劉澤文，王 偉，黃永芳，吳春銀，史曉雨，單體江

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院；b.植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

油茶Camellia oleifera為山茶科Theaceae 山茶屬Camellia多年生喬木，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南的14 個(gè)?。▍^(qū)）[1-3]，與椰子、油棕、油橄欖并稱(chēng)為世界四大木本食用油料樹(shù)種[4-5]。油茶及其副產(chǎn)物是篩選具有抗菌、抗氧化和殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)的重要來(lái)源[6-7]。大量研究結(jié)果表明，油茶籽餅水提液對(duì)香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌等11 種植物病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用[8]，同時(shí)在質(zhì)量濃度為50 g/L 時(shí)，對(duì)離體松材線蟲(chóng)培養(yǎng)48 h 后的活性抑制作用可達(dá)到100%，展現(xiàn)了良好的抗菌和殺線蟲(chóng)活性[9]。油茶籽、花、果殼、枝和根等不同部位提取物也展現(xiàn)了不同程度的抗氧化活性[10-13]。油茶果殼是油茶的重要副產(chǎn)物，富含黃酮、多酚、皂莢素、多糖等成分[14-15]，具有抗氧化、防衰老、抑菌消炎、預(yù)防心血管疾病和抗癌等多種生物活性，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[16]。大量油茶果殼的丟棄不僅浪費(fèi)資源，還會(huì)造成環(huán)境污染[17]。

目前，有關(guān)油茶果殼在防治農(nóng)林業(yè)病原真菌及松材線蟲(chóng)方面應(yīng)用的研究報(bào)道較少。本研究中采用乙酸乙酯冷浸提取法提取油茶果殼的次生代謝產(chǎn)物，并測(cè)定提取物的抗真菌、抗氧化以及殺線蟲(chóng)活性，以期為植物病害的防治提供新思路，為油茶果殼的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試樣品來(lái)源

2018年11月28日，在廣東省廣州市增城區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)科研基地采集油茶果殼樣品。樣樹(shù)共計(jì)28 種，分別為‘岑軟1 號(hào)’‘岑軟2 號(hào)’‘岑軟3 號(hào)’‘岑軟6 號(hào)’‘岑軟7 號(hào)’‘岑軟11 號(hào)’‘岑軟24 號(hào)’‘岑溪軟枝油茶’‘長(zhǎng)林27 號(hào)’‘璠龍4 號(hào)’‘璠龍5 號(hào)’‘贛石84 號(hào)’‘贛無(wú)2 號(hào)’‘贛無(wú)20 號(hào)’‘贛興46 號(hào)’‘桂無(wú)1 號(hào)’‘桂無(wú)2 號(hào)’‘桂無(wú)3 號(hào)’‘桂無(wú)4 號(hào)’‘桂無(wú)5 號(hào)’‘田軟6 號(hào)’‘湘林5 號(hào)’‘湘林29 號(hào)’‘湘林81 號(hào)’‘陽(yáng)春1 號(hào)’‘陽(yáng)春2 號(hào)’‘粵高油9 號(hào)’‘粵高油10 號(hào)。

1.1.2 供試病原菌及線蟲(chóng)

供試病原菌為油茶炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides，供試線蟲(chóng)為松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院植物與微生物健康實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器與試劑

儀器：BJ-150 型粉碎機(jī)（浙江拜杰電器有限公司）、SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、LRH 系列生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）、JA2003N 型分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、MLS-3870 三洋高壓滅菌鍋（松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社，日本）、Exceed-Cb 型超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）、LC-16 分析型高效液相色譜儀（島津企業(yè)管理有限公司）。

試劑：98.4%多菌靈（中國(guó)農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥中試廠），甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）均為分析純，甲醇、乙腈（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆┚鶠樯V純，葡萄糖（天津市大茂化學(xué)試劑廠），瓊脂（健陽(yáng)生物科技有限公司），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚（BHT）等藥品（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)）。

1.2 方 法

1.2.1 油茶果殼提取物的制備和分析

將油茶果殼在自然環(huán)境下風(fēng)干，用粉碎機(jī)研成粉末。稱(chēng)取各品種油茶果殼粉末1 g，并將其加入裝有40 mL 乙酸乙酯的離心管中，冷浸振蕩提取3 次，將提取液減壓濃縮至干，即得各品種油茶果殼提取物。稱(chēng)取各品種油茶提取物，配制1 mL 質(zhì)量濃度為10 g/L 的樣品溶液，使用0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，備用。使用高效液相色譜儀對(duì)各樣品溶液進(jìn)行分析。流動(dòng)相為乙腈和水，使用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，采用梯度洗脫系統(tǒng)。色譜條件：0 ～1 min 20%乙腈等度洗脫，1 ～16 min 乙腈（體積分?jǐn)?shù)由20%上升到100%）洗脫，16 ～17 min 100%乙腈洗脫。

根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果，對(duì)28 種油茶進(jìn)行分類(lèi)，從每類(lèi)中選取1 種具有代表性的油茶品種大量制備其果殼提取物，用于生物活性測(cè)定。

1.2.2 提取物抗油茶炭疽病菌活性的測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同品種油茶果殼提取物對(duì)油茶炭疽病菌的抑制活性[18]。供試樣品的初始質(zhì)量濃度為150 g/L，使用30%的DMSO依次倍半稀釋成質(zhì)量濃度為75、37.5、18.75、9.375、4.687 5 和2.343 75 g/L 的樣品溶液。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液加入到29 mL PDA 培養(yǎng)基中，混合均勻，制成樣品平板。將活化好的油茶炭疽菌餅（6 mm）接種于PDA 平板上。以加入無(wú)菌水、30% DMSO、98.4%多菌靈的PDA 培養(yǎng)基分別作為空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每處理重復(fù)3 次，28 ℃條件下培養(yǎng)5 d 左右。待空白對(duì)照菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿面積的2/3 時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落生長(zhǎng)直徑并計(jì)算抑菌率。

I=[(L1-L2)/L1]×100%。

式中：I表示抑菌率，L1表示陰性對(duì)照菌落純生長(zhǎng)量（菌落直徑與菌餅直徑的差值），L2表示處理菌落純生長(zhǎng)量。

使用Excel 軟件分析數(shù)據(jù)，將供試樣品質(zhì)量濃度取對(duì)數(shù)（X），將抑菌率換算為概率（Y），計(jì)算有效抑制中濃度（EC50）。

1.2.3 提取物抗氧化活性的測(cè)定

采用多孔板-DPPH 法測(cè)定不同品種油茶果殼提取物對(duì)DPPH 的清除力[19]。供試樣品的初始質(zhì)量濃度為40 g/L，使用30%的DMSO 依次倍半稀釋成質(zhì)量濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 和0.156 25 g/L 的樣品溶液。陽(yáng)性對(duì)照為BHT，初始質(zhì)量濃度為2 g/L，使用30%的DMSO對(duì)半稀釋成質(zhì)量濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 和0.007 812 5 g/L 的陽(yáng)性對(duì)照溶液。取80 μL 質(zhì)量濃度為200 mg/L 的DPPH 無(wú)水乙醇溶液以及20 μL 系列濃度的樣品溶液或陽(yáng)性對(duì)照溶液，加入96 微孔板中，以20 μL 30%的DMSO 溶液作為空白對(duì)照，避光振蕩搖勻，在37 ℃下水浴30 min，使用酶標(biāo)儀于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品均做4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)定3 次。計(jì)算供試樣品的DPPH 清除率。

C=[(Ac-As)/Ac]×100%。

式中：C表示DPPH 清除率，Ac表示空白對(duì)照在517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，As表示樣品溶液在517 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。

使用Excel 軟件分析數(shù)據(jù)，將供試樣品質(zhì)量濃度取對(duì)數(shù)（X），將DPPH 清除率換算為概率（Y），計(jì)算有效中濃度（IC50）。

1.2.4 提取物抗松材線蟲(chóng)活性的測(cè)定

采取觸殺法測(cè)定不同品種油茶果殼提取物的殺線蟲(chóng)活性[20]。用無(wú)菌水將高濃度的線蟲(chóng)水懸浮液稀釋至300 ～500 頭/mL。取不同品種油茶果殼提取物20 mg，使用400 μL 30%的DMSO 溶劑溶解，并依次倍半稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125和1.562 5 g/L 的樣品溶液，備用。在96 微孔板中每孔加入90 μL 線蟲(chóng)懸浮液，然后加入待測(cè)樣品液10 μL，3 次重復(fù)，以30%的DMSO 為陰性對(duì)照。每隔24、48、72 h 統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)死亡率，并進(jìn)行校正。

D=[(N1-N2)/(1-N2)]×100%。

式中：D表示校正死亡率，N1表示處理組死亡率，N2表示陰性對(duì)照死亡率。

使用Excel 軟件分析數(shù)據(jù)，將供試樣品質(zhì)量濃度取對(duì)數(shù)（X），將校正死亡率換算為概率（Y），計(jì)算半抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種油茶果殼的次生代謝產(chǎn)物

根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果，將28 種油茶分為Ⅰ～Ⅶ類(lèi)。Ⅰ類(lèi)為‘岑軟1 號(hào)’，Ⅱ類(lèi)為‘璠龍5 號(hào)’，Ⅲ類(lèi)為‘璠龍4 號(hào)’‘贛石84 號(hào)’，Ⅳ類(lèi)為‘長(zhǎng)林27 號(hào)’‘桂無(wú)3 號(hào)’‘粵高油10 號(hào)’，Ⅴ類(lèi)為‘桂無(wú)4 號(hào)’，Ⅵ類(lèi)為‘岑軟2 號(hào)’‘岑軟3 號(hào)’‘岑軟11 號(hào)’‘岑軟24 號(hào)’‘贛無(wú)2 號(hào)’‘贛無(wú)20 號(hào)’‘贛興46 號(hào)’‘桂無(wú)1 號(hào)’‘桂無(wú)2號(hào)’‘桂無(wú)5 號(hào)’‘湘林5 號(hào)’‘湘林29 號(hào)’‘湘林81 號(hào)’‘陽(yáng)春1 號(hào)’‘陽(yáng)春2 號(hào)’，Ⅶ類(lèi)為‘岑軟6 號(hào)’‘岑軟7 號(hào)’‘岑溪軟枝油茶’‘田軟6號(hào)’‘粵高油9 號(hào)’。從每類(lèi)中選取1 種具有代表性的油茶品種，分別為‘岑軟1號(hào)’‘璠龍5號(hào)’‘贛石84 號(hào)’‘桂無(wú)3 號(hào)’‘桂無(wú)4 號(hào)’‘桂無(wú)5 號(hào)’和‘粵高油9 號(hào)’，其果殼提取物在210 nm 下的高效液相色譜分析結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，7 種油茶果殼提取物均含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，但不同品種油茶果殼的次生代謝產(chǎn)物的分布、種類(lèi)和含量存在一定的差異。7 種油茶果殼的次生代謝產(chǎn)物主要集中在保留時(shí)間3.0 ～11.0 min 處，在保留時(shí)間約為3.5、7.5 和10.0 min 處具有相同化學(xué)物質(zhì)，但相對(duì)含量不同?！馃o(wú)3 號(hào)’果殼的次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)最多，‘桂無(wú)3 號(hào)’‘粵高油9號(hào)’和‘璠龍55 號(hào)’在保留時(shí)間為3.0 min 處存在與其他品種不同的化學(xué)信號(hào)。

圖1 各類(lèi)代表性品種油茶果殼提取物高效液相色譜分析結(jié)果Fig.1 HPLC chromatograms of the fruit shell extracts from different varieties of C.oleifera

2.2 不同品種油茶果殼提取物的抗油茶炭疽病菌活性

各類(lèi)代表性品種果殼提取物對(duì)油茶炭疽病菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用。其中，‘贛石84 號(hào)’果殼提取物對(duì)油茶炭疽病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50值為(2.02±0.09) g/L?！? 號(hào)’‘粵高油9 號(hào)’次之，EC50值分別為(2.65±0.38)、(2.84±0.19) g/L。‘桂無(wú)5 號(hào)’‘桂無(wú)3 號(hào)’‘璠龍5 號(hào)’和‘桂無(wú)4 號(hào)’果殼提取物的EC50值依次為(6.70±0.34)、(3.30±0.59)、(4.41±0.33)、(4.91±0.24) g/L。但所有樣品對(duì)油茶炭疽病菌的抑制效果明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照98.4%多菌靈，其EC50值為(0.70±0.10) mg/L。結(jié)果表明，‘贛石84 號(hào)’果殼提取物的抗油茶炭疽病菌活性最強(qiáng)。

2.3 不同品種油茶果殼提取物的抗氧化活性

各類(lèi)代表性品種果殼提取物均具有一定的抗氧化活性。其中，‘桂無(wú)4 號(hào)’果殼提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，其IC50值為(5.80±0) mg/L，強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照的IC50值(25.90±0) mg/L。其次是‘璠龍5 號(hào)’‘粵高油9 號(hào)’‘贛石84 號(hào)’果殼提取物，其IC50值分別為(36.80±0)、(48.60±0.02)、(92.10±0.02) mg/L。‘岑軟1 號(hào)’‘桂無(wú)3 號(hào)’‘桂無(wú)5 號(hào)’果殼提取物也表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，其IC50值分別為(119.30±0.05)、(199.70±0.01)、(516.40±0.28) mg/L，‘桂無(wú)5 號(hào)’果殼提取物的抗氧化活性最弱。結(jié)果表明，‘桂無(wú)4 號(hào)’果殼提取物的抗氧化活性最強(qiáng)。

2.4 不同品種油茶果殼提取物的殺線蟲(chóng)活性

各類(lèi)代表性品種果殼提取物對(duì)松材線蟲(chóng)的抑制效果見(jiàn)表1。由表1可知，除‘贛石84 號(hào)’和‘粵高油9 號(hào)’果殼提取物外，其他供試樣品對(duì)松材線蟲(chóng)均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但不同樣品之間存在差異。其中，‘璠龍5 號(hào)’果殼提取物在處理24、48、72 h后的IC50值分別為(9.65±1.54)、(5.03±0.73)、(3.72±0.12) g/L。其次是‘岑軟1 號(hào)’果殼提取物，其IC50值為8.86 ～11.38 g/L?！馃o(wú)3 號(hào)’果殼提取物在處理24 h 后開(kāi)始顯現(xiàn)殺線蟲(chóng)活性特征，其IC50值為7.41 ～15.91 g/L。‘桂無(wú)5 號(hào)’果殼提取物的殺線蟲(chóng)活性最差，其在處理72 h 后開(kāi)始出現(xiàn)明顯的殺線蟲(chóng)活性特征，其IC50值為17.62 ～18.26 g/L。結(jié)果表明，‘璠龍5 號(hào)’果殼提取物具有最好的殺線蟲(chóng)活性。

表1 各類(lèi)代表性品種油茶果殼提取物對(duì)松材線蟲(chóng)的殺線活性?Table 1 Nematicidal activities against B.xylophilus of the fruit shell extracts from different varieties of C.oleifera g/L

3 結(jié)論與討論

不同品種油茶果殼提取物在抗真菌、抗氧化和殺線蟲(chóng)活性方面存在明顯差異。根據(jù)油茶果殼次生代謝產(chǎn)物的高效液相色譜分析結(jié)果，可將28 個(gè)油茶品種劃分為7 大類(lèi)。從每類(lèi)中選1 個(gè)具有代表性的油茶品種，測(cè)定其果殼提取物的抗真菌、抗氧化和殺線蟲(chóng)活性。其中：‘贛石84 號(hào)’果殼提取物對(duì)油茶炭疽病菌的抑制效果最好，其EC50值為(2.02±0.09) g/L；‘桂無(wú)4 號(hào)’果殼提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，其IC50值為(5.80±0) mg/L，強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT 的IC50值(25.90±0) mg/L；‘璠龍5號(hào)’果殼提取物表現(xiàn)出較好的殺線蟲(chóng)活性，其在處理24、48 和72 h 后的IC50值分別為(9.65±1.54)、(5.03±0.73)、(3.72±0.12) g/L?！M石84 號(hào)’‘桂無(wú)4 號(hào)’‘璠龍5 號(hào)’可作為候選油茶品種，進(jìn)一步用于果殼提取物活性成分的鑒定。

油茶為我國(guó)重要的木本油料樹(shù)種，具有良好的適應(yīng)性和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國(guó)南方廣大紅壤丘陵地區(qū)有廣泛種植[2,21]。油茶果殼為油茶加工產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，目前亟待加強(qiáng)開(kāi)發(fā)利用。有研究結(jié)果表明，油茶果殼提取物表現(xiàn)出較好的抗真菌和抗氧化活性可能與其富含酚類(lèi)、皂苷、萜類(lèi)和生物堿類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物有關(guān)[22-26]。此外，這些物質(zhì)還能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，減少病蟲(chóng)害發(fā)生，提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[27-28]。本研究中分別采用菌絲生長(zhǎng)速率法、多孔板-DPPH 法和觸殺法測(cè)定了7 個(gè)具有代表性油茶品種果殼代謝產(chǎn)物的抗真菌、抗氧化和殺線蟲(chóng)活性，結(jié)果表明‘贛石84 號(hào)’油茶果殼提取物對(duì)油茶炭疽病菌的抑制能力最強(qiáng)。左繼林等[29]報(bào)道，在25 個(gè)贛無(wú)性系品種中，‘贛石84 號(hào)’是最優(yōu)品種，具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。油茶果殼提取物的抗真菌活性可能與茶皂素有關(guān)，茶皂素提取純度因品種和提取工藝不同而有所差異[27]。本研究中采用的提取方法并非茶皂素的最佳提取方法，后續(xù)可進(jìn)一步研究不同品種油茶果殼茶皂素的含量差異?！馃o(wú)4 號(hào)’果殼提取物對(duì)DPPH 表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除能力，其IC50值為(5.80±0) mg/L，清除力甚至強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT，與前人的研究結(jié)果一致[10,30]。通過(guò)高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，7 類(lèi)油茶果殼提取物均含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，且存在一定的差異，以大極性和中等極性化合物居多，油茶果殼提取物表現(xiàn)出的抗真菌、抗氧化和殺線蟲(chóng)活性與這些成分的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。此外，本研究中僅對(duì)油茶果殼次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步分析，應(yīng)進(jìn)一步分離鑒定其中的活性物質(zhì)，闡明其化學(xué)結(jié)構(gòu)和活性機(jī)理。