteins(scale bar=40μm).Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs CA-AKI group.圖7 腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白的免疫組織化學(xué)染色情況
Figure 8.Effect of empagliflozin(EMPA)on renal oxidative stress in rats.The SOD activity(A),GSH-Px activity(B)and MDA content(C)with different treatments in the rats.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs CA-AKI group.圖8 恩格列凈對(duì)大鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響
隨著心血管介入技術(shù)的普及和介入手術(shù)量的日益增多,CA-AKI成為臨床常見問(wèn)題,發(fā)生于診斷和介入程序中血管內(nèi)注射造影劑后,研究顯示,在PCI治療患者中CA-AKI發(fā)生率可達(dá)10%~25%,尤其以糖尿病合并冠心病患者為主[9]。既往研究提示CAAKI的發(fā)生可能與氧化應(yīng)激、腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān),但CA-AKI發(fā)生的具體機(jī)制尚未完全闡明。目前臨床實(shí)踐指南推薦水化作為預(yù)防CA-AKI的基礎(chǔ),然而,預(yù)防性水化治療在保護(hù)腎功能方面的有效性還沒(méi)有得到充分研究證據(jù),同時(shí)N-乙酰半胱氨酸、他汀類藥物等干預(yù)措施的有效性同樣存在一定爭(zhēng)議。因此,需尋找有效的預(yù)防和治療CA-AKI的藥物。
SGLT-2i可降低心衰患者住院率和心血管患者死亡率,目前廣泛應(yīng)用于糖尿病和心血管疾病的治療[10-11]。課題組前期實(shí)驗(yàn)提示,SGLT-2i可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和心肌炎癥反應(yīng),改善心肌重構(gòu),從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用[12]。恩格列凈作為SGLT-2i類藥物,作用于SGLT-2受體的MAP17亞基,形成SGLT2-MAP17復(fù)合物,改變細(xì)胞膜電位差,保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞,降低糖尿病患者的腎臟損傷[13]。然而,恩格列凈能否減輕造影劑對(duì)腎臟的損傷,目前尚無(wú)相關(guān)研究。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠CA-AKI模型證實(shí),恩格列凈可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,降低CA-AKI的發(fā)生。氧化應(yīng)激導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞氧自由基生成增加和清除能力下降,使氧自由基蓄積于細(xì)胞內(nèi),引起細(xì)胞氧化障礙,導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損害或凋亡,進(jìn)而發(fā)生CA-AKI。研究證實(shí),Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可加重造影劑對(duì)小鼠腎臟的損害[14]。本研究中,恩格列凈可使大鼠血清MDA含量下降,SOD和GSH-Px活性增加,提示恩格列凈可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激進(jìn)而減輕腎臟損傷。既往相關(guān)研究證實(shí),CaMKⅡ/NFAT通路激活可促進(jìn)腎小管上皮上皮細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)還觀察到,恩格列凈干預(yù)后,TUNEL染色提示腎臟細(xì)胞凋亡率較造影劑組顯著下降,同時(shí)腎臟促凋亡蛋白caspase-3、Bax和Cyt-C表達(dá)減少、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增加,提示恩格列凈可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)防治CA-AKI的發(fā)生發(fā)展。
綜上,恩格列凈可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,減輕造影劑對(duì)大鼠腎臟的損傷,從而預(yù)防CAAKI的發(fā)生發(fā)展。然而,由于本研究對(duì)象為SD大鼠,與臨床患者有一定差異,需要臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證恩格列凈對(duì)造影劑相關(guān)急性腎損傷的防治作用。此外,恩格列凈是如何調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激途徑的,我們將在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中探討。