精子DNA損傷機(jī)制的研究進(jìn)展

盧慧鈺，姚文亮，周玉良，蔣婉雪，虞穎綠，江超仁，陳勝輝*（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬生殖醫(yī)院/江西省中醫(yī)男科疾病重點(diǎn)研究室，江西 南昌 330001）

攜帶遺傳物質(zhì)的基因組序列信息位于DNA 上，受精時(shí)，精子將細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)傳遞給卵母細(xì)胞，并與卵母細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行融合形成二倍體受精卵，發(fā)育成胚胎延續(xù)下一代。因此，保護(hù)精子DNA的完整性對生命的延續(xù)至關(guān)重要。

1 精子DNA損傷的介紹

廣義上，精子DNA損傷包括線粒體DNA損傷和核DNA 損傷，狹義上是指核DNA 損傷。評價(jià)精子DNA 完整性的指標(biāo)主要用精子DNA 碎片化指數(shù)（DFI）來表示，檢測的是DNA 單鏈斷裂（SSB）和雙鏈斷裂（DSB）。SSB 和DSB 是目前公認(rèn)的精子DNA 損傷形式［1］，但精子DNA 損傷并不意味著SSB 或DSB，Agarwal 等認(rèn)為DNA 損傷的類型包括復(fù)制過程中堿基錯(cuò)配，無堿基位點(diǎn)，堿基修飾（氧化，烷基化，脫氨基），加合物和鏈內(nèi)交聯(lián)，嘧啶二聚體以及SSB 和DSB[2]。因此，精子DNA 損傷不等同于精子DNA 片段化，現(xiàn)有的檢測精子DNA 損傷的方式也沒有檢測到所有的精子DNA損傷。

2 精子DNA損傷的原因

人體的新陳代謝活動(dòng)和外界環(huán)境均可導(dǎo)致精子DNA發(fā)生損傷，分為內(nèi)源性因素和外源性因素。

2.1 內(nèi)源性因素精子 DNA 損傷修復(fù)失敗。DNA按堿基配對進(jìn)行復(fù)制是一個(gè)嚴(yán)格而精確的事件，但并不是不會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤。為保證遺傳物質(zhì)的完整和穩(wěn)定，DNA損傷修復(fù)機(jī)制發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但其并不能修復(fù)所有損傷。相比其他細(xì)胞，成熟精子DNA 損傷修復(fù)能力較低［3］，這可能是由于精子核DNA 高度濃縮，抑制了DNA 轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。DFI 隨著年齡增加而升高［4］，且損傷修復(fù)機(jī)制的能力會(huì)隨年齡的增加而呈現(xiàn)下降趨勢［5］。同源重組是修復(fù)二倍體細(xì)胞DSB 的最好方式。而精子是單倍體細(xì)胞，相比其他細(xì)胞，其損傷修復(fù)機(jī)制更弱［6］。卵母細(xì)胞也能修復(fù)精子DNA 的部分損傷，其修復(fù)的程度與卵母細(xì)胞的質(zhì)量有關(guān)，年齡是影響質(zhì)量的一個(gè)因素。與精子DNA 損傷修復(fù)機(jī)制一樣，卵母細(xì)胞修復(fù)精子DNA損傷的能力也隨著年齡的增加而下降［7］。Salehi 等研究也發(fā)現(xiàn)未成熟卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)成熟后，其不能修復(fù)高水平的精子DNA 損傷且會(huì)影響胚胎的質(zhì)量［8］。這些未能完全修復(fù)而存留下來的DNA損傷可能會(huì)在適宜的條件下表現(xiàn)出負(fù)面的影響。

2.2 外源性因素

2.2.1 精子冷凍損傷 精子凍融過程中極易受到化學(xué)和機(jī)械性損傷。低溫狀態(tài)下精子DNA 損傷會(huì)更加敏感。崔艷穎等［9］發(fā)現(xiàn)牛精子DNA完整性會(huì)隨著冷凍時(shí)間的延長而逐漸下降，最終影響受精能力。精液冷凍保存時(shí)產(chǎn)生的活性氧（ROS)可以破壞精子細(xì)胞核中的DNA結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞凋亡。馬曉萍等［10］發(fā)現(xiàn)不育患者的精液在解凍后精子凋亡率比冷凍前高。

2.2.2 生殖道感染 對衣原體感染的小鼠輸精管的精子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA 損傷的水平增加[11]。生殖道感染可增加精液中的白細(xì)胞數(shù)量，當(dāng)每毫升的精液中超過1×106個(gè)白細(xì)胞時(shí)，則導(dǎo)致白細(xì)胞精液癥的發(fā)生。研究表明[12]，過多的白細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致精子DNA完整性受損。這可能是由于白細(xì)胞導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激（OS）的發(fā)生，損傷了精子的DNA。

2.2.3 環(huán)境污染和不健康生活方式 環(huán)境中具有生殖毒性的物質(zhì)可損傷精子DNA。以多溴聯(lián)苯醚(PBDES)為例，PBDES是一種優(yōu)良的阻斷劑，廣泛應(yīng)用于紡織、家用器具、建筑材料等領(lǐng)域，對生物和人體具有毒害效應(yīng)。PBDES 可以通過損害精子DNA、生殖細(xì)胞功能等影響男性生殖功能［13］。產(chǎn)前暴露于PBDES會(huì)導(dǎo)致雄性后代的精子DNA損傷［14］。不健康的生活方式有吸煙、喝酒、熬夜、久坐等。以吸煙為例，DFI與吸煙呈正相關(guān)關(guān)系［15］，對不育的吸煙患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其DFI 增高［16］。吸煙對精子DNA 損傷的機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，可能是由于香煙煙霧中有許多對人體有毒害作用的成分，如尼古丁、焦油、一氧化碳等，與機(jī)體產(chǎn)生了生殖毒性作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)，吸煙患者中的激酶1（Chk1）表達(dá)下降，而Chk1的表達(dá)與精子DNA 損傷和發(fā)生凋亡相關(guān)，其減少可能導(dǎo)致精子損傷修復(fù)機(jī)制的下降和精子凋亡增加［17］。

3 精子DNA損傷的起源機(jī)制

關(guān)于精子DNA 損傷的起源，目前比較支持的是精子細(xì)胞凋亡、精子染色質(zhì)成熟受損、氧化應(yīng)激三個(gè)方面［18-19］。

3.1 精子細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，一個(gè)顯著的特征就是染色體DNA的降解。睪丸生殖細(xì)胞的凋亡是維持睪丸穩(wěn)態(tài)所需要的基本且復(fù)雜的過程，為控制正常生殖細(xì)胞的數(shù)目和質(zhì)量起著重要的作用。生殖細(xì)胞的凋亡一般發(fā)生在生精過程的某個(gè)特定階段，然后由吞噬細(xì)胞將其清除。若發(fā)生不正常的精子凋亡而沒有及時(shí)被清除，異常精子數(shù)量就會(huì)增多。研究表明［20］，精子射精后具有細(xì)胞凋亡的能力，這種能力可致線粒體完整性受損、核被膜缺陷和核碎裂的凋亡跡象，影響受精潛能。Fas系統(tǒng)（Fasl、Fas）的是一種廣泛認(rèn)可的細(xì)胞凋亡途徑，F(xiàn)as 配體（Fasl)與Fas 受體表達(dá)陽性的細(xì)胞結(jié)合能導(dǎo)致其發(fā)生凋亡。對小鼠進(jìn)行研究，證實(shí)Fas / Fasl 的高表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)其睪丸細(xì)胞發(fā)生凋亡［21］。不育組男性中檢測到Fas 表達(dá)陽性而在可育組中未檢測到［22］。

3.2 精子 染色質(zhì)受損與其他體細(xì)胞核不同，為保證精子的遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，降低在傳輸過程中受到的損害，精子核染色質(zhì)呈高度濃縮，抑制基因的表達(dá)[23]。濃縮涉及到精子的重塑，DNA 雙鏈先進(jìn)行生理性的斷裂，斷裂位點(diǎn)在各種DNA 聚合酶的作用重新結(jié)合，這一過程過渡蛋白會(huì)替代大部分的組蛋白，染色質(zhì)組織被改變，然后由魚精蛋白取代過渡蛋白[24]。濃縮是成熟精子核DNA與魚精蛋白緊密結(jié)合的結(jié)果，因?yàn)轸~精蛋白比組蛋白更小，可以提高精子DNA的濃度。若精子發(fā)生過程中發(fā)生組蛋白修飾異常和魚精蛋白的缺陷，則可能會(huì)出現(xiàn)精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。且精子細(xì)胞中魚精蛋白1 與魚精蛋白2 的比值下降會(huì)導(dǎo)致DFI的上升［25］。

3.3 氧化應(yīng)激 Bisht［26］認(rèn)為精子DNA 損傷的主要是由氧化應(yīng)激（OS）導(dǎo)致的。一定的活性氧（ROS）對機(jī)體有好處，但過多會(huì)使機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)失去平衡，導(dǎo)致OS。OS 能破壞精子的功能和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致精子易碎的敏感性增加。不同于其他細(xì)胞，精子細(xì)胞膜富含不飽和脂肪酸，且精子細(xì)胞在變形過程中脫落了大部分的細(xì)胞質(zhì)，因此更易受OS損傷［27］。OS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生了醛，損壞精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使精子核DNA 直接暴露于精漿中。線粒體是ROS 的一個(gè)重要來源，超水平的ROS會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA（mtDNA）的突變。在存在生育問題的男性中發(fā)現(xiàn)mtDNA突變也證實(shí)了這一點(diǎn)［28］。

4 精子DNA損傷檢測在臨床男科應(yīng)用的挑戰(zhàn)

常規(guī)用于精子DNA 碎片的檢測方式主要有四種，TUNEL、SCSA、SCD、Comet。到目前為止，DFI 仍沒有作為各大生殖中心的一個(gè)常規(guī)檢測［29］。美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)也不推薦將DFI作為評估男性不育的常規(guī)檢測應(yīng)用于臨床［30］。對于DFI在輔助生殖男科中應(yīng)用困難，我認(rèn)為主要有以下幾點(diǎn)：（1）目前仍沒有一個(gè)指南明確規(guī)定精子DNA 的檢測方法，也沒有明確參數(shù)的閾值。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間使用的檢測方法不同，這可能導(dǎo)致評估精子DNA 完整性的方法不能可靠地預(yù)測對殖結(jié)局的影響。（2）每個(gè)精子DNA 損傷的檢測方法都是有側(cè)重點(diǎn)的。有薈萃分析表明，在評估精子DNA完整性的測量方法中，TUNEL和Comet 相比SCSA 和SCD 來說，準(zhǔn)確度更高，這有可能是因?yàn)榍罢呤褂玫氖侵苯訙y定的方法，而后者是間接測定［31］。（3）常規(guī)的檢測方法主要是對精子染色質(zhì)SSB 和DSB 的檢測，其可能只是發(fā)現(xiàn)了小部分的精子DNA 損傷。這些測試中的每一個(gè)都提供了DNA總體狀態(tài)的半定量估計(jì)（TUNEL、Comet），但沒有提供可能受到影響的特定DNA序列的指示。

5 精子DNA碎片對妊娠結(jié)局的影響

雖然Green 等［32］認(rèn)為ICSI受精當(dāng)日的精子DNA損傷程度與臨床妊娠率無關(guān)。但研究表明［33］，通過DFI 值可以挑選出不適合用于輔助生殖的精子，且DFI 可用于評估男性不育［34］。高DFI 雖沒最終決定胚胎的質(zhì)量，但會(huì)導(dǎo)致早期胚胎細(xì)胞分裂的延遲［35］。與之相反的是，Simon等［36］薈萃分析有足夠的證據(jù)表明精子DNA 損傷對于輔助生殖臨床妊娠結(jié)局具有負(fù)面的影響。精子DNA 損傷會(huì)降低胚胎質(zhì)量且增加ICSI 周期中植入失敗的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致臨床妊娠率下降［37］。金保方［38］還認(rèn)為，精子DNA 損傷是造成復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）的一個(gè)相關(guān)因素。

6 治療

對于精子DNA 損傷的治療，至今無特效藥物，也沒有公認(rèn)的治療方案。

6.1 中醫(yī)治療 從精子染色質(zhì)損傷后對生殖結(jié)局的影響來看，可歸于中醫(yī)學(xué)上的“無子”、“難嗣”等范疇，腎主生殖，總體上離不開從腎論治。吳堪助等［39］認(rèn)為精子染色質(zhì)損傷屬腎陰虧虛，以滋陰補(bǔ)腎為法，研究左歸丸加味治療精子染色質(zhì)損傷，發(fā)現(xiàn)其能降低DFI。姚文亮等［40］認(rèn)為精子DNA損傷與腎功能失調(diào)有關(guān)，運(yùn)用補(bǔ)腎強(qiáng)精顆粒治療，能顯著改善精子DNA損傷。腎虛日久可致瘀，門波以溫腎填精、祛瘀生精為法，以補(bǔ)腎生精方加減治療不育癥患者，能顯著降低DFI［41］。綜上醫(yī)家通過補(bǔ)腎填精，兼活血化瘀等方面治療男性不育，可降低DFI。近代的藥理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎和活血的藥物具有抗氧化作用，可清除機(jī)體過多的ROS，中藥的作用可能是通過降低OS改善DNA損傷治療男性不育。

6.2 西醫(yī)治療 目前對于精子DNA 損傷的治療主要是抗氧化劑的使用，抗氧化劑的補(bǔ)充有利于應(yīng)對OS 帶來的損害。Smits 等［42］薈萃分析表明，在生育能力較弱的男性中補(bǔ)充抗氧化劑，可以提高胎兒的活產(chǎn)率。左卡尼?。ㄗ笮舛緣A）是一種抗氧化劑，商學(xué)軍等［43］運(yùn)用左卡尼汀治療男性不育，發(fā)現(xiàn)其對精子DNA 有良好的保護(hù)作用。維生素和微量元素中很多也具有抗氧化作用。在精子冷凍保護(hù)劑中添加維生素E 能夠緩解凍融過程中對精子的損害，一定程度上能夠提高精子DNA的完整性［44］。鋅療法能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激損傷，降低精子DNA 損傷［45］。

除了藥物方面的治療外，生活方式的改變也可降低DNA 損傷，Bisht 認(rèn)為OS 可由多種因素導(dǎo)致，生活方式的干預(yù)，例如瑜伽和冥想都可降低氧化損傷，進(jìn)而降低DFI［26］。

現(xiàn)有的研究支持精子DNA 損傷對妊娠結(jié)局存在影響，DFI 數(shù)值正成為解釋男性不明原因不育的有力工具。雖然臨床上對于精子DNA 損傷仍沒有特效的藥物與特定的治療方案，但了解其發(fā)生的原因與機(jī)制，有助于我們在未來尋求合適的治療方法，對男性不育患者的臨床治療有重要意義。