光遺傳學(xué)技術(shù)在尿控領(lǐng)域應(yīng)用的研究進展

薛 原，陳 忠

(上海交通大學(xué)附屬上海市第六人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200233)

光遺傳學(xué)(optogenetics)是一種將光控與遺傳學(xué)相結(jié)合的新技術(shù)。其基本原理為通過基因工程手段，將光敏蛋白導(dǎo)入特定神經(jīng)或肌肉細胞，使其在特定波長的光刺激下產(chǎn)生興奮或抑制。這一技術(shù)最早被應(yīng)用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能的研究，而后逐步發(fā)展至視網(wǎng)膜病變、心臟起搏、疼痛治療等領(lǐng)域[1-3]。

近年來，光遺傳學(xué)在尿控領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸增多，并初步展現(xiàn)出其用于探究排尿高級中樞功能及調(diào)控下尿路活動的優(yōu)勢。本文旨在回顧總結(jié)光遺傳學(xué)的機制及其在尿控領(lǐng)域應(yīng)用的實驗進展，為后續(xù)研究提供思路。

1 光遺傳學(xué)的機制與發(fā)展歷程

“光遺傳學(xué)”一詞原指“通過基因靶向技術(shù)使特定神經(jīng)元或蛋白與光學(xué)技術(shù)相結(jié)合，從而用于成像或調(diào)控目標活動的過程[4]”。其核心為將光信號轉(zhuǎn)化為電信號從而調(diào)控細胞活動的激動蛋白和將電信號轉(zhuǎn)化為光信號從而成像的指示蛋白[5-9]。隨著前者應(yīng)用于調(diào)節(jié)細胞或者組織活動所取得的巨大成功，現(xiàn)在狹義的光遺傳學(xué)僅包含前者，即“通過基因與光學(xué)技術(shù)相結(jié)合從而實現(xiàn)特定細胞或活組織獲得或失去功能的過程[5]”。在本文中，我們僅對狹義的光遺傳進行討論。

1.1 視蛋白的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用視蛋白(opsin)是一類在動物視覺系統(tǒng)及部分微生物體內(nèi)中廣泛存在的光敏蛋白。在視蛋白家族中，微生物視蛋白由于同時具有光敏和效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，因此能夠使非光敏細胞獲得對特定波長和強度的光的敏感性。文獻報道2005年KARL的團隊證實光敏通道蛋白2(channelrhodopsin-2,ChR2)能夠產(chǎn)生足以激活哺乳動物神經(jīng)元的動作電位[10]。這是一種能夠被470 nm藍光激活的非特異性陽離子通道蛋白，當(dāng)其被激活時，Na+、Ca2+等進入細胞，引起細胞去極化產(chǎn)生動作電位。同時，ChR2的反應(yīng)速度極快，可以在被光照激活50 μs內(nèi)產(chǎn)生電流。這一發(fā)現(xiàn)具有里程碑式的意義，開啟了光遺傳學(xué)的新時代，使人們可以在毫秒級的時間精度上調(diào)節(jié)神經(jīng)活動。此后，更多ChR2家族的亞型被構(gòu)建以實現(xiàn)更快的神經(jīng)動作。

光遺傳學(xué)不僅可以用于激發(fā)神經(jīng)元動作電位，也可以靶向抑制神經(jīng)元。嗜鹽菌視紫紅質(zhì)(natronomonas pharaonis halorhodopsin，NpHR)是一類來自古細菌的氯離子泵，當(dāng)其表達于特定細胞后可以在580 nm黃光照射下將氯離子轉(zhuǎn)運進入細胞，使細胞超極化并沉默[9]。由于激活波長不同，ChR2與NpHR可以在同一細胞內(nèi)共同表達，從而獨立誘導(dǎo)細胞的激活或沉默。這使得人們能夠更加靈活地調(diào)控細胞活動。

ChR2和NpHR是最早、最經(jīng)典的光遺傳學(xué)組件，目前仍被廣泛應(yīng)用。在不久的將來，一些新出現(xiàn)的光敏蛋白可能會取代他們，如C1V1(Chlamydomonas and Volvox ChR1)、Chronos、Jaws、Arch、BLINK1(blue-light-induced K+channel 1)、ACR(anion-selective channelrhodopsin)[11-13]等。這些光敏蛋白在激活波長、反應(yīng)速度等方面各有不同，為光遺傳學(xué)的應(yīng)用提供了更加豐富的選擇。

1.2 光遺傳學(xué)組件的構(gòu)建和導(dǎo)入由于神經(jīng)細胞的高度多樣性和復(fù)雜性，標記目標細胞并使視蛋白特異性表達對實現(xiàn)光遺傳學(xué)的空間特異性十分重要。目前最為常用且簡便的方法是將編碼細胞特異性啟動子、光敏蛋白的基因片段包裝在病毒載體中并注射到靶細胞區(qū)域，通過病毒轉(zhuǎn)染實現(xiàn)視蛋白的表達[14]。常用的工具病毒包括慢病毒(lentivirus)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)[15-16]等。但病毒載量有限，對啟動子的編碼長度有一定限制。而構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物系，并通過Cre/loxp等重組酶系統(tǒng)實現(xiàn)視蛋白的特異性表達的方法則無此限制，較病毒轉(zhuǎn)染更加高效穩(wěn)定，但其成本較高、培育周期長。此外，也可將病毒與重組酶系統(tǒng)相結(jié)合，如將編碼Cre重組酶的病毒局部注射到loxp轉(zhuǎn)基因動物的靶細胞區(qū)域，既解決了對編碼長度的限制，也能夠一定程度降低成本，因此也得到了廣泛使用。

1.3 光照系統(tǒng)當(dāng)光敏蛋白被整合進目標細胞后，就可以通過光照刺激其產(chǎn)生激活或抑制作用。常用的光源包括發(fā)光二極管(light-emitting diode，LED)、激光等，其中LED成本低廉、結(jié)構(gòu)簡單，可以進行無線刺激，可以完全植入體內(nèi)，更加符合生理條件，但光照波譜不夠集中；激光的波譜范圍窄，波束集中，能夠更加準確的激活特定光敏蛋白，但需要光纖連接，侵襲性相對較大，且價格相對高昂[17-18]。近年來，可被近紅外光(near-infrared-light，NIR)激活的納米材料開始應(yīng)用于光遺傳學(xué)領(lǐng)域[19]。近紅外光與光遺傳學(xué)所需的黃光、藍光等可見光相比具有更強的穿透性，可以直接通過體外光源照射目標區(qū)域。而這些納米材料則可以在動物體內(nèi)將接收到的近紅外光轉(zhuǎn)化為可見光，從而在局部激活光敏蛋白，實現(xiàn)光遺傳學(xué)調(diào)控。

1.4 光遺傳學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢光敏蛋白在特定類型細胞的表達、限定的光照位置及光照波長保證了光遺傳學(xué)的空間特異性，而光敏蛋白的快速反應(yīng)性則保證了光遺傳學(xué)的時間特異性。相較于傳統(tǒng)的電刺激與神經(jīng)藥理學(xué)方法，光遺傳學(xué)技術(shù)彌補了前者易損傷細胞、刺激范圍不精確，后者起效慢、特異性不高的缺點，能夠以毫秒級速度精確地興奮或抑制特定類型細胞，為深入研究各神經(jīng)環(huán)路及其作用、機制等研究提供了新思路、新方法，因此被廣泛認可并寄予厚望。

2 光遺傳學(xué)在尿控領(lǐng)域的應(yīng)用

鑒于光遺傳學(xué)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域所取得的成功，近年來越來越多的研究者選擇將光遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于尿控領(lǐng)域。光遺傳學(xué)技術(shù)一方面可以作為一種治療手段，通過調(diào)節(jié)功能明確的神經(jīng)或肌肉活動，從而控制儲尿及排尿，另一方面也可作為一種探究手段，用于驗證特定類型神經(jīng)元在排尿過程中發(fā)揮的作用。

2.1 光遺傳學(xué)用于治療下尿路功能障礙在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下進行儲尿或排尿是下尿路(lower urinary tract, LUT)的主要功能。這一過程有賴于膀胱與括約肌的協(xié)調(diào)活動，由一套復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支配完成，包括腦、脊髓及外周神經(jīng)元[20]。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，脊髓損傷[21]、糖尿病[22]等多種疾病均可導(dǎo)致下尿路功能異常，形成下尿路功能障礙(lower urinary tract dysfunction, LUTD)，產(chǎn)生尿潴留、尿失禁、膀胱過度活動(overactive bladder, OAB)等癥狀，影響患者的生活質(zhì)量。然而，傳統(tǒng)的藥物治療(如抗膽堿能藥物、β3受體激動劑、肉毒素A)和神經(jīng)調(diào)節(jié)術(shù)由于缺乏靶向特異性，往往療效有限或產(chǎn)生難以規(guī)避的副作用[23-24]。因此，如何實現(xiàn)高效可控的儲尿與排尿調(diào)節(jié)一直是人們關(guān)注的重點。而光遺傳學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為此創(chuàng)造了希望。通過局部調(diào)節(jié)支配膀胱、逼尿肌的脊髓或外周神經(jīng)活動，光遺傳學(xué)在動物模型中實現(xiàn)了對下尿路功能的調(diào)控，有望在未來替代骶神經(jīng)調(diào)節(jié)術(shù)等傳統(tǒng)的電刺激神經(jīng)調(diào)節(jié)術(shù)。

AWAD等[25]將光遺傳學(xué)應(yīng)用于脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的治療。通過慢病毒載體將ChR2分別轉(zhuǎn)染至成年大鼠脊髓L6～S2節(jié)段，并于T8節(jié)段損傷脊髓，構(gòu)建了脊髓損傷大鼠模型。當(dāng)光刺激脊髓神經(jīng)元時，這些大鼠的排尿功能較光照前有所恢復(fù)。

PARK等[26]使用腺病毒作為轉(zhuǎn)染載體，將其注射進野生型小鼠的膀胱壁，使膀胱平滑肌細胞選擇性表達NpHR，并通過給予前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)成功誘導(dǎo)其產(chǎn)生了OAB癥狀。當(dāng)藍光照射激活NpHR時，這些OAB小鼠的膀胱內(nèi)壓成功下降至未經(jīng)PGE2處理時的水平，表明光遺傳學(xué)能夠改善實驗小鼠的OAB癥狀。由于其膀胱活動的調(diào)節(jié)是通過直接作用于平滑肌實現(xiàn)的，因此不會因干擾其他神經(jīng)活動而產(chǎn)生傳統(tǒng)藥物、電刺激所產(chǎn)生的非自主排便、骨骼肌活動等副作用。該研究顯示了光遺傳學(xué)治療LUTD的良好前景。

SAMINENI等[27]將編碼抑制性光敏蛋白Arch的基因轉(zhuǎn)染至間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型的膀胱疼痛感覺神經(jīng)，不僅減少了膀胱疼痛，也降低了膀胱敏感性，從而減少了膀胱活動。MICKLE等[28]在此基礎(chǔ)上設(shè)計了一套基于大鼠模型的閉環(huán)膀胱活動調(diào)節(jié)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)包含了三部分：一個柔軟可伸縮的環(huán)狀壓力感受器及LED光源，包裹在膀胱表面；一個植入腹部的信號基站，與壓力感受器及LED光源有線連接，并可從體外無線充電；以及一個體外的信息處理器。當(dāng)膀胱容量發(fā)生異常變化(如排空頻率過高)時，壓力感受器通過基站將信號發(fā)至體外的處理器，處理器分析信號后開啟LED，從而抑制轉(zhuǎn)染了Arch基因的膀胱感覺神經(jīng)元，減少膀胱活動。該研究為光遺傳學(xué)治療LUTD向臨床的轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了條件。

2.2 光遺傳學(xué)用于探究排尿高級中樞功能隨著fMRI等影像學(xué)手段應(yīng)用于神經(jīng)研究，人們對排尿高級中樞的認識越來越深入。其中，腦橋排尿中樞(pontine micturition center，PMC，亦稱Barrington核，Bar)最為引人關(guān)注。多項經(jīng)典研究表明，PMC作為排尿中樞在皮層上級結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控下起到了開關(guān)樣的作用[20, 29-30]。然而，PMC內(nèi)部細胞亞群的分類及其功能尚不明確。此外，人們對神經(jīng)環(huán)路中更上級的皮質(zhì)層在排尿過程中發(fā)揮的作用也知之甚少。而光遺傳學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為人們深入探索排尿高級中樞的功能提供了有力武器。

HOU等[31]對PMC中表達促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，Crh)的神經(jīng)元進行了研究。在轉(zhuǎn)染表達ChR2后，研究者通過藍光激活小鼠的Crh+細胞，成功檢測到了較對照組頻率明顯升高且與光照節(jié)律吻合的的膀胱壓力峰，提示Crh+細胞的激活能夠誘導(dǎo)膀胱逼尿肌收縮。VERSTEGEN 等[32]對此進行了進一步研究。該團隊首先通過逆行狂犬病毒示蹤技術(shù)尋找到小鼠Bar核上游排尿相關(guān)的谷氨酸能神經(jīng)元，確認其分別來自中腦導(dǎo)水管灰質(zhì)(periaqueductal gray，PAG)和下丘腦外側(cè)區(qū)(lateral hypothalamic area，LHA)。當(dāng)二者對應(yīng)區(qū)域表達囊泡型谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白2(vesicular glutamate transporter 2，Vglut2)的谷氨酸能神經(jīng)元(PAGVglut2,LHAVglut2)分別被轉(zhuǎn)染ChR2并激活時，小鼠產(chǎn)生了節(jié)律不同的膀胱內(nèi)壓增高或排尿活動，提示二者在排尿調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了不同作用。之后，研究者為了驗證這些谷氨酸能神經(jīng)元是否與HOU研究中的Crh+神經(jīng)元有所重合，分別使用光遺傳學(xué)激活了所有谷氨酸能的Barrington核神經(jīng)(BarVglut2)以及表達Crh的谷氨酸能神經(jīng)元(BarCrh/Vglut2)。結(jié)果表明，相較于激活BarVglut2產(chǎn)生的顯著排尿反應(yīng)，激活BarCrh/Vglut2時僅有6%的小鼠在清醒狀態(tài)下出現(xiàn)了排尿，且較刺激BarVglut2時反應(yīng)有所延后，提示Barrington核中Crh-的谷氨酸能神經(jīng)元同樣在排尿的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。

KELLER[33]對Barrington核中特異性表達雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)的神經(jīng)元進行了研究。當(dāng)研究者通過AAV將ChR2特異性轉(zhuǎn)染這些細胞并使其激活時，小鼠在清醒狀態(tài)下立刻產(chǎn)生了排尿。而在麻醉狀態(tài)下對這些小鼠進行尿道外括約肌肌電圖檢測時發(fā)現(xiàn)，這些小鼠在受到光照后立刻產(chǎn)生了外括約肌松弛。類似地，當(dāng)研究者將抑制性光敏蛋白ArchT轉(zhuǎn)入BarESR1后，光照立刻逆轉(zhuǎn)了小鼠的外括約肌地松弛過程。這一結(jié)果提示BarESR1具有調(diào)節(jié)尿道外括約肌活動的功能。

YAO等[34]通過狂犬病毒示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)了初級運動皮層(primary motor cortex，M1)的第5層中存在部分神經(jīng)元參與了排尿活動。當(dāng)這些神經(jīng)元被轉(zhuǎn)染ChR2并激活時，研究者檢測到了膀胱逼尿肌的動作電位及膀胱內(nèi)壓的升高。在對清醒狀態(tài)小鼠進行光照時，這些小鼠產(chǎn)生了明顯與光照節(jié)律重合的排尿。

3 總 結(jié)

綜上所述，光遺傳學(xué)技術(shù)不僅能夠用于探究、驗證排尿高級中樞的功能，也能夠通過調(diào)節(jié)膀胱肌肉或其支配神經(jīng)的活動從而治療下尿路功能障礙?？梢灶A(yù)見，光遺傳技術(shù)在尿控領(lǐng)域未來的研究和治療中必將發(fā)揮更大的作用。