馬 靜，張艷艷，賈新月，馬 勛，王正榮，薄新文,

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000)

基因編輯技術(shù)是利用核酸內(nèi)切酶作為“分子剪刀”，對(duì)DNA進(jìn)行靶向切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double strand breaks,DSB)，誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生2種修復(fù)機(jī)制,即非同源末端重組修復(fù)(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重組修復(fù)(homology directed repair,HDR)[1],從而實(shí)現(xiàn)基因靶向修飾?；蚓庉嬕蚰芨咝实剡M(jìn)行定點(diǎn)基因組編輯，在基因研究、基因治療和遺傳改良等方面展現(xiàn)出了巨大的潛力。

目前，在基因編輯發(fā)展過程中，巨型核酸酶(meganucleases,MNs)、鋅指核酸酶(zinc finger endonucleases,ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)及CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9)系統(tǒng)是最主要的4種編輯工具。MNs又叫大范圍核酸酶，其可識(shí)別的位點(diǎn)序列較長，但識(shí)別效率較低；ZFNs是人工設(shè)計(jì)的含有鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域的蛋白核酸內(nèi)切酶，但核酸內(nèi)切酶FokⅠ必須形成二聚體才能將雙鏈DNA剪開；與ZFNs類似，TALENs也是由2個(gè)結(jié)構(gòu)域——轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(TALEs)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶FokⅠ催化結(jié)構(gòu)域融合而成的；由于ZFNs和TALENs的復(fù)雜性、難度大和成本高等原因，使得它們的使用受到了限制[2]。作為獲得2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡單、成本低、修飾效率高等優(yōu)點(diǎn)[3]，成為了一種廣受歡迎的基因組靶向修飾技術(shù)，已成功應(yīng)用于小鼠[4]、秀麗隱桿線蟲[5-6]、斑馬魚[7]、果蠅[8]、擬南芥[9]、水稻[10]、釀酒酵母[11]等模式生物。

鑒于此，研究人員開始將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于寄生蟲基因組編輯，通過研究與蟲體發(fā)育、毒力及與宿主相互作用等相關(guān)基因，從而達(dá)到開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)和疫苗的目的，現(xiàn)已成功運(yùn)用于多種寄生蟲的基因組編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用發(fā)展迅速，筆者就該系統(tǒng)在寄生蟲基因組編輯中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為后續(xù)相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與分類

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

1987年,Ishino等[12]在對(duì)磷酸鹽代謝相關(guān)基因進(jìn)行分析時(shí)，在大腸桿菌基因組中首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)不尋常的重復(fù)DNA序列，即一個(gè)29個(gè)核苷酸重復(fù)序列，但它們被不相關(guān)的、非重復(fù)的短間隔序列打斷。隨后在其他微生物中又有一些類似序列的報(bào)道，2000年,Mojica等[13]發(fā)現(xiàn)在所有原核生物中均有類似序列，直到2002年Jansen等[14]將此序列正式命名為“CRISPR”。為探究這些序列的起源，2005年,Mojica等[15]對(duì)67株細(xì)菌和古菌株的4 500條CRISPR序列進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas序列中的間隔序列來自外源的噬菌體、質(zhì)粒等，同年P(guān)ourcel等[16]報(bào)道了鼠疫耶爾森菌中的CRISPR通過優(yōu)先攝取噬菌體DNA獲得了新的重復(fù)序列。2007年,Barrangou等[17]首次證實(shí)了CRISPR/Cas是一種細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。作為一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，CRISPR/Cas系統(tǒng)如何進(jìn)行自我與非自我識(shí)別，如何抵抗外來入侵核酸呢？Deveau等[18]通過對(duì)噬菌體基因組原間隔序列的分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與原間隔序列直接相鄰的短基序，稱為原間隔子相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)，這種PAM基序?qū)λ拗鬟M(jìn)行自我與非自我識(shí)別非常重要[19]。Brouns等[20]研究發(fā)現(xiàn)，成熟的crRNA(CRISPR RNA)可作為小的引導(dǎo)RNA使Cas蛋白復(fù)合物能干擾病毒的增殖。2008年,Marraffini等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR通過靶向DNA限制了葡萄球菌的水平基因轉(zhuǎn)移，且可限制抗生素耐藥性在致病細(xì)菌中的傳播。2010年,Garneau等[22]發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌CRISPR1/Cas系統(tǒng)可特異性地切割質(zhì)粒和噬菌體雙鏈DNA。2011年,Sapranauskas等[23]研究表明，嗜熱鏈球菌CRISPR3/Cas系統(tǒng)可轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中并提供異種保護(hù)，防止質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和噬菌體感染。CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅可特異性地切割，還可跨屬轉(zhuǎn)移，并對(duì)侵入性核酸提供異源干擾。由此可見，CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用潛力有待進(jìn)一步挖掘和研究。

2011年,Deltcheva等[24]發(fā)現(xiàn)，tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)介導(dǎo)crRNA的成熟對(duì)Cas9蛋白活性至關(guān)重要。2012年,Jinek等[25]在crRNA與tracrRNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過將 crRNA的3′-端與tracrRNA的5′-端融合而生成嵌合RNA，即形成一個(gè)單鏈的向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)后成功在體外引導(dǎo)Cas9切割質(zhì)粒，由此CRISPR技術(shù)開始轉(zhuǎn)變?yōu)榛蚓庉嫻ぞ摺?013年,Cong等[26]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)成功編輯哺乳動(dòng)物基因組。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類

CRISPR/Cas基因座編碼古細(xì)菌和細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，由于其快速進(jìn)化及研究逐漸深入，使得CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類復(fù)雜化?；?011和2015年的分類，Makarova等[27]在2020年又更新進(jìn)化了CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類。目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為2個(gè)類、6種類型、17個(gè)亞型。第1類(Class 1)包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3種類型；第2類(Class 2)包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ 3種類型，而每種類型又被分為多種亞型。

CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫包括3個(gè)步驟：適應(yīng)、表達(dá)和干擾[22]。在適應(yīng)步驟中，來自入侵元素的外源DNA片段(稱為原間隔子)被處理并作為新的間隔子合并到CRISPR陣列中[28]；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型系統(tǒng)中此步驟由Cas1、Cas2、Cas4等基因編碼的關(guān)鍵酶負(fù)責(zé)，在Ⅳ、Ⅵ型系統(tǒng)中是Cas1、Cas2，而Ⅲ型系統(tǒng)在Cas1、Cas2的基礎(chǔ)上多了1個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶[27]。表達(dá)步驟包括CRISPR陣列的轉(zhuǎn)錄，然后將pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)加工成成熟的crRNA，這些crRNA與1個(gè)或多個(gè)Cas蛋白組裝成CRISPR核糖核蛋白(crRNP)復(fù)合物[28]；在大多數(shù)第1類系統(tǒng)中，Cas6是直接負(fù)責(zé)加工的酶，在Ⅱ型系統(tǒng)中，加工是由細(xì)菌RNaseⅢ(一種非Cas蛋白)催化的，而在許多Ⅴ型和所有的Ⅵ型系統(tǒng)中，大型效應(yīng)Cas蛋白包含一個(gè)獨(dú)特的催化中心負(fù)責(zé)加工[27]。干擾步驟包括crRNP復(fù)合物中的Cas核酸酶通過crRNA直接切割入侵的同源病毒或質(zhì)粒核酸[28-29]；在第1類系統(tǒng)中，此步驟由多個(gè)Cas蛋白共同完成，即Cas3、Cas5、Cas8、Cas10和Cas11的不同組合，取決于類型和亞型。相比之下，在第2類系統(tǒng)中，此步驟由1個(gè)單一的大蛋白質(zhì)——Cas9、Cas12或Cas13完成[27]。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在寄生蟲基因組編輯中的應(yīng)用

寄生蟲作為一類具有致病性的低等真核生物，既可作為病原體，又可作為媒介傳播其他疾病。當(dāng)前寄生蟲病的危害仍是普遍存在的公共衛(wèi)生問題，寄生蟲病對(duì)人類和動(dòng)物健康都構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。通過基因組序列信息及其功能了解寄生蟲與其宿主之間的關(guān)系，有助于開發(fā)新的診斷方法，也有助于開發(fā)新的藥物和疫苗等。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為研究寄生蟲基因功能提供了重要技術(shù)手段，該技術(shù)已成功運(yùn)用于瘧原蟲(Plasmodium)、弓形蟲(Toxoplasma)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)、柔嫩艾美耳球蟲(Emeriatenella)、利什曼原蟲(Leishmania)、錐蟲(Trypanosoma)、陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)、犬新孢子蟲(Neosporacaninum)、巴貝斯蟲(Babesia)、血吸蟲(Schistosoma)、蜱蟲(tick)、蚊(mosquito)等。

2.1 瘧原蟲

2.1.1 惡性瘧原蟲 瘧原蟲屬是通過蚊子傳播的寄生蟲，是引起瘧疾的病原體。在5種人類感染的瘧疾寄生蟲中，惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)是毒力最強(qiáng)、最致命的寄生蟲，是造成高死亡率和發(fā)病率的主要病原。瘧原蟲屬缺乏非同源末端重組所必需的機(jī)制[30]，因此，需使用同源模板來實(shí)現(xiàn)同源定向修復(fù)。Ghorbal等[31]使用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生了同時(shí)攜帶pL7-orc1和pUF1Cas9的寄生蟲，全基因組測(cè)序證實(shí)了在內(nèi)源性位點(diǎn)上存在所需的突變，即用丙氨酸替代Orc1亮氨酸137的突變，這種突變已被證實(shí)可影響1個(gè)編碼惡性瘧原蟲主要毒力因子基因的表達(dá)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在惡性瘧原蟲上的首次成功應(yīng)用證明了有效的基因編輯對(duì)于研究瘧疾的巨大價(jià)值。

Wagner等[32]創(chuàng)建了應(yīng)用T7啟動(dòng)子而非U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙載體系統(tǒng)，還證實(shí)了sgRNA-T可在體外指導(dǎo)DNA模板的特異性切割，其構(gòu)建的第1個(gè)質(zhì)粒pT7 RNAP-HR可表達(dá)T7-RNA聚合酶，并遞送DNA供體序列用于DSB修復(fù)；第2個(gè)質(zhì)粒pCas9-sgRNA-T可表達(dá)Cas9和sgRNA到目標(biāo)靶位點(diǎn)。隨著該系統(tǒng)的應(yīng)用，Wagner等[32]報(bào)道了轉(zhuǎn)染后33 d編碼天然球形相關(guān)富組氨酸蛋白的kharp基因缺失，且刪除負(fù)責(zé)編碼紅細(xì)胞結(jié)合抗原175的eba-175基因后編輯效率在50%～100%之間。

雖然已在惡性瘧原蟲中開發(fā)了幾種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的方法，但仍存在脫靶突變和攜帶供體模板DNA的環(huán)狀質(zhì)粒與靶位點(diǎn)之間的意外重組。為此，Nishi等[33]對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，生成了內(nèi)源性表達(dá)Cas9的寄生蟲，通過轉(zhuǎn)染僅含有線性DNA供體模板和sgRNA的質(zhì)粒來改造基因，最終在既無脫靶突變也無意外重組的情況下，在2周內(nèi)以>85%的高效率實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)誘變和熒光蛋白的融合。這種改進(jìn)方式解決了惡性瘧原蟲CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前的技術(shù)問題，將該系統(tǒng)在惡性瘧原蟲上的應(yīng)用引入了一個(gè)新階段。此外，Zhao等[34]還開發(fā)了一種生成Cas9i系統(tǒng)的整合策略，顯著縮短了轉(zhuǎn)基因惡性瘧原蟲的生成時(shí)間，且通過惡性瘧原蟲的單輪轉(zhuǎn)染成功地實(shí)現(xiàn)了多重基因組編輯(突變或標(biāo)記)。

2.1.2 約氏瘧原蟲 為建立Cas9蛋白在嚙齒動(dòng)物瘧疾寄生蟲——約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii)中的內(nèi)源性和組成性表達(dá)，Qian等[35]使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯方法將內(nèi)源性基因sera1的編碼區(qū)替換為完整的化膿性鏈球菌Cas9(SpyCas9)編碼序列，成功產(chǎn)生了敲入Cas9的約氏瘧原蟲(PyCas9ki),得到的PyCas9ki蟲體在整個(gè)生命周期中發(fā)育正常，并在環(huán)狀體、滋養(yǎng)體和裂殖體階段具有Cas9蛋白的表達(dá)。上述研究通過引入僅含有sgRNA和同源模板元件的質(zhì)粒(pYCs)，成功地實(shí)現(xiàn)了PyCas9ki寄生蟲基因組中不同內(nèi)源性基因的缺失和標(biāo)記修飾，且該P(yáng)yCas9ki寄生蟲為約氏瘧原蟲的基因功能研究提供了一個(gè)新的平臺(tái)。

鑒于目前的研究方法可能受到可選擇標(biāo)記物的可用性和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因寄生蟲所需時(shí)間的限制，且隨著外源序列的引入，還存在破壞天然基因調(diào)控元件的風(fēng)險(xiǎn)。Walker等[36]開發(fā)了一種基于化膿性鏈球菌Cas9，利用核酶-向?qū)?核酶(ribozyme-guide-ribozyme，RGR)sgRNA表達(dá)策略和RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的瘧原蟲基因編輯系統(tǒng)CRISPR-RGR。通過將該系統(tǒng)應(yīng)用于約氏瘧原蟲，成功破環(huán)了編碼PyALBA4 RNA結(jié)合蛋白的基因，并在pyalba4基因上插入了GFP標(biāo)簽。

Xu等[37]開發(fā)了一種基于微同源性介導(dǎo)的末端連接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)的CRISPR/Cas9(mCRISPR)策略，可有效地在具有重復(fù)序列的基因中同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)突變寄生蟲，并為研究蟲體發(fā)育功能基因和疫苗研發(fā)提供了幫助。其在不使用模板DNA的情況下成功地在約氏瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白(circumsporozoite surface protein，CSP)的中心重復(fù)區(qū)(central repeat region，CRR)產(chǎn)生了各種大小的突變體。突變后的寄生蟲在蚊子體內(nèi)階段的發(fā)育存在嚴(yán)重缺陷，而在小鼠中與野生型約氏瘧原蟲17XL寄生蟲相似，表明CSP-CRR在蚊子階段的發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。

2.2 弓形蟲

在許多人獸共患寄生蟲病中，弓形蟲病是最重要的疾病之一，是由一種專性的細(xì)胞內(nèi)寄生的剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的，能感染包括人類在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游?。操縱弓形蟲基因組的能力可有助于發(fā)展有效的疫苗接種策略和更好的治療方法。盡管有有效的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，但同源整合并不是將外源DNA插入弓形蟲基因組的首選機(jī)制。相反，DNA通過非同源端連接隨機(jī)插入基因組。通過敲除關(guān)鍵成分KU80來失活非同源連接通路已被用于提高同源重組效率，從而促進(jìn)弓形蟲的基因敲除和標(biāo)記內(nèi)源性位點(diǎn)[38-39]。

Sidik等[40]使用RNA引導(dǎo)的Cas9內(nèi)切酶在不需要選擇的情況下有效產(chǎn)生敲除，并將點(diǎn)突變和表位標(biāo)簽引入弓形蟲基因組，但由于缺乏可進(jìn)行雙鏈斷裂修復(fù)的非同源連接機(jī)制，ΔKU80突變體比野生型弓形蟲更易受到遺傳的影響。進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了剛地弓形蟲全基因組基因評(píng)估，分析每個(gè)基因在人類成纖維細(xì)胞感染中的作用，并確定了一種稱為類頂端復(fù)合體微粒蛋白(claudin-like apicomplexan microneme protein，CLAMP)的入侵因子[41]。

Shen等[42]使用CRISPR/Cas9來破壞Ⅰ型RH蟲體的尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(UPRT)基因，UPRT基因的丟失導(dǎo)致蟲體對(duì)氟尿嘧啶脫氧核苷(FUDR)的耐藥性，電穿孔48 h后對(duì)Ⅰ型RH蟲株進(jìn)行FUDR篩選和測(cè)序，成功產(chǎn)生了UPRT基因突變。此外，Shen等[42]還破壞了Ⅰ型GT1蟲體的ROP18位點(diǎn)，并補(bǔ)充UPRT位點(diǎn)的缺失，發(fā)現(xiàn)ROP18基因是影響急性毒力的一個(gè)重要因素。

Zheng等[43]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除來評(píng)價(jià)弓形蟲亮氨酸氨基肽酶作為藥物靶點(diǎn)的潛力，通過表型分析發(fā)現(xiàn)，敲除弓形蟲亮氨酸氨基肽酶可抑制弓形蟲入侵和復(fù)制；通過補(bǔ)充弓形蟲亮氨酸氨基肽酶的同義替代等位基因，恢復(fù)了敲除寄生蟲的生長和入侵能力；小鼠試驗(yàn)表明，敲除亮氨酸氨基肽酶在一定程度上降低了剛地弓形蟲的致病性，但由于沒有完全阻斷寄生蟲的發(fā)育、毒力或酶活性，其只能作為剛地弓形蟲的輔助藥物靶點(diǎn)使用。陳凱等[44]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了弓形蟲Ⅰ型RH蟲株的MORN2基因敲除株,經(jīng)體外噬斑試驗(yàn)和體內(nèi)感染試驗(yàn)結(jié)果表明，MORN2基因的缺失幾乎不影響RH蟲株在體外培養(yǎng)時(shí)的生長速度和感染小鼠的毒力，證明MORN2基因在RH蟲株中無表型功能。Zhang等[45]利用CRISPR-Cas9技術(shù)檢測(cè)了CTrp26和CTrx1在Ⅰ型RH弓形蟲中的基本生物學(xué)功能,結(jié)果表明，CTrp26和CTrx1均位于弓形蟲速殖子的細(xì)胞質(zhì)中，缺失這2種硫氧還蛋白(thioredoxins，Trxs)中的任何一種均不影響該寄生蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、逸出過程、斑塊形成、過氧化氫抗性、活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，且這2種Trxs在昆明小鼠中不作為RH弓形蟲的毒力因子。

Chen等[46]對(duì)RH弓形蟲進(jìn)行了全基因組CRISPR/Cas9功能缺失篩選，鑒定出了幾個(gè)新基因，選擇其中5個(gè)基因(HP1～HP5基因)進(jìn)行進(jìn)一步功能鑒定結(jié)果顯示，在RH弓形蟲中，HP1基因的靶向缺失導(dǎo)致了對(duì)過氧化氫的顯著敏感性，以及體外抗氧化能力、侵襲效率和增殖能力的下降；體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果也顯示，感染HP1-KO弓形蟲的小鼠存活時(shí)間比感染野生型弓形蟲的明顯延長。由此表明HP1基因可能與弓形蟲抗氧化損傷和毒性有關(guān)。

2.3 隱孢子蟲

隱孢子蟲是繼輪狀病毒后引起腹瀉的重要病原體之一，該寄生蟲約有3 950個(gè)基因，但由于其不能在體外長期培養(yǎng)，且缺乏有效的基因工具，目前還沒有針對(duì)該寄生蟲的有效疫苗，且只有一種已批準(zhǔn)的藥物[47-48]。

Vinayak等[47]建立了在人回盲腸癌細(xì)胞(human ileocecal adenocarcinoma cells，HCT-8)中培養(yǎng)隱孢子蟲子孢子的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，但子孢子在細(xì)胞中只進(jìn)行一兩輪復(fù)制便會(huì)死亡，并在此基礎(chǔ)上將轉(zhuǎn)染后的子孢子直接注入免疫缺陷小鼠的腸道內(nèi)，構(gòu)建了小鼠感染模型，解決了隱孢子蟲不能在體外長期培養(yǎng)的難題。為了使轉(zhuǎn)基因蟲體能富集，其構(gòu)建了Nluc報(bào)告基因和新霉素耐藥標(biāo)記物(Neo)之間的融合翻譯，以集中觀察轉(zhuǎn)染蟲體的小亞群。此外，其利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行了DNA修復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)隱孢子蟲與特定sgRNA共轉(zhuǎn)染時(shí)熒光素酶活性恢復(fù)；而沒有特定sgRNA時(shí)沒有觀察到這一變化。表明隱孢子蟲缺乏非同源重組修復(fù)，需同源重組修復(fù)。

2.4 柔嫩艾美耳球蟲

柔嫩艾美耳球蟲是腸道疾病球蟲病的病原體，是一種尖端復(fù)合體原生動(dòng)物寄生蟲，在家禽寄生蟲疾病中尤為重要?；蚪M測(cè)序結(jié)果顯示，柔嫩艾美耳球蟲的生命周期由超過8 000個(gè)基因控制，這些基因控制著無性復(fù)制、兩性分化、傳播和毒性等高度協(xié)調(diào)的生命周期[49]。然而，由于缺乏系統(tǒng)分析基因功能的工具，大多數(shù)基因的功能仍不清楚。

Hu等[50]報(bào)道了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)首次在柔嫩艾美耳球蟲中應(yīng)用于單基因水平的基因功能分析及對(duì)整個(gè)基因家族的系統(tǒng)功能分析，其利用一個(gè)構(gòu)成型表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因株系，證明了非同源端連接和引導(dǎo)同源重組介導(dǎo)的功能喪失。將該方法應(yīng)用于EtGRA9基因定位的研究，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一種分泌蛋白，可能幫助子孢子釋放，并可能在子孢子和裂殖子的入侵過程中發(fā)揮重要作用。利用該方法對(duì)ApiAp2轉(zhuǎn)錄因子基因家族進(jìn)行系統(tǒng)破壞，發(fā)現(xiàn)該寄生蟲表達(dá)的33個(gè)因子中有23個(gè)對(duì)蟲體的發(fā)育和生存至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)將為未來對(duì)柔嫩艾美耳球蟲發(fā)病機(jī)制和蟲體發(fā)育相關(guān)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。Tang等[51]使用CRISPR/Cas9對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的子孢子進(jìn)行編輯，成功地標(biāo)記了內(nèi)源性微素蛋白2(EtMic2)，證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能有效地介導(dǎo)HDR的靶基因斷裂和修復(fù)及柔嫩艾美耳球蟲的內(nèi)源性基因修飾。

2.5 利什曼原蟲

杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani)是致命的內(nèi)臟利什曼病的病原體。為了解利什曼原蟲的感染和發(fā)病機(jī)制，并確定控制利什曼病的新藥物靶點(diǎn)，需更有效的方法來操縱這種寄生蟲基因組。Zhang等[52]利用錘頭型核酶和丁型肝炎病毒(HDV)核酶開發(fā)了一種提高基因靶向效率的雙sgRNA表達(dá)載體，精確缺失了大小為3 kb的米替福新轉(zhuǎn)運(yùn)基因(LdMT)。此外還發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9在LdMT基因中引起的一個(gè)新的單點(diǎn)突變，導(dǎo)致LdMT的單一氨基酸從蛋氨酸變?yōu)樘K氨酸(M381T)。該突變導(dǎo)致了對(duì)米替福新(miltefosine，MLF)的耐藥性，這是唯一可用的口服抗利什曼原蟲藥物MLF的憂患所在。通過將博萊霉素耐藥基因表達(dá)盒插入Cas9切割位點(diǎn)，成功敲除了非必需基因Ldbpk_241510.1(一個(gè)多藥耐藥蛋白樣基因)，并使用相同的方法成功用GFP標(biāo)記了LdMT蛋白的N-端部分(381個(gè)氨基酸)，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以破壞并精確標(biāo)記內(nèi)源性基因。

A2是一個(gè)多拷貝基因家族，是內(nèi)臟利什曼原蟲感染的重要毒力因子[53]。在杜氏利什曼原蟲1SCL2D中至少有11個(gè)大小不同的A2基因拷貝[54]。Zhang等[55]通過靶向杜氏利什曼原蟲LdMT和A2基因，對(duì)CRISPR/Cas9活性進(jìn)行共同選擇來提高A2基因缺失的效率，通過免疫印跡分析，該系統(tǒng)可完全刪除A2基因，且CRISPR/Cas9共同靶向A2與LdMT基因顯著減少了刪除A2基因所需的時(shí)間。

在利什曼原蟲前鞭毛體的表面，磷酸糖(PG)，如脂磷酸糖(LPG)、蛋白磷酸糖(PPG)、游離磷酸糖聚合物(PGs)和酸性磷酸酶(sAP)等，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，促進(jìn)利什曼原蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的入侵和生存[56]。磷酸糖的合成依賴于LPG2基因編碼的高爾基GDP-甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，Jesus-Santos等[57]使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除利什曼原蟲LPG2基因，將成功敲除LPG2基因的寄生蟲感染人類中性粒細(xì)胞并共孵育3 h，與野生型寄生蟲感染相比，中性粒細(xì)胞內(nèi)寄生蟲的負(fù)荷量降低了83%，表明LPG2基因的缺失會(huì)減少蟲體對(duì)人類中性粒細(xì)胞的感染。

2.6 錐蟲

克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)是恰加斯病的病原體，是一種能同時(shí)感染人類和其他動(dòng)物的原生動(dòng)物寄生蟲。克氏錐蟲是最不被了解的原生動(dòng)物之一，是導(dǎo)致感染性心臟病的原因?？耸襄F蟲的遺傳復(fù)雜性及有限的基因組工程技術(shù)導(dǎo)致了對(duì)該病原體的認(rèn)識(shí)和研究相對(duì)缺乏[58-59]。

然而，Peng等[60]的發(fā)現(xiàn)改變了這種情況，其將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于克氏錐蟲的基因工程，快速有效地敲除了包括必需基因在內(nèi)的多個(gè)內(nèi)源性基因。同時(shí)還觀察到，在沒有模板的情況下，克氏錐蟲中Cas9誘導(dǎo)的DSB的修復(fù)是通過不同大小缺失的微同源性介導(dǎo)的末端連接(MMEJ)引起的。當(dāng)提供DNA修復(fù)模板時(shí)，CRISPR/Cas9可極大地促進(jìn)所提供的模板和基因組中特定位置之間的同源重組，其效率比沒有CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的DSB高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，Peng等[60]通過敲除1個(gè)由65個(gè)成員組成的酶基因家族(β-半乳糖呋喃糖基糖基轉(zhuǎn)移酶家族)，導(dǎo)致在沒有明顯脫靶突變的情況下酶產(chǎn)物顯著減少，證明CRISPR/Cas9具有顯著的多路復(fù)用能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Cas9可介導(dǎo)其自身編碼序列的破壞，挽救穩(wěn)定表達(dá)Cas9的寄生蟲的生長缺陷。

CRISPR介導(dǎo)的編輯，除了將Cas9和sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入生物體內(nèi)，使其內(nèi)源性表達(dá)發(fā)生編輯作用外，還可通過在體外生成Cas9/sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)。Soares等[61]將純化的重組金黃色葡萄球菌Cas9蛋白(SaCas9)和體外轉(zhuǎn)錄單引導(dǎo)RNA(sgRNAs)在體外進(jìn)行組裝后，經(jīng)電穿孔導(dǎo)入克氏錐蟲的不同生命周期階段內(nèi)，對(duì)報(bào)告基因和內(nèi)源性基因進(jìn)行了高效的基因組編輯，首次將Cas9-sgRNA RNP復(fù)合物遞送到克氏錐蟲的上鞭毛體和錐鞭毛體內(nèi)進(jìn)行基因編輯，從而提供了一種簡單、快速、無克隆和選擇的方法來評(píng)估這些重要病原體的基因功能。

Lander等[62]使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)以枯草芽孢桿菌的glmS基因編碼的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶內(nèi)源性標(biāo)記克氏錐蟲糖蛋白72(T.cruziglycoprotein 72，TcGP72)和液泡內(nèi)質(zhì)子焦磷酸酶(T.cruzivacuolar proton pyrophosphatase，TcVP1)。通過PCR和蛋白印跡分析證實(shí)了使用glmS核酶沉默內(nèi)源性基因的表達(dá)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下，克氏錐蟲能產(chǎn)生足夠水平的內(nèi)源性6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN6P)來刺激glmS核酶活性，而不需要向培養(yǎng)基中添加葡萄糖胺。該研究為驗(yàn)證克氏錐蟲潛在藥物靶點(diǎn)提供了一種可行的方法。

2.7 陰道毛滴蟲

性傳播的陰道毛滴蟲在全球范圍內(nèi)流行，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。由于其復(fù)雜、重復(fù)的基因組和缺乏有效方法，使其遺傳操作受到了阻礙。Janssen等[63]首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于陰道毛滴蟲，利用同源定向修復(fù)證明了Cas9-gRNA可定向修飾一個(gè)納米熒光素酶報(bào)告基因，并成功敲除了陰道毛滴蟲的2個(gè)內(nèi)源性基因，即編碼鐵氧還蛋白1(ferredoxin-1,Fd-1)的fd-1基因和編碼人類巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(migration inhibitory factor，MIF)同源物的mif基因。

陰道毛滴蟲通過附著在黏膜上皮細(xì)胞上定植于人類的泌尿生殖道，從而造成感染。Molgora等[64]報(bào)道了陰道毛滴蟲一種表面蛋白——TVAG_157210(TvAD1)的鑒定，并描述了其在陰道毛滴蟲黏附宿主中的作用，這是首次關(guān)于陰道毛滴蟲表面蛋白與宿主糖胺聚糖相互作用以啟動(dòng)寄生蟲黏附于宿主的報(bào)道。TvAD1通過與宿主糖胺聚糖(GAGs)中硫酸肝素(HS)的組成部分N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合而與宿主表面相互作用，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生了敲除(KO)TvAD1的寄生蟲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，TvAD1-KO寄生蟲對(duì)宿主細(xì)胞的黏附性顯著減少。通過在TvAD1-KO寄生蟲中過表達(dá)TvAD1使表型恢復(fù)后，與TvAD1-KO寄生蟲相比，其黏附性明顯恢復(fù)。表明TvAD1在陰道毛滴蟲黏附于宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。

2.8 犬新孢子蟲

犬新孢子蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原生動(dòng)物病原體，與剛地弓形蟲相似，但不感染人類[65-66]，其可寄生于宿主的所有有核細(xì)胞中，在入侵宿主后，犬新孢子蟲的速殖子居住在一個(gè)特殊的膜性細(xì)胞器中，稱為寄生液泡(parasitophorous vacuole，PV)。PV具有抵抗宿主細(xì)胞酸化和溶酶體酶水解的功能，從而防止宿主細(xì)胞清除外源性寄生蟲。此外，液泡內(nèi)網(wǎng)絡(luò)(intravacuolar network，IVN)增強(qiáng)了寄生蟲對(duì)宿主胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)的攝取[67]。

Arranz-Solís等[68]首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)犬新孢子蟲進(jìn)行基因組編輯，成功敲除了Nc-1蟲體中表達(dá)綠色熒光蛋白的gfp基因，并通過插入耐乙胺嘧啶盒有效破壞了分離型Nc-Spain7蟲體中的NcGRA7基因。該技術(shù)在犬新孢子蟲中的成功應(yīng)用為該寄生蟲的高效基因靶向修飾奠定了基礎(chǔ)。

Yang等[69]利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)鑒定了一種新型的致密顆粒蛋白——犬新孢子蟲顆粒蛋白17(NcGRA17)，生成了NcGRA17基因敲除蟲體(ΔNcGRA17)和NcGRA17基因互補(bǔ)蟲體(iΔNcGRA17)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ΔNcGRA17形成的斑塊較小，細(xì)胞內(nèi)生長較慢，對(duì)小鼠的毒力喪失。此外，還觀察到NcGRA17缺陷寄生蟲的PV具有異常的形態(tài)，結(jié)果表明，NcGRA17作為一種致密的顆粒蛋白決定了PV的形態(tài)和致病性，而NcGRA17的α-螺旋可能是導(dǎo)致PV形態(tài)異常的原因。

Wang等[70]利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)獲得了犬新孢子蟲Nc-1的NcGRA7敲除蟲體(ΔNcGRA7)和NcGRA7互補(bǔ)蟲體(iΔNcGRA7)，并通過一系列試驗(yàn)研究其在小鼠先天免疫中的作用，結(jié)果表明，NcGRA7在調(diào)節(jié)小鼠免疫因子和免疫相關(guān)鳥苷三磷酸酶a6(immunity-related guanosine triphosphatase a6，IRGa6)在寄生液泡膜(parasitophorous vacuole membranes,PVM)上的聚集中起著重要作用，從而影響了犬新孢子蟲的致病性。Zhao等[71]成功構(gòu)建了ΔNcGRA6蟲體，并驗(yàn)證了NcGRA6是一個(gè)關(guān)鍵的毒力因子，NcGRA6基因的破壞可減緩犬新孢子蟲的增殖，降低其對(duì)宿主的致病性。Dong等[72]構(gòu)建了ΔNcGRA2蟲體，表明NcGRA2作為一種致密的顆粒蛋白，形成了PV的液泡內(nèi)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過減緩增殖來削弱犬新孢子蟲的毒力。Yang等[73]構(gòu)建了NcGRA23和NcGRA11(a-e)敲除寄生蟲，經(jīng)研究表明，NcGRA23或NcGRA11(a-e)的缺失并不影響犬新孢子蟲的繁殖和毒力。

為了在犬新孢子蟲中實(shí)現(xiàn)高效的同源重組，Mineo等[74]針對(duì)基因組參考蟲體Nc-Liverpool (NcLiv)的Ku異源二聚體DNA修復(fù)機(jī)制，破壞了NHEJ酶Ku80，結(jié)果表明Ku80的缺失會(huì)導(dǎo)致其二聚體Ku70的不穩(wěn)定和丟失，但能獲得高效的基于CRISPR/Cas9的基因標(biāo)記和敲除。通過選擇3個(gè)基因(剛地弓形蟲分泌蛋白GRA48的犬新孢子蟲同源蛋白(NcGRA48,NCLIV_069360)、一種新的犬新孢子蟲特異性蛋白NCLIV_066730和一種新的蛋白 NCLIV_049870)進(jìn)行表位標(biāo)記來比較CRISPR/Cas9介導(dǎo)的內(nèi)源性基因的表位標(biāo)記的效率。結(jié)果表明，Δku80寄生蟲的標(biāo)記效率從Ku80存在時(shí)的20%左右提高到95%，并將第一個(gè)被鑒定出來的特異性蛋白NCLIV_066730命名為犬新孢子蟲特異性GRA蛋白1(NSG1)，而NCLIV_049870蛋白定位于寄生蟲的細(xì)胞核。

2.9 巴貝斯蟲

巴貝斯蟲是一種只在紅細(xì)胞中入侵和繁殖的蜱傳寄生蟲，對(duì)畜牧業(yè)、寵物動(dòng)物和野生動(dòng)物的健康有巨大的經(jīng)濟(jì)影響，可感染多種哺乳動(dòng)物，被認(rèn)為是僅次于錐蟲的第二常見血液寄生蟲。對(duì)藥物和殺螨劑的耐藥性以及缺乏有效的疫苗是控制巴貝斯蟲病的主要障礙[75]。

Hakimi等[76]首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于巴貝斯蟲，成功進(jìn)行了表位標(biāo)記、點(diǎn)突變和缺失。SBP3在寄生蟲感染的紅細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，并表現(xiàn)出特有的染色模式。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在sbp3基因開放閱讀框(ORF)的3′-端插入一個(gè)編碼2-myc標(biāo)簽表位的序列，經(jīng)PCR和IFAT檢測(cè)，結(jié)果表明成功標(biāo)記了sbp3基因。Tpx-1是一種細(xì)胞質(zhì)抗氧化酶過氧化物還蛋白，在其催化位點(diǎn)上具有過氧化物Cys，可減少過氧化物底物[77-79]。Hakimi等[76]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)tpx-1基因進(jìn)行點(diǎn)突變，將過氧化物Cys(Cys49)轉(zhuǎn)化為Ser，發(fā)現(xiàn)該突變對(duì)活性氮(RNS)敏感性的影響小于完全缺失Tpx-1 ORF的影響。表明除了過氧化物Cys外，還存在其他催化位點(diǎn)，可以與RNS反應(yīng)和解毒。

2.10 血吸蟲

曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)是寄生在人體的血吸蟲之一。就發(fā)病率和死亡率而言，血吸蟲病被認(rèn)為是人類蠕蟲病中最致命的一種。血吸蟲卵在疾病的發(fā)病、致病和傳播中起著核心作用[80]。

Ittiprasert等[81]首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向曼氏血吸蟲的omega-1 (ω1)基因，成功產(chǎn)生了ω1轉(zhuǎn)錄本和核糖核酸酶的缺失，該基因編碼的ω1核糖核酸酶對(duì)Th2極化和肉芽腫的形成至關(guān)重要。在巨噬細(xì)胞/T細(xì)胞共培養(yǎng)中，基因編輯的蟲卵不能極化Th2細(xì)胞因子反應(yīng)。尾靜脈注射小鼠后，ω1突變蟲卵周圍的肺肉芽腫體積明顯減少。該研究不僅在mRNA和蛋白水平上誘導(dǎo)了可檢測(cè)到的敲除，還觀察到了明確的表型變化，由此證明了基因編輯在血吸蟲功能基因組學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值。

Sankaranarayanan等[82]使用CRISPR/Cas9在曼氏血吸蟲中引入了第2個(gè)基因突變，即SULT-OR的體細(xì)胞突變。SULT-OR是曼氏血吸蟲在寄生階段表達(dá)的一種磺基轉(zhuǎn)移酶，其突變導(dǎo)致了曼氏血吸蟲對(duì)藥物奧沙尼喹的耐藥性。進(jìn)一步比較了該方法在寄生蟲的蟲卵、母孢子囊和成蟲這3個(gè)不同發(fā)育階段的效率，結(jié)果顯示，經(jīng)CRISPR/Cas9處理的成蟲中有0.3%～2.0%的序列顯示了跨越Cas9切割位點(diǎn)的缺失，而孢子囊缺失率為0.1%～0.2%，但在蟲卵中這種缺失極為罕見。在成蟲和孢子囊中最常見的缺失是預(yù)測(cè)切割位點(diǎn)上游34 bp的缺失，但也觀察到了長達(dá)3倍的罕見缺失，即從預(yù)測(cè)的Cas9切割位點(diǎn)延伸到上游102 bp。表明SULT-OR的編輯效率在成蟲中最高，其次是孢子囊，而在蟲卵中效率最低。

You等[83]報(bào)道了通過將CRISPR/Cas9與單鏈寡核苷酸(ssODNs)結(jié)合，電穿孔轉(zhuǎn)染試驗(yàn)感染小鼠肝臟中提取的蟲卵，成功編輯了曼氏血吸蟲的乙酰膽堿酯酶(AChE)基因。目標(biāo)區(qū)域下一代測(cè)序分析顯示，CRISPR/Cas9在蟲卵中誘導(dǎo)的主要修飾是通過同源定向修復(fù)產(chǎn)生的。此外，來自AChE編輯蟲卵的可溶性蟲卵抗原表現(xiàn)出明顯的AChE活性降低，表明程序化的Cas9裂解突變了AChE基因。將編輯后的血吸蟲卵注射到小鼠尾靜脈，與注射未突變蟲卵的對(duì)照組小鼠相比，注射基因編輯蟲卵的小鼠的肺細(xì)胞和脾細(xì)胞中檢測(cè)到涉及白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-10和IL-13的Th2型反應(yīng)顯著增強(qiáng)。當(dāng)基因編輯蟲卵注射到小鼠回腸漿膜下層時(shí)，蟲卵在小腸引流的腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中誘導(dǎo)Th2型反應(yīng)，IL-4、IL-13和GATA結(jié)合因子3(GATA-binding factor 3,GATA3)水平升高。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯在血吸蟲功能基因組學(xué)中的潛力和實(shí)用性。

幼蟲在中間寄主——光滑雙臍螺(Biomphalariaglabrata)中的發(fā)育是曼氏血吸蟲生命周期的一個(gè)必要的組成部分。對(duì)宿主防御機(jī)制的了解可能會(huì)加速阻斷血吸蟲病傳播工具的發(fā)展。同種異體移植物炎癥因子1(allograft infammatory factor 1,AIF)是一種保守的鈣結(jié)合蛋白，通常在吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá)，是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志。Coelho等[84]電穿孔轉(zhuǎn)染光滑雙臍螺胚胎(Biomphalariaglabrataembryonic，Bge)細(xì)胞，成功產(chǎn)生了BgAIF基因的目標(biāo)突變，且該突變通過非同源端連接修復(fù)。此外，與對(duì)照組細(xì)胞相比，基因編輯的Bge細(xì)胞與血吸蟲孢子囊的黏附明顯受阻，這為進(jìn)一步研究宿主與血吸蟲相互作用中的其他成分奠定了基礎(chǔ)。

2.11 蜱蟲

蜱蟲是專性吸血的體外寄生蟲，是人類、野生動(dòng)物和家畜多種病原體的重要載體。黑腿蜱(black-legged tick，Ixodesscapularis)，屬于硬蜱科(Ixodidae)，是一種自然疫源性疾病萊姆病的傳播媒介。僅僅在美國，每年就有超過4萬例萊姆病病例報(bào)告，而實(shí)際感染人數(shù)可能超過30萬例[85]。蜱蟲卵很特殊，其卵內(nèi)高壓，還具有堅(jiān)硬的絨毛膜；此外，雌性蜱蟲通過一種稱為吉氏器(Gene’s organ)的特殊器官在卵上涂上一層堅(jiān)硬的蠟層，使卵相互黏結(jié)在一起。這一系列因素使得通過胚胎注射對(duì)蜱蟲進(jìn)行基因編輯的技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)。

Sharma等[86]首次成功在黑腿蜱中進(jìn)行了CRISPR/Cas9基因編輯，其使用了2種方法對(duì)蜱蟲進(jìn)行基因編輯：一種方法是直接進(jìn)行胚胎注射CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，注射后卵的存活率大約只有10%；另一種方法為ReMOT控制(receptor-mediated ovary transduction of cargo,ReMOT Control)，被稱為受體介導(dǎo)的卵巢轉(zhuǎn)導(dǎo)，其將Cas9 RNP復(fù)合物直接從血腔傳遞到發(fā)育中的節(jié)肢動(dòng)物生殖系，允許通過成蟲注射而不是胚胎微注射產(chǎn)生靶向和遺傳突變。首先通過顯微手術(shù)切除雌性蜱蟲的吉氏器，從而使得蜱蟲產(chǎn)的卵不再被蠟層包裹，并用苯扎氯銨和氯化鈉處理卵，以去除絨毛膜并使卵干燥以降低卵內(nèi)壓力，這樣就更易向其注射CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，注射后卵的存活率高達(dá)100%。該研究將為蜱蟲生物學(xué)和蜱蟲-病原體-宿主的研究開辟新的途徑。

2.12 蚊

2.12.1 伊蚊 埃及伊蚊(Aedesaegypti)是基孔肯雅熱、黃熱病和登革熱病毒的有效傳播媒介，每年造成數(shù)億人感染和5萬多人死亡[87]。埃及伊蚊的基因突變已用TALENs、ZFNs和歸巢內(nèi)切酶建立起來，這需要DNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的工程來提供基因組靶標(biāo)序列的特異性，而這些蛋白很難設(shè)計(jì)。Dong等[88]在一個(gè)同時(shí)表達(dá)紅色熒光蛋白(DsRed)和增強(qiáng)青色熒光蛋白(ECFP)的轉(zhuǎn)基因蚊子系中，針對(duì)ECFP核苷酸序列進(jìn)行破壞，當(dāng)提供Cas9酶和2種靶向ECFP基因不同區(qū)域的sgRNAs作為體外轉(zhuǎn)錄的mRNA用于種系轉(zhuǎn)化時(shí)，個(gè)體仍然表達(dá)DsRed，但不再表達(dá)ECFP。經(jīng)PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序發(fā)現(xiàn)ECFP靶基因包含2～27個(gè)核苷酸。這些結(jié)果首次表明，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯可在埃及伊蚊中實(shí)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究該蚊種的功能基因組學(xué)提供了參考。為了產(chǎn)生穩(wěn)定的生殖系突變，Kistler等[89]將CRISPR/Cas9試劑顯微注射到胚前期胚胎(細(xì)胞化前由細(xì)胞核合胞體組成的胚胎)，為體細(xì)胞和生殖系細(xì)胞的細(xì)胞核提供基因組編輯試劑。其進(jìn)一步研究了顯微注射混合成分的編輯效率，證明了CRISPR/Cas9通過不同的修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生不同類型突變的能力，并報(bào)告了幾個(gè)基因組位點(diǎn)的穩(wěn)定的種系突變。

2.12.2 按蚊 在約450種按蚊中約有60種被認(rèn)為是人類瘧疾的傳播媒介，是重要的寄生蟲病病原[90]。Dong等[91]建立了改良的瘧疾傳播媒介岡比亞按蚊(Anophelesgambiae) 的CRISPR/Cas9基因編輯程序，研究了纖維蛋白原相關(guān)蛋白1(FREP1)失活對(duì)蚊子對(duì)瘧原蟲的敏感性和對(duì)蚊子適應(yīng)度的影響。FREP1基因敲除突變體發(fā)展成成蚊，在卵囊和子孢子階段顯示出對(duì)人類和嚙齒動(dòng)物瘧疾寄生蟲感染的明顯抑制。然而，F(xiàn)REP1基因失活對(duì)蚊子適應(yīng)度也產(chǎn)生了影響，包括顯著降低吸血傾向、繁殖力和卵孵化率，化蛹時(shí)間延遲及吸血后壽命縮短?；贑RISPR/Cas9基因操縱蚊子(特別是按蚊)的胚胎注射方法是困難和低效的，Macias等[92]采用ReMOT控制(受體介導(dǎo)的卵巢轉(zhuǎn)導(dǎo))技術(shù)將Cas9核糖核蛋白復(fù)合物傳遞到成蚊卵巢，在不注射胚胎的情況下在瘧疾傳播媒介斯氏按蚊(Anophelesstephensi)中產(chǎn)生了靶向突變和可遺傳突變。在按蚊中，ReMOT控制的基因編輯效率與標(biāo)準(zhǔn)胚胎注射一樣高。ReMOT控制對(duì)按蚊的應(yīng)用為缺乏胚胎注射設(shè)備或?qū)I(yè)知識(shí)的瘧疾實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展了CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用，建立了針對(duì)不同種類蚊子的ReMOT控制的靈活性。

3 小 結(jié)

CRISPR/Cas9技術(shù)自2013年發(fā)展以來，已被應(yīng)用于多種研究領(lǐng)域中，如通過基因的敲入與敲除、DNA單堿基突變對(duì)基因進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，從而提高某些植物的產(chǎn)量與抗病性、構(gòu)建動(dòng)物疾病模型、治療疾病等。然而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在寄生蟲研究領(lǐng)域中仍有許多不足，主要有以下幾個(gè)方面：①當(dāng)前較為成功的研究案例大多來自原蟲，且已在功能基因研究和疫苗研究方面取得進(jìn)展，但其他多細(xì)胞寄生蟲的基因組編輯研究進(jìn)展較為緩慢，僅有血吸蟲的研究報(bào)道，其原因可能是原蟲是單細(xì)胞，且大多可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室傳代，易于操作，而多細(xì)胞寄生蟲生活史復(fù)雜，在蟲體發(fā)育過程中很難找到易于進(jìn)行基因編輯的單細(xì)胞期；②與原蟲基因編輯效率相比，多細(xì)胞寄生蟲編輯效率較低，其原因可能是多細(xì)胞寄生蟲發(fā)育周期復(fù)雜，不同發(fā)育階段蟲體組織結(jié)構(gòu)變化大，不可控因素較多；③基因編輯的脫靶突變現(xiàn)象等問題。因此，需進(jìn)一步優(yōu)化技術(shù)方案，以盡快實(shí)現(xiàn)更多多細(xì)胞寄生蟲的基因組編輯，進(jìn)而加快基因功能解析、藥物及疫苗研發(fā)的進(jìn)程。

隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)的不斷發(fā)展與改進(jìn)，其可能在寄生蟲基因組規(guī)模的功能注釋中也發(fā)揮重要作用。在不久的將來，該技術(shù)可能被廣泛應(yīng)用于寄生蟲轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的后續(xù)研究，可更好地理解基因組功能、表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，為臨床檢測(cè)、早期診斷和疾病預(yù)防等方面的應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，從而有效防治寄生蟲病，促進(jìn)人類健康。