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      鴨茅單拷貝核基因RPB1引物設計及篩選

      2022-12-05 13:14:56安明珠朱文露彭亞萍
      養(yǎng)殖與飼料 2022年2期
      關鍵詞:鴨茅拷貝遺傳

      安明珠 朱文露 彭亞萍 韓 博 周 凱

      云南農業(yè)大學動物科學技術學院,昆明 650201

      鴨茅(Dactylis glomerataL.),又名果園草(Orchardgrass)或雞腳草(Cocksfoot),是禾本科(Poaccae)鴨茅屬(Dactylis)的唯一物種[1]。鴨茅的耐陰性較強、葉產(chǎn)量高[2],是畜牧業(yè)發(fā)展和改良環(huán)境的重要牧草草種之一,在青貯飼料的制備[3]、草地恢復[4]等方面廣泛應用。

      野生鴨茅的種質資源豐富,遺傳多樣性較高,是進行育種及物種保護的重要基因材料來源[2]。目前,國內外對于鴨茅的起源及進化的研究集中于地理學數(shù)據(jù)和形態(tài)學標記[5]、分子標記[6]以及葉綠體和ITS 序列[7]數(shù)據(jù)之上。隨著鴨茅生存環(huán)境的變化,形態(tài)學分類和分子標記技術受外界影響較大,對物種分類會造成一定的誤差[8]。單拷貝核基因屬于直系同源基因,繼承雙親的遺傳信息,沒有核苷酸偏向性和內部重復,攜帶大量的信息位點,進化速率中等,更適合用于對物種進行系統(tǒng)發(fā)育分析[9]。武潑潑等[10]基于單拷貝核基因DMC1 基因序列對中國短柄草種族進行分類研究,為其系統(tǒng)進化提供可靠證據(jù)。胡曉艷等[11]利用單拷貝核基因對酸棗的遺傳多樣性進行研究,證明單拷貝適用于物種遺傳多樣性應用,這為后續(xù)的酸棗種質資源保護及利用奠定了基礎。劉舒宇等[12]通過設計并篩選出楊柳科單拷貝核基因DSH引物,并對4 個屬的代表物種進行系統(tǒng)發(fā)育分析,為進一步深入了解楊柳科植物的遺傳多樣性提供數(shù)據(jù)支撐。Joly 等[13]開發(fā)了單拷貝核基因GAPDH作為核基因標記,重構了北美薔薇屬植物的多倍體起源。李爽等[14]基于單拷貝核基因PAL檢測到貴州金花茶具有低水平的遺傳多樣性和中等水平的遺傳分化,從而為最大程度保護貴州金花茶的遺傳多樣性奠定數(shù)據(jù)基礎。RPB1基因屬于單拷貝核基因,是RNA 聚合酶Ⅱ上最重要的大亞基,其拷貝數(shù)較低,廣泛應用于群體遺傳進化研究中,以揭示居群遺傳多樣性和遺傳分化[14-16]。

      目前,在鴨茅的系統(tǒng)發(fā)育分析上,單拷貝核基因RPB1還未曾應用,因此本研究通過設計鴨茅單拷貝核基因RPB1的引物,并對篩選后的引物退火溫度進行優(yōu)化,從而用于后續(xù)進一步探索鴨茅不同亞種間的親緣關系,此結果對鴨茅的起源進化和資源保護具有重要意義。

      1 材料與方法

      1.1 植物材料

      試驗材料為種植于云南省曲靖市馬龍區(qū)馬鳴市鴨茅圃的鴨茅亞種D.glomeratasubsp.woronowii和D.glomerata subsp.hispanica。在2020 年7 月收集鴨茅新鮮葉片,使用變色硅膠進行干燥保存,用于植物DNA 提取。

      1.2 試驗方法

      1)植物DNA 的提取。使用北京天根生物科技有限公司提供的Ezup 柱式植物基因DNA 提取試劑盒提取鴨茅葉片DNA,具體方法參考其說明書。稱取30~50 mg 鴨茅葉片,加入液氮快速研磨至粉末,然后通過試劑盒中的藥品進行溶解并提取,最終得到鴨茅DNA。提取后的DNA 樣用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,檢測合格的樣品放置-20 ℃冰箱中進行保存。

      2)引物設計。鴨茅RPB1 基因序列由四川農業(yè)大學張新全教授提供,利用Beacon Designer v.8 和Primer Blast 軟件設計鴨茅單拷貝核基因RPB1 引物序列,記錄其引物名稱、堿基序列、引物長度、退火溫度(表1)。將引物送到公司進行合成干粉,并按照要求將濃度稀釋為100 μmol/L。

      表1 引物序列

      3)PCR 擴增及瓊脂糖凝膠檢測。通過PCR 擴增技術,將退火溫度設置為12 個梯度,具體溫度以記錄的溫度為標線,上下調整10 ℃作為引物退火溫度區(qū)間。PCR 反應體系(50 μL):2.5μL DNA 樣(10 ng/μL),2.5 μL 上游引物(10 μmol/L),2.5 μL下游引物(10 μmol/L),25 μL Mix Taq PCR Master(1x),用去離子水補足至50 μL。擴增程序為:94 ℃3 min,94 ℃30 s,Tm 30 s,72 ℃1 min,35 X,72 ℃8 min,4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在紫外燈下進行觀察,根據(jù)條帶的清晰程度以及特異性與否,篩選出最適的引物對及退火溫度,用于后續(xù)試驗。

      4)測序。將符合要求的PCR 產(chǎn)物送到上海生工生物有限公司進行測序,然后通過chromas 查看峰圖,并在NCBI 數(shù)據(jù)庫中Blast 進行序列比對。

      2 結果與分析

      2.1 引物及退火溫度的篩選

      通過對10 對引物進行PCR 擴增,并設置12 個退火溫度梯度,發(fā)現(xiàn)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)RPB1(3F,3R)、RPB1(4F,4R)2 對引物能夠擴增出明亮的1 條帶且在58 ℃時最為明顯,說明這2 對引物設計合理,特異性較強。

      2.2 引物序列峰圖分析

      將得到的引物序列通過chromas 軟件后,每個序列得到1 個峰圖。通過峰重疊情況來判斷此引物序列是否能用于鴨茅系統(tǒng)發(fā)育分析。正常峰的峰圖序列連續(xù),且無重疊峰和無poly 結構,峰圖結構明顯清晰,為合適的引物序列;重疊峰的峰圖中有大量的重疊,說明在測序反應之后產(chǎn)生了不止1 條序列,則說明該引物設計不合格;poly 結構峰圖為出現(xiàn)連續(xù)單個堿基重復,會造成重疊峰,甚至造成反應中斷,測序失敗,不是合適的引物序列。如圖2 所示,所選引物的峰圖均為正常峰,無重疊峰。

      2.3 測序及驗證

      在NCBI 庫中輸入獲得的序列信息進行Blast 比對(圖3),2 對引物擴增的產(chǎn)物均為目的基因片段。

      3 討 論

      鴨茅物種及亞種間明確的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關系,是鴨茅種質資源更好地保存和利用的依據(jù),是現(xiàn)代牧草品種選育和改良的必要理論基礎之一。不同倍性的鴨茅亞種同域共生,形態(tài)上較為相似,隨著環(huán)境的變化,鴨茅的形態(tài)也隨之發(fā)生改變,這導致對鴨茅進行傳統(tǒng)形態(tài)學分類存在一定的誤差[17-19]。分子標記技術從一定程度上避免了這種誤差,但由于分子標記技術的費用較貴且耗時長,所以在物種的遺傳多樣性研究中未普遍應用[20-21],基于葉綠體基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹的分析報道較少[22],而對于從核基因方面進行鴨茅系統(tǒng)發(fā)育分析未見相關報道。

      鴨茅的分類階元較低,需要一些進化速率較快且變異位點較多的基因來研究鴨茅的系統(tǒng)發(fā)育問題。核基因的進化速率快于葉綠體基因和線粒體基因,基因序列在進化過程存在豐富的變異位點,為研究種間或屬間系統(tǒng)發(fā)育分析提供可用的變異信息[23]。RPB1 屬于單拷貝核基因,廣泛應用于群體遺傳進化研究中[14-16]。燕薇等[24]利用RPB1 基因對藍葉蟲微孢子蟲進行系統(tǒng)發(fā)育分析研究,進一步證實了親緣關系分類。李銀雙等[25]利用RPB1 對羊肚菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析,為其準確分類提供了科學分類。

      本試驗通過設計單拷貝核基因RPB1 引物,優(yōu)化其退火溫度,這為后續(xù)研究鴨茅不同亞種之間的起源和親緣關系奠定基礎。設計的10 對鴨茅單拷貝核基因RPB1 引物,篩選出2 對擴增產(chǎn)物條帶單一且擴增效果較好的引物,通過溫度梯度PCR 篩選了退火溫度為58 ℃,通過測序和Blast 比對驗證了其對應的目的基因。

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