楊洲 高靜媛 田發(fā)明

1.華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，河北 唐山 063000 2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，河北 唐山 063000 3.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心，河北 唐山 063000

骨穩(wěn)態(tài)是由骨形成和骨吸收活動組成的動態(tài)平衡過程，調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的細胞群被稱為基本多細胞單位(basic multicelluler unit，BMU)[1]。BMU主要由處于不同分化階段的成骨細胞譜系和破骨細胞譜系的細胞組成[2]。成骨細胞系衍生自骨髓間充質(zhì)干細胞，破骨細胞系衍生自造血干細胞。在病理條件下，骨穩(wěn)態(tài)被破壞，高破骨細胞活性或低成骨細胞活性導(dǎo)致低骨量表型，而低破骨細胞活性或高成骨細胞活性導(dǎo)致高骨量表型[3]。Wnt信號通路是調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵信號通路之一[4]，但其Wnt配體具有多樣性，且成骨細胞、骨細胞、軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的Wnt配體亞型不盡相同，明確Wnt信號通路對上述細胞功能調(diào)控及其在調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和體內(nèi)平衡中的作用，有望為相關(guān)骨骼疾病的防治提供新的思路和靶點。

1 Wnt/β-catenin信號通路概述

Wnt蛋白家族有19種分泌型糖蛋白，可以根據(jù)是否依賴β-catenin大致分為經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt信號通路。Wnt信號通路在多種細胞活動中發(fā)揮重要作用，包括細胞增殖、分化、遷移、極性和基因表達[5]。

經(jīng)典的Wnt途徑，即β-catenin依賴途徑，它是由經(jīng)典的Wnt配體(Wnt3a、Wnt1、Wnt7b)與Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)結(jié)合導(dǎo)致胞內(nèi)β-catenin積聚，當β-catenin積聚到一定量時就會轉(zhuǎn)位到細胞核與轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子/淋巴增強因子結(jié)合因子(TCF/Lef)位點結(jié)合，從而激活下游的靶基因表達[6]。Wnt信號通路還受到抑制劑的調(diào)節(jié)，如分泌性型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)、DKK(Dickkopf)和骨硬化蛋白(sclerostin，SOST)?；诖罅矿w外和體內(nèi)研究的證據(jù)表明，經(jīng)典的Wnt途徑對于骨量的增加和維持具有重要作用[7]。

與依賴β-catenin的經(jīng)典Wnt通路相比，非經(jīng)典Wnt信號通路能夠激活獨立于β-catenin的信號通路，在一些情況下還可以抑制路經(jīng)典的Wnt途徑。非經(jīng)典Wnt信號通路進一步被分為平面細胞極性(PCP)通路和Wnt/Ca2+通路。最近越來越多的研究表明，非經(jīng)典的Wnt信號在成骨細胞分化和骨形成中起重要作用。在Wnt/Ca2+通路中，有研究證明非經(jīng)典的Wnt5A配體誘導(dǎo)CaMKII-TAK1-TAB2-NLK信號，通過染色質(zhì)失活在轉(zhuǎn)錄水平上抑制PPARc反式激活，并誘導(dǎo)Runx2表達，從而抑制小鼠基質(zhì)細胞ST2的脂肪生成而促進成骨細胞分化[8]。在PCP通路中，有研究證明JNK信號通路在人和大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中都被認為具有促進成骨細胞分化和抑制脂肪細胞分化的作用[9]。

2 人類骨骼疾病中的Wnt/β-catenin信號通路

1994年Liu[10]等首次發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路與骨骼發(fā)育有關(guān)，即全身敲除Wnt3a的小鼠胚胎表現(xiàn)出前后軸向發(fā)育的缺陷。骨質(zhì)疏松-假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征(OPPG)是一種與骨量急劇減少相關(guān)的罕見綜合征，有文獻報道在OPPG的患者中檢測到LRP5基因的純合突變(例如R428X、E485X、D490fs)[11]。該基因的錯義突變抑制了兩種內(nèi)源性的Wnt配體拮抗劑DKK和SOST與LRP5的結(jié)合，從而激活了Wnt信號通路的表達。隨后的研究也證明了LRP5/6和其他Wnt信號傳導(dǎo)成分的錯義突變都會影響骨量和骨強度。例如，在家族性骨質(zhì)疏松癥和早發(fā)性冠狀動脈疾病的患者中檢測到了LRP6基因的雜合突變，早發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者發(fā)生了Wnt1基因的雜合突變，成骨不全癥(osteogenesis imperfecta，OI)患者發(fā)生了Wnt1基因的純合突變[12]。此外，SFRP4的純合突變也會引起Pyle病，其特征是肢體畸形、皮質(zhì)骨變薄和骨折[13]。除上述罕見突變外，CTNNB1、WLS、SOST、WNT4和WNT16位點中與BMD相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)也與骨折風(fēng)險略有增加相關(guān)[14]。因此，上述Wnt/β-catenin信號分子中的罕見突變和常見變異都導(dǎo)致了低骨量表型及骨質(zhì)量下降，提示對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)的關(guān)鍵基因的干預(yù)可用于相關(guān)骨骼疾病的治療。

此外，Wnt信號通路中不同基因的突變除了會導(dǎo)致人類骨骼疾病的低骨量表型也可導(dǎo)致高骨量表型。例如，SOST基因突變可引起骨硬縮癥和Van Buchem病，表現(xiàn)出高骨量相關(guān)的骨表型。SOST是內(nèi)源性的Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑，可與LRP5和LRP6結(jié)合，進而阻止LRP5/6與Wnt配體的結(jié)合導(dǎo)致Wnt/β-catenin途徑被抑制[15]。最近有研究明確表明，LRP5/6與SOST的相互作用在生理和病理條件下的骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[16]。

3 利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型評估Wnt/β-catenin在骨穩(wěn)態(tài)中的作用

為明確Wnt信號通路調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的細胞和分子基礎(chǔ)，目前已有研究構(gòu)建了多種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，即通過具有β-catenin(由Ctnnb1基因編碼)、Wnt配體和Wnt受體基因修飾的轉(zhuǎn)基因小鼠來評估Wnt信號通路在骨穩(wěn)態(tài)中的作用。

3.1 β-catenin

遺傳學(xué)研究通過在成骨細胞發(fā)育的不同階段條件下敲除β-catenin，提示W(wǎng)NT/β-catenin信號通路對骨穩(wěn)態(tài)的影響在細胞的發(fā)育階段起作用。例如，在成骨細胞分化的早期階段，靶向敲除MSCs中的β-catenin小鼠通過下調(diào)與成骨分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Osterix的表達，抑制成骨細胞分化進而導(dǎo)致骨量下降[17]。成骨前體細胞靶向敲除β-catenin小鼠，分化成熟的成骨細胞活性喪失，同時促進破骨細胞和骨髓脂肪形成進而導(dǎo)致骨量下降[18]。成熟成骨細胞或骨細胞中β-catenin的條件性敲除間接增加了破骨細胞的數(shù)量和活性，但對成骨細胞沒有顯著影響，而在相同條件下結(jié)構(gòu)性激活β-catenin會顯著增加骨沉積，減少破骨細胞的形成[19]，并且組織學(xué)分析也表明這些突變主要影響骨吸收而不是骨形成。為了進一步闡明β-catenin對破骨細胞的具體作用，有研究證明破骨細胞中β-catenin的組成性活化小鼠，促進破骨細胞生成，骨吸收增加進而導(dǎo)致低骨量表型[20]。這些發(fā)現(xiàn)表明β-catenin信號在出生后骨穩(wěn)態(tài)中起重要作用。

3.2 Wnt配體

Wnt蛋白是一種富含半胱氨酸的高度疏水性蛋白，需要進行脂質(zhì)修飾來促進其分泌。Wnt蛋白的脂質(zhì)修飾由Porcn蛋白處理，Porcn蛋白是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)合O酰基轉(zhuǎn)移酶(MBOAT)家族中的成員，是一種多次跨膜蛋白。脂質(zhì)修飾后的Wnt蛋白由另一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Wntless/GPR177蛋白識別，隨后Wnt配體被到運輸?shù)郊毎砻娣置赱21-22]。

已經(jīng)有研究利用Porcn或Wntless來解決Wnt配體家族介導(dǎo)骨發(fā)育或骨穩(wěn)態(tài)過程的相關(guān)問題。當GPR177在成熟的成骨細胞靶向敲除時，小鼠骨量降低，證明了Wnt配體在調(diào)節(jié)出生后骨骼發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，當在成骨細胞和軟骨細胞靶向敲除GPR177時，軟骨發(fā)育受到影響，出現(xiàn)更嚴重的骨表型[23]。因此仍然需要進行大量研究證明不同組織來源的Wnt配體在骨穩(wěn)態(tài)的作用，并且需要找到一種區(qū)分經(jīng)典或非經(jīng)典的Wnt配體的在骨穩(wěn)態(tài)中作用的方法。

3.2.1經(jīng)典Wnt配體：在經(jīng)典的Wnt配體中，Wnt7b和Wnt10b的研究較為廣泛。在骨祖細胞中條件性的敲除Wnt7b會導(dǎo)致骨化延遲[24]，而在成熟的成骨細胞靶向激活Wnt7b的表達，表現(xiàn)出高骨量表型，該表型始于晚期胚胎，并在出生后加劇[25]。這項研究證明Wnt7b主要通過刺激成骨細胞數(shù)量和活性來增加骨量，對破骨細胞活性沒有顯著作用。在骨髓中過表達Wnt10b的轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Dlx5和Osterix表達上調(diào)表現(xiàn)出高骨量表型，而在相同條件下敲除Wnt10b的小鼠骨小梁和血清的骨鈣素減少，從而證實Wnt10b是骨形成的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑[26]。為了進一步研究Wnt10b在骨穩(wěn)態(tài)中的作用，在成熟成骨細胞過表達Wnt10b小鼠，同樣表現(xiàn)出高骨量表型，在該動物模型中，Wnt10b主要通過刺激成骨細胞生成來增加骨量，并未對破骨細胞產(chǎn)生影響[27]。因此，筆者推測Wnt10b主要是通過促進成骨細胞分化來調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)。此外，最近的研究結(jié)果顯示，WNT1突變與某些類型的成骨不全癥有關(guān)，強調(diào)了Wnt1在正常的骨骼發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的重要性[28]。建立全身或靶向MSCs的Wnt1敲除小鼠，成骨細胞分化能力下降，表現(xiàn)出低骨量表型，模仿了人類WNT1純合突變的OI表型[29]。在骨細胞中靶向敲除Wnt1同樣也表現(xiàn)出了低骨量表型，出現(xiàn)自發(fā)性骨折與OI患者相似，而在骨細胞中過表達Wnt1通過增加成骨細胞數(shù)量和活性刺激骨形成，此作用部分歸因于mTORC1信號的激活[30]。因此，筆者推測Wnt1主要是通過調(diào)節(jié)成骨細胞功能而有助于骨穩(wěn)態(tài)。因為已知在骨穩(wěn)態(tài)中的表達多個Wnt和FZD，很可能功能冗余掩蓋了這些因子在體內(nèi)的相對重要性。Porcn和GPR177基因是Wnt生產(chǎn)細胞分泌Wnt配體的特有基因，可能有助于解決這些問題。

3.2.2非經(jīng)典WNT配體：在非經(jīng)典的Wnt中，Wnt5a的研究最為廣泛，在胚胎骨骼發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，Wnt5a與受體酪氨酸激酶樣孤兒受體(Ror)1/2結(jié)合，以激活非經(jīng)典的Wnt信號通路，包括Ca2+、蛋白激酶C激活和平面細胞極性(PCP)途徑激活[31]。Oishi等[32]研究發(fā)現(xiàn)，與敲除Fzs基因的小鼠相比，Ror2基因敲除小鼠與Wnt5a基因敲除小鼠的表型更為相似，都表現(xiàn)為身材矮小、顏面畸形、四肢和尾巴短小以及呼吸功能障礙。Wnt5a基因敲除小鼠表現(xiàn)出骨形成減少，脂肪生成增強，骨生成受損。因此，Wnt5a信號的特異性激活在骨形成中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。最近，顯示成骨細胞衍生的Wnt5a增強破骨細胞生成通過在破骨細胞前體的表面上結(jié)合Ror2來激活Jun N末端激酶(JNK)，然后增加核因子κβ(RANK)表達的受體激活劑。但是，Wnt5a可能以依賴單元上下文的方式發(fā)揮其作用[33]。此外，Wnt16基因敲除小鼠的骨皮質(zhì)厚度顯著降低，增加了骨折易感性[34]。Wnt16主要由成骨細胞譜系產(chǎn)生，在皮質(zhì)骨的骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，其作用機理是直接作用于破骨細胞祖細胞，而間接地通過增加成骨細胞中骨保護素(Opg)的表達來抑制人和小鼠的破骨細胞生成[34]。但是還是需要做更多的工作以評估其下游途徑介導(dǎo)這些效應(yīng)。因此，Wnt配體與骨細胞代謝之間的聯(lián)系已逐步確認并成為本領(lǐng)域研究的熱點問題之一。

4 Wnt信號通路在人類骨骼疾病治療中的前景

基于Wnt/β-catenin信號對骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，該信號通路的關(guān)鍵信號分子或其相應(yīng)的調(diào)節(jié)劑已成為開發(fā)骨丟失相關(guān)疾病治療藥物的新靶點。SOST和DKK1是內(nèi)源性經(jīng)典Wnt拮抗劑，可直接抑制成骨細胞生成以及間接促進破骨細胞生成，并分別參與骨質(zhì)疏松癥和癌癥相關(guān)的骨溶解的發(fā)病機制。由于SOST和DKK1是Wnt信號通路作用于骨穩(wěn)態(tài)失衡疾病的合理靶標，有研究證明已開發(fā)了抗SOST單克隆抗體(Romosozumab、Blosozumab和BPS804)，抗DKK1單克隆抗體(BHQ880、DKN-01和PF-04840082)和針對SOST和DKK1的雙特異性抗體(Hetero-DS)[35]。

Romosozumab是Wnt/β-catenin信號通路中研究最廣泛的藥物，多項臨床三期試驗和臨床應(yīng)用已經(jīng)證實，與安慰組相比，Romosozumab可以顯著增加絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性患者骨密度，降低椎體骨折和臨床骨折發(fā)生率。由于該藥物在安全性方面出現(xiàn)了嚴重心血管不良事件，因此，Romosozumab在日本、歐美僅被批準用于治療伴有很高的骨折風(fēng)險，且沒有心臟病發(fā)作、心肌梗死或中風(fēng)的病史的嚴重絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中。由于其上市時間較短，Romosozumab治療骨質(zhì)疏松癥的有效性和安全性還需要進一步的評估。

Blosozumab和BPS804也已經(jīng)應(yīng)用于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥患者的臨床二期試驗中。與安慰劑組相比，Blosozumab和BPS804治療組顯著增加了骨密度、骨形成的標志物，同時減少了骨吸收標志物、骨折發(fā)生率降低，為后續(xù)3期試驗鋪平了道路。而BHQ880和DKN-01在患有多發(fā)性骨髓瘤和其他實體瘤(例如膽管癌、食道癌和胃癌)的患者中也進行了一期臨床試驗[35]，并顯示出良好的抗腫瘤效果。

綜上所述，Wnt/β-catenin對成骨細胞和或破骨細胞的功能調(diào)控及平衡在骨發(fā)育及骨穩(wěn)態(tài)維持中均發(fā)揮重要作用，針對該信號通路的相關(guān)調(diào)控分子或小分子有望作為相關(guān)骨骼疾病的治療藥物，但以SOST和DKK1為靶點的小分子藥物的安全性、干預(yù)節(jié)點及使用策略等，尚需更多的臨床試驗驗證和確定。