王一峰，陳耀年，趙淑玲，王明霞，胡文斌，蹇小勇

（1.隴南師范高等專科學校 a.農林技術學院；b.隴南特色農業(yè)生物資源研發(fā)中心，甘肅 成縣 742500；2.成縣核桃科技服務中心，甘肅 成縣 742500）

核桃Juglans regiaL.屬胡桃科核桃屬落葉橋木，是世界上最重要的堅果、材用和油料樹種[1]。我國是核桃的原產地之一，至今已有2 000 多年的核桃栽培史，現已成為世界第一核桃生產大國，我國的核桃產量和栽培面積均居世界首位[2]。核桃兼具觀賞、食用、藥用等方面的價值，已成為我國重要的經濟林樹種；此外，核桃適應性較強，在我國山區(qū)荒漠治理及生態(tài)環(huán)境修復等方面都起到了積極的作用[3-4]。然而，核桃枝條髓心較大，含水量高，而休眠時間較短，因此其抗寒性較差；加之春季萌芽期，需要消耗大量營養(yǎng)，導致樹體抗寒力下降，容易受到晚霜凍害的影響，晚霜凍害已成為核桃生產的重要限制因子[4]。因此，研究核桃抗寒性的影響因子，探尋增強核桃抗寒性的途徑，對實現核桃連年豐產具有重要的指導意義。

植物生長除了需要光照、溫度、水分和營養(yǎng)物質外，還需要少量的生長調節(jié)物質，施肥和噴施生長調節(jié)物質，是調控植物生長的兩種常規(guī)技術，也是提高植物抗寒能力的有效措施。鉀作為植物生長的重要營養(yǎng)元素，其作用主要在于促進植物根系的生長和導管的形成；另外，鉀還能通過促進植物對養(yǎng)分的吸收，使得樹勢增強，從而提高植物的抗逆性[5]。Ca2+被認為是植物接受外界刺激信號的第二信使，參與了植物多種生理生化反應，能夠激發(fā)許多細胞活動[6-8]。鈣在植物抗逆性方面的作用受到越來越多研究者的關注，他們普遍認為，Ca 信使參與了植物對逆境的應答反應[5]。

近年來，關于施用鉀、鈣等外源物質對多種植物抗寒性的影響的研究報道較多：徐秀月等[9]的研究結果表明，鉀肥有利于葡萄結果枝的萌發(fā)，能增強其抗寒性；Ozturk 等[10]研究發(fā)現，鉀能增強銀杏的抗寒性；Webster 等[11]的研究結果表明，同時施用氮肥與鉀肥，能增強黑麥草的耐低溫能力。Ca2+同樣能增強植物的抗寒性，其作用主要表現如下：一方面，Ca2+能通過其濃度的改變而增強細胞結構的穩(wěn)定性，同時提高保護酶活性以增強植物的抗寒能力；另一方面，Ca2+通過影響植物細胞間的信息傳遞和信號轉導誘導抗寒基因的表達，從而間接地增強植物的抗寒力[12]。Lin等[13]對毛白楊噴施不同濃度的CaCl2的試驗結果表明，10 mmol·L-1的CaCl2處理有利于毛白楊幼苗抗寒性的增強；張建霞等[14]的研究結果表明，在低溫脅迫下，鈣能通過提高檸檬試管苗可溶性蛋白質的含量而增強SOD 活性及降低MDA 含量，進而增強其抗寒性；李國新等[15]于低溫條件下采用不同濃度的Ca2+處理柑橘的愈傷組織，結果證明，鈣信號系統(tǒng)參與了柑橘抗寒中滲透物質的合成、保護酶及膜質過氧化等生理過程。然而，目前關于不同濃度的鉀、鈣處理對核桃抗寒性影響的研究尚未見諸報道。為給核桃抗寒性研究提供理論參考依據，用不同濃度的K2SO4和CaCl2溶液噴施核桃幼樹，探討不同濃度的鉀、鈣處理對核桃抗寒指標的影響情況，現將研究結果分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年11月核桃樹落葉后，挖取長勢基本一致、無病蟲害的2年生‘清香’核桃幼樹，修剪枝條和根系后，以河沙為基質，將其栽植于口徑為40 cm 的塑料花盆中，置于溫度為20 ～28 ℃、濕度為50%～70%的溫室中管理，視墑情按期澆水和補充營養(yǎng)液，培育1 a 后將其用作試驗材料。

所用化學試劑K2SO4和CaCl2均為分析純。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區(qū)組設計，以K2SO4（K）和CaCl2（C）為試驗因素，每個試驗因素各設4 個濃度（5、10、15、20 mmol·L-1）處理，將濃度分別為5、10、15、20 mmol·L-1的K2SO4（K）溶液處理依次編號為K1、K2、K3、K4；將濃度分別為5、10、15、20 mmol·L-1的CaCl2（C）溶液處理依次編號為C1、C2、C3、C4，以清水（0 mmol·L-1）處理為對照（CK），共計9 個處理，每個處理各設3 個重復。

選取27 盆長勢基本一致的盆栽核桃幼樹，隨機將其分成9 組，每組3 盆，重復3 次，每個重復各試驗1 盆，每盆各栽1 株核桃幼樹。2021年5月26日開始按照試驗設計進行葉面噴肥試驗，每次噴施量以葉面剛剛開始滴水為宜，每隔2 d 噴施1 次，共噴施6 次。以最后1 次噴施完48 h 后，分別在各處理核桃樹的相同部位，隨機采集發(fā)育階段相同的核桃葉片，將所采葉片置于-4 ℃的冰箱中低溫處理48 h，然后于4 ℃下解凍2 h 后測定核桃葉片的生理生化指標。

1.3 測定指標與測定方法

參照王一峰等[4]采用的電導法測定相對電導率；參照王蘇甫·阿不力提甫等[16]采用的方法分別測定可溶性糖、丙二醛（MDA）、脯氨酸的含量，每個指標的測定各設3 次重復。

1.4 數據處理

使用Excel 2010 軟件處理所有數據，采用Orgin 2018 軟件制作圖表；使用 SPSS 23.0 軟件進行方差分析，采用S-N-K 法進行多重比較。

1.5 核桃幼樹抗寒性的綜合評價

利用隸屬函數值對不同處理核桃幼樹的抗寒性進行綜合評價。按照下列公式計算各抗寒指標的隸屬函數值：與抗寒性呈正相關的指標，按照公式（1）計算其隸屬函數值；與抗寒性呈反相關的指標，則按照公式（2）計算其隸屬函數值。

式（1）～（2）中：U（Xij）為核桃幼苗在第i個處理下第j個指標的隸屬函數值；Xij為核桃幼苗在第i處理下第j個指標的測定值；Xmin和Xmax分別為所有處理中各指標測定值的最大值和最小值。

2 結果與分析

2.1 噴施不同濃度的鉀與鈣溶液對核桃葉片相對電導率的影響

噴施不同濃度的K2SO4和CaCl2溶液對低溫脅迫下核桃葉片相對電導率的影響情況如圖1所示。由圖1可知，在低溫脅迫下，與對照（CK）處理的相比，噴施不同濃度的K2SO4和CaCl2溶液后核桃葉片的相對電導率均有不同程度的降低。噴施濃度為10 mmol·L-1的CaCl2溶液后，核桃葉片的相對電導率最低，且其與對照間的差異顯著（P＜0.05）；噴施濃度為5 mmol·L-1的CaCl2溶液后，核桃葉片的相對電導率較低，其與對照間的差異也顯著（P＜0.05）；在其他濃度的CaCl2溶液處理下，核桃葉片的相對電導率與對照間的差異均不顯著（P＞0.05）。測定結果還表明，當K2SO4和CaCl2溶液的濃度較低（K2SO4濃度為15 mmol·L-1，CaCl2濃度為10 mmol·L-1）時，核桃葉片的相對電導率隨著溶液濃度的升高而下降；而當K2SO4和CaCl2溶液的濃度過高（K2SO4濃度為20 mmol·L-1，CaCl2濃 度 為15 mmol·L-1）時，核桃葉片的相對電導率又會升高。這一結果表明，噴施低濃度的K2SO4和CaCl2溶液均能增強核桃葉片的抗寒性，但是，噴施濃度過高的K2SO4和CaCl2溶液對核桃葉片均會造成傷害，從而影響核桃葉片的抗寒性。

圖1 噴施不同濃度的K2SO4 和CaCl2 溶液對低溫脅迫下核桃葉片相對電導率的影響Fig.1 Effects of spraying different concentrations of K2SO4 and CaCl2 solution on relative conductivity of walnut leaves under low temperature stress

2.2 噴施不同濃度的鉀與鈣溶液對核桃葉片中可溶性糖含量的影響

噴施不同濃度的K2SO4和CaCl2溶液對低溫脅迫下核桃葉片中可溶性糖含量的影響情況如圖2所示。由圖2可知，在低溫脅迫下，除噴施了濃度為5 mmol·L-1的K2SO4溶液的核桃葉片中可溶性糖含量略低于對照的外，其他處理的核桃葉片中可溶性糖的含量與對照的相比都有不同程度的升高。其中，噴施濃度為10 mmol·L-1的CaCl2溶液后，核桃葉片中可溶性糖的含量最高，且其與對照間的差異顯著（P＜0.05）；其次分別為噴施了濃度為5 mmol·L-1的CaCl2和濃度為20 mmol·L-1的K2SO4溶液的可溶性糖含量。

圖2 噴施不同濃度的K2SO4 和CaCl2 溶液對低溫脅迫下核桃葉片中可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of spraying different concentrations of K2SO4 and CaCl2 solution on soluble sugar content of walnut leaves under low temperature stress

2.3 噴施不同濃度的鉀與鈣溶液對核桃葉片中丙二醛含量的影響

噴施不同濃度的K2SO4和CaCl2溶液對低溫脅迫下核桃葉片中丙二醛含量的影響情況如圖3所示。由圖3可知，在低溫脅迫下，噴施低濃度的K2SO4和CaCl2溶液后，核桃葉片中丙二醛的含量比對照的有所降低；但是，當噴施濃度較高（K2SO4的濃度高于15 mmol·L-1、CaCl2的濃度高于10 mmol·L-1）時，核桃葉片中MDA 的含量比對照的有所升高。在低溫脅迫下，各個處理間核桃葉片中MDA 含量的差異顯著（P＜0.05）：噴施了10 mmol·L-1的CaCl2溶液的核桃葉片中MDA的含量最低，且其與對照間的差異顯著（P＜0.05）；其次分別為噴施了10 mmol·L-1的K2SO4和5 mmol·L-1的CaCl2溶液的核桃葉片中MDA 的含量，其與對照間的差異均顯著（P＜0.05）；而其他處理的核桃葉片中MDA 的含量與對照間的差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 噴施不同濃度的K2SO4 和CaCl2 溶液對低溫脅迫下核桃葉片中丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of spraying different concentrations of K2SO4 and CaCl2 solution on MDA content of walnut leaves under low temperature stress

2.4 噴施不同濃度的鉀與鈣溶液對核桃葉片中脯氨酸含量的影響

噴施不同濃度的K2SO4和CaCl2溶液對低溫脅迫下核桃葉片中脯氨酸含量的影響情況如圖4所示。由圖4可知，在低溫脅迫下，噴施不同濃度的K2SO4溶液后，核桃葉片中脯氨酸的含量與對照的相比均有顯著提高，且其與對照間的差異顯著（P＜0.05）；噴施濃度分別為5 和10 mmol·L-1的CaCl2溶液后，核桃葉片中脯氨酸的含量與對照的相比均略有降低，但其與對照間的差異均不顯著（P＞0.05），隨著CaCl2濃度的繼續(xù)加大，核桃葉片中脯氨酸的含量又開始升高，且其與對照間的差異顯著（P＜0.05）。

圖4 噴施不同濃度的K2SO4 和CaCl2 溶液對低溫脅迫下核桃葉片脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of spraying different concentrations of K2SO4 and CaCl2 solution on proline content of walnut leaves under low temperature stress

2.5 噴施不同濃度的鉀與鈣溶液后核桃幼樹抗寒性的綜合性評價結果

對以不同濃度的K2SO4和CaCl2處理下核桃幼樹葉片的各個抗寒指標值進行了隸屬函數分析，并對低溫脅迫下各處理核桃幼樹的抗寒性進行了綜合評價，結果見表1。由表1可知，在低溫脅迫下，噴施濃度分別為5 和10 mmol·L-1的CaCl2和濃度為15 mmol·L-1的K2SO4溶液的核桃葉片各個抗寒指標的隸屬度均高于對照的，而其他濃度處理的核桃葉片各個抗寒指標的隸屬度均低于對照的。不同處理的核桃幼樹的抗寒性由強至弱依次 為C2 ＞C1 ＞K3 ＞CK ＞K2 ＞K4 ＞C3 ＞C4 ＞K1。

表1 核桃樹葉片各個抗寒指標的隸屬度Table 1 Subordination values of cold resistance indexes of walnut leaves

3 討 論

低溫脅迫對植物細胞會造成傷害，在低溫脅迫下，對低溫最敏感的細胞壁和細胞膜的結構與功能均會發(fā)生變化，比如細胞壁會加厚、硬度增加，細胞膜結構會發(fā)生改變，使其滲透率發(fā)生變化，細胞代謝速率降低，以適應低溫環(huán)境而產生抗寒性[17]。王偉玲[5]的研究結果表明，鉀能提高植物細胞滲透調節(jié)物質的含量，增強細胞的滲透勢，降低冰點，以增強植物的抗寒性；另外，充足的鉀有利于呼吸速率的降低和水分的散失，保護細胞膜的水化層，從而增強植物對低溫的抵抗能力。研究者發(fā)現，Ca2+能通過其濃度的改變而穩(wěn)定細胞壁的結構，維持細胞結構的穩(wěn)定性，同時增強抗氧化系統(tǒng)的功能，從而減輕低溫對植物的傷害程度[18-19]。根據細胞導電率推測細胞受傷害的程度，是當前評價植物抗寒性的最經典方法之一。試驗結果表明，噴施了不同濃度的K2SO4和CaCl2溶液的核桃幼樹，在低溫脅迫下，其相對電導率與對照的相比均有不同程度的降低，但是，隨著K2SO4和CaCl2噴施濃度的增加，其相對電導率均逐漸升高，表明噴施低濃度的K2SO4和CaCl2有利于核桃樹抗寒性的增強，但其濃度太高可能會影響核桃樹的生長。

作為植物細胞內最重要的滲透調節(jié)物質，可溶性糖能增加細胞液溶質的濃度，降低冰點，減輕低溫對細胞的傷害。有關研究結果表明，可溶性糖含量可以作為植物抗寒性評價的生理指標，其大小與植物的抗寒性呈正相關[4]。試驗結果表明，在低溫脅迫下，除了噴施5 mmol·L-1的K2SO4溶液的核桃葉片中可溶性糖的含量略低于對照的之外，其他處理的核桃葉片中可溶性糖的含量與對照的相比都有不同程度的升高，而當K2SO4溶液濃度大于15 mmol·L-1、CaCl2溶液濃度大于10 mmol·L-1時，其可溶性糖含量又開始降低，這可能因為，濃度過高的鉀、鈣對核桃幼樹會造成肥害，使其抗寒性減弱。

植物受到低溫傷害后，其細胞內會積累活性氧和自由基，造成質膜過氧化，丙二醛（MDA）作為植物細胞質膜過氧化的產物，其含量可作為評價植物抗寒性的重要生理指標。試驗結果表明，噴施低濃度的K2SO4和CaCl2，核桃葉片中MDA的含量與對照的相比都有不同程度的降低，其中，噴施10 mmol·L-1的CaCl2溶液后，核桃葉片中MDA 的含量最低，但是，隨著噴施濃度的升高，MDA 含量又開始增加。這一結果與袁嘉瑋等[20]、王小媚等[21]研究得出的“外源鈣處理可以顯著降低植物細胞MDA 含量，但過高濃度的外源鈣會抑制植物生長”的結果一致，與Lin 等[13]研究所得“10 mmol L-1的CaCl2處理有利于毛白楊幼苗抗寒性的提高”的結果也類似。

脯氨酸常以游離狀態(tài)存在于植物體內，是植物蛋白質的組成成分之一，作為水溶性最大的氨基酸，在植物遭受低溫脅迫時，其含量會發(fā)生很大變化，因此，游離脯氨酸含量常被認為是細胞有效的滲透調解物[22]。但是，因為不同物種的游離脯氨酸含量不一致，所以脯氨酸能否作為抗寒性評價的生理指標還存在爭議[23-27]。試驗中發(fā)現，噴施了不同濃度的K2SO4后，低溫脅迫下核桃葉片中可溶性脯氨酸的含量與對照的相比均有顯著升高，而噴施濃度為5 ～10 mmol·L-1的CaCl2溶液后，低溫脅迫下核桃葉片中脯氨酸的含量與對照的相比有所下降。這一試驗結果產生的原因可能是，當缺少鈣離子時，在低溫脅迫下，鈣離子信號轉導受阻，導致植物細胞中脯氨酸的累積量增加，而鈣離子的施加，使得脯氨酸累積量降低。這一試驗結果與宗會等[24]的研究結果一致。試驗中還發(fā)現，當CaCl2濃度升高到15 mmol·L-1以上時，核桃葉片中脯氨酸的含量卻顯著升高，這一結果與楊亞軍等[23]的研究結果類似。這一試驗結果產生的原因可能是，高濃度的鈣影響了植物的生長，低溫脅迫使得植物遭到嚴重傷害，引起脯氨酸累積量增加，因此，脯氨酸的積累量可能反映了植物因低溫脅迫而受傷害的程度，而不能反映出植物的抗寒能力。

植物的抗寒性受多個因素的影響，且不同種類的植物，其抗寒機理不同。不同處理對同一生理指標的影響情況不盡相同，因而很難用單一指標來衡量植物的抗寒性。因此，本研究采用隸屬函數法，綜合分析相對電導率、可溶性糖、MDA及脯氨酸含量等指標，就低溫脅迫下不同鉀、鈣處理對核桃幼樹抗寒性的影響程度進行了綜合評價，結果表明，不同處理的核桃樹的抗寒性，噴施CaCl2溶液的強于噴施K2SO4溶液的，這一評價結果與王偉玲[5]研究得出的“Ca 對低溫脅迫下植物抗寒性指標的影響作用大于K”的結論一致。

鉀、鈣對核桃的抗寒性都有影響，在同時施用鉀肥和鈣肥時，鉀、鈣之間存在著相互作用，如果配比不當，對核桃樹的生長可能會造成影響，本研究只比較分析了單獨施用不同濃度的鉀、鈣對核桃抗寒指標的影響情況，卻沒有探究不同濃度的鉀鈣組合對核桃抗寒指標的影響情況。因此，研究不同配比的鉀鈣組合對核桃抗寒性的影響情況，以篩選出能增強核桃抗寒力的最適濃度的鉀鈣組合，為當地核桃配方施肥提供理論依據，這是本課題組下一步研究的方向。

4 結 論

噴施低濃度的K2SO4 和CaCl2溶液能增強核桃幼樹的抗寒性，而其濃度太高則會影響核桃樹的生長。另外，外源鉀和外源鈣對核桃抗寒性的影響程度存在差異，總體表現為，噴施CaCl2溶液的核桃幼樹的抗寒性強于噴施K2SO4溶液的。不同濃度不同溶液處理的核桃幼樹抗寒性的強弱順序為：10 mmol·L-1的CaCl2＞5 mmol·L-1的CaCl2＞15 mmol·L-1的K2SO4＞CK ＞10 mmol·L-1的K2SO4＞20 mmol·L-1的K2SO4＞15 mmol·L-1的CaCl2＞20 mmol·L-1的CaCl2＞5 mmol·L-1的K2SO4。