萬光明 薛 瑢
糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,隨著糖尿病患病率的不斷增加,DR已成為全球致盲尤其是工作年齡人群視力障礙的主要原因之一[1]。視網(wǎng)膜微血管功能障礙作為DR發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制與機(jī)體葡萄糖代謝的諸多途徑密切相關(guān),如多元醇途徑、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)途徑、己糖胺生物合成途徑(HBP)、蛋白激酶C(PKC)途徑和血管緊張素II(Ang II)途徑等,這些經(jīng)典代謝途徑都與活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生密切相關(guān)[2-5]。ROS的過度累積可增加機(jī)體氧化應(yīng)激水平,誘導(dǎo)線粒體損傷、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡以及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能改變,在DR發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6]。
DR是糖尿病并發(fā)的視網(wǎng)膜微血管疾病,微血管改變是DR發(fā)生發(fā)展的主要原因。機(jī)體長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)引起視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞丟失、毛細(xì)血管基底膜增厚、毛細(xì)血管閉塞和血管通透性增加,進(jìn)而出現(xiàn)以視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常、微動(dòng)脈瘤、視網(wǎng)膜出血點(diǎn)、硬性滲出、棉絨斑等為特征的非增生型DR和以新生血管、玻璃體積血、纖維血管增殖、牽拉性視網(wǎng)膜脫離為特征的增生型DR[7]。當(dāng)血-視網(wǎng)膜屏障破壞,血管通透性增加,引起黃斑區(qū)液體滲出時(shí)可形成糖尿病黃斑水腫,是影響糖尿病患者視力的首要原因[7]。需要區(qū)分的是,新生血管是位于視網(wǎng)膜表面的一束細(xì)小血管,熒光素眼底血管造影可出現(xiàn)強(qiáng)熒光滲漏,而視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常是先前存在的毛細(xì)血管床不規(guī)則節(jié)段性擴(kuò)張,且完全位于視網(wǎng)膜內(nèi),造影時(shí)通常不出現(xiàn)熒光滲漏。盡管DR臨床診斷是基于血管病理學(xué)變化,但研究表明,視網(wǎng)膜神經(jīng)血管單元的多種代謝途徑和信號(hào)通路的同時(shí)失調(diào)引起的神經(jīng)視網(wǎng)膜能量代謝改變是導(dǎo)致DR微血管病變的重要原因,視網(wǎng)膜神經(jīng)變性是先于臨床可檢測(cè)到的微血管損傷,在DR早期神經(jīng)視網(wǎng)膜已有改變且視覺信號(hào)出現(xiàn)受損表現(xiàn)[8]。因此,明確DR發(fā)生發(fā)展過程中微血管與神經(jīng)的交互作用可能對(duì)DR的早期診療有重要作用。
2.1 線粒體功能障礙與ROS過度產(chǎn)生線粒體是細(xì)胞能量的主要來源,參與機(jī)體代謝過程和細(xì)胞呼吸,線粒體功能障礙嚴(yán)重影響組織穩(wěn)態(tài)。ROS是通過線粒體電子傳遞鏈以生理方式形成的氧自由基,含有一個(gè)額外的電子賦予它們極大的不穩(wěn)定性和高反應(yīng)性[9]。正常情況下,機(jī)體生理活動(dòng)需要中、低水平的自由基參與充當(dāng)氧化還原信號(hào)的信使,促進(jìn)細(xì)胞代謝、增殖、分化和免疫調(diào)節(jié),并參與血管重塑[10]。為了維持氧化還原平衡,機(jī)體將調(diào)動(dòng)抗氧化系統(tǒng)的防御機(jī)制,如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、血氧合酶1等抗氧化酶和非酶抗氧化劑[10]。然而,當(dāng)ROS的產(chǎn)生多于抗氧化防御時(shí),氧化還原穩(wěn)態(tài)被破壞將導(dǎo)致氧化應(yīng)激,此時(shí),細(xì)胞和線粒體功能就會(huì)受到影響。在糖尿病高血糖狀態(tài)下,過量的葡萄糖在三羧酸循環(huán)中被降解,電子傳遞鏈負(fù)荷增加,線粒體中氧化劑生成增加,從而導(dǎo)致ROS的過量產(chǎn)生[11]。視網(wǎng)膜是機(jī)體耗氧量最多的組織,因此更易受到氧自由基的損傷,當(dāng)ROS產(chǎn)生過量時(shí),視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激增加,線粒體功能紊亂,進(jìn)而引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡等一系列視網(wǎng)膜組織細(xì)胞功能損傷。近幾十年來,有研究強(qiáng)調(diào)了糖尿病患者視網(wǎng)膜中高水平的ROS及其對(duì)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞功能的影響,與其他視網(wǎng)膜細(xì)胞相比,光感受器擁有更多的線粒體,并且已有研究證明光感受器是視網(wǎng)膜中ROS的主要來源,是DR中超氧化物的主要貢獻(xiàn)者[12]。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中,高血糖可導(dǎo)致感光細(xì)胞中線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)軗p進(jìn)而引起視網(wǎng)膜超氧化物水平增加[13]。在高葡萄糖培養(yǎng)環(huán)境下,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞ROS過度產(chǎn)生,破壞抗氧化防御機(jī)制,引起線粒體功能障礙,同時(shí)ERK1/2-Akt-tuberin-mTOR依賴性信號(hào)通路激活,導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和神經(jīng)退行性標(biāo)志物表達(dá)增加[14]。這些相關(guān)研究將有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)線粒體功能障礙、ROS過度產(chǎn)生與視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷和DR發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。
2.2 代謝途徑異常糖尿病引起的機(jī)體代謝紊亂是產(chǎn)生DR的根本原因,多條代謝途徑,如多元醇途徑、AGEs途徑、HBP途徑、PKC途徑和Ang II途徑等在DR發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。這些代謝異常影響視網(wǎng)膜ROS的產(chǎn)生,反之,ROS過度產(chǎn)生又進(jìn)一步增加這些代謝途徑的紊亂,在不同途徑之間也可通過ROS或其他中間成分相互關(guān)聯(lián)。
2.2.1 多元醇途徑多元醇途徑也稱為山梨糖醇-醛糖還原酶途徑,雖然多元醇途徑是次要的葡萄糖代謝途徑,但卻在DR中起關(guān)鍵作用。正常情況下,葡萄糖通過糖酵解途徑代謝,在高血糖條件下,多元醇途徑活性增加,過量的葡萄糖通過醛糖還原酶轉(zhuǎn)化為山梨糖醇,然后轉(zhuǎn)化為果糖。多元醇途徑激活產(chǎn)生氧化應(yīng)激,一方面通過醛糖還原酶產(chǎn)生的山梨糖醇增加了還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的消耗,影響抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)的產(chǎn)生,導(dǎo)致抗氧化失衡;另一方面,山梨糖醇轉(zhuǎn)化成的果糖被磷酸化為3-磷酸果糖,然后被分解為3-脫氧葡萄糖苷,后者可促進(jìn)AGEs形成[15]。此外,高血糖下山梨糖醇的產(chǎn)生和積累可導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞滲透壓增加、細(xì)胞水腫、代謝紊亂和微血管損傷。研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元和高葡萄糖培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中均觀察到醛糖還原酶免疫反應(yīng)性增加,而醛糖還原酶抑制劑可阻止糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管壁補(bǔ)體的早期活化以及血管周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的后期凋亡[16]。
2.2.2 AGEs途徑長(zhǎng)期暴露于高血糖會(huì)顯著增加大分子蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等的非酶糖基化,進(jìn)而引起AGEs的積累。AGEs是不可逆的交聯(lián)產(chǎn)物,由甲基乙二醛和乙二醛等強(qiáng)糖基化二羰基化合物形成[17]。AGEs通過與細(xì)胞表面的AGE受體(RAGE)相互作用促進(jìn)核因子(NF)-κB活化,從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、炎癥細(xì)胞因子和黏附分子表達(dá)增加[18]。在DR的病理生理過程中,AGE-RAGE的相互作用激活NADPH氧化酶,從而增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。AGE-RAGE積聚在視網(wǎng)膜微血管中,可直接與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[19]。在2型糖尿病大鼠模型中,AGE前體甲基乙二醛可介導(dǎo)氧化應(yīng)激并加重內(nèi)皮功能障礙、AGEs積累、上調(diào)炎癥標(biāo)志物并降低一氧化氮生物利用度[20]。抑制AGEs可改善高血糖引起的血-視網(wǎng)膜屏障滲漏,減少視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成[21]。
2.2.3 HBP途徑HBP途徑是另一種響應(yīng)慢性高葡萄糖的生化途徑,糖尿病患者的視網(wǎng)膜組織中己糖胺水平升高。在HBP途徑中,葡萄糖被磷酸化并轉(zhuǎn)化成6-磷酸果糖,然后通過6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶將其轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖胺,后者可通過乙?;彤悩?gòu)化作用轉(zhuǎn)化為N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸,最后形成終產(chǎn)物二磷酸尿嘧啶-N-乙酰氨基葡萄糖,作為蛋白質(zhì)和脂質(zhì)翻譯后修飾的糖基側(cè)鏈[22-23]。據(jù)報(bào)道,HBP介導(dǎo)ROS在高血糖中的毒性作用,在高葡萄糖水平情況下,會(huì)產(chǎn)生大量的ROS,抑制3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性,導(dǎo)致糖酵解產(chǎn)物流入HBP途徑[24]。由活化的己糖胺產(chǎn)生的葡萄糖胺增加了過氧化氫的產(chǎn)生,這進(jìn)一步促進(jìn)了氧化應(yīng)激,增加了血管通透性和血管生成[24]。此外,HBP的激活還可通過增加周細(xì)胞損失和無細(xì)胞毛細(xì)血管形成影響視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)功能,促進(jìn)DR發(fā)生[25]。
2.2.4 PKC途徑PKC途徑在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DR發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。PKC家族包含多種亞型,已發(fā)現(xiàn)PKC-α、PKC-β、PKC-δ和 PKC-ε在DR發(fā)病過程中被激活[26]。高血糖狀態(tài)誘導(dǎo)ROS的積累和二酰基甘油的合成,而二?;视褪羌?xì)胞中PKC通路的關(guān)鍵激活劑[27]。此外,PKC途徑還可通過AGE-RAGE和多元醇途徑間接被激活[7]。視網(wǎng)膜細(xì)胞中各種生理過程的調(diào)節(jié)與PKC密切相關(guān),包括視網(wǎng)膜血流動(dòng)力學(xué)、內(nèi)皮細(xì)胞通透性、白細(xì)胞活化和黏附增強(qiáng)以及VEGF的表達(dá)[28]。PKC通路激活通過增加內(nèi)皮通透性、改變一氧化氮生物利用度、誘導(dǎo)VEGF表達(dá)以及血栓素和內(nèi)皮素-1的產(chǎn)生影響血管張力和通透性,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷[29]。此外,PKC還可增強(qiáng)NADPH氧化酶的活性,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和系膜細(xì)胞等血管細(xì)胞產(chǎn)生ROS,導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管損傷和血管內(nèi)皮功能障礙[30]。因此,高血糖激活PKC通路可加重視網(wǎng)膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。
2.2.5 Ang II途徑腎素-血管緊張素系統(tǒng)介導(dǎo)的血管通透性改變可能參與DR早期血-視網(wǎng)膜屏障破壞,Ang II是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵功能性因子,Ang II產(chǎn)生增加可引起DR神經(jīng)血管損傷[31]。在DR發(fā)生發(fā)展過程中,Ang II與其1型受體結(jié)合激活PKC,尤其是PKC-α異構(gòu)體,活化的PKC-α增強(qiáng)血管NADPH氧化酶活性,導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加,并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,從而直接損害血管內(nèi)皮細(xì)胞[32-33]。此外,Ang II可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽并通過PARP途徑、NF-κB途徑誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞因子和VEGF的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成,加劇DR進(jìn)展[32-33]。除血管生成外,Ang II還誘導(dǎo)血管重塑,破壞視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu),導(dǎo)致毛細(xì)血管異常血運(yùn)重建,進(jìn)一步加重微血管并發(fā)癥[34]。DR動(dòng)物模型研究表明,使用Ang II受體阻滯劑可減少糖尿病視網(wǎng)膜微血管損傷、血管滲漏、無細(xì)胞毛細(xì)血管形成和血管生成因子的表達(dá),也可減少視網(wǎng)膜白細(xì)胞停滯和黏附分子的表達(dá)從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[35]。
DR作為糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥,發(fā)展至后期引起的視力障礙嚴(yán)重影響患者的生存和生活質(zhì)量,目前預(yù)防和治療DR已成為重大的公共衛(wèi)生問題。由于糖尿病“代謝記憶”現(xiàn)象的存在,即使嚴(yán)格控制血糖,視網(wǎng)膜微血管病變?nèi)钥蛇M(jìn)展,當(dāng)患者自覺明顯視力障礙時(shí),DR可能已進(jìn)展至中晚期,因此,強(qiáng)調(diào)對(duì)DR進(jìn)行早期預(yù)防和控制尤為重要。在DR的早期防控中,有效的糖尿病管理,如堅(jiān)持糖尿病飲食、適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)和鍛煉、嚴(yán)格控制血糖和血壓等仍是基礎(chǔ),此外,應(yīng)注重預(yù)防性DR篩查,這在防止DR發(fā)生中起關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)的DR篩查對(duì)已有臨床表現(xiàn)的DR患者具有一定的病情提示作用,然而,在達(dá)到DR最低臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)之前,糖尿病患者的眼底可能已出現(xiàn)不同程度的微血管病變。研究發(fā)現(xiàn),在無明顯DR臨床癥狀的糖尿病患者中,光學(xué)相干斷層掃描與光學(xué)相干斷層掃描血管成像技術(shù)已顯示出視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厚度變薄,黃斑中心凹無血管區(qū)擴(kuò)大,黃斑區(qū)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管灌注減少,視盤周圍及內(nèi)側(cè)區(qū)域毛細(xì)血管密度顯著降低[36-37]。光學(xué)相干斷層掃描與光學(xué)相干斷層掃描血管成像技術(shù)不同于熒光素眼底血管造影,是無創(chuàng)的、非侵入性的、快速的檢查,可以清晰顯示視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的血管結(jié)構(gòu)和微血管變化,監(jiān)測(cè)DR不同階段病情進(jìn)展,患者的接受度也相對(duì)較高,可作為DR臨床前期微血管病變檢查的重要工具。提倡對(duì)糖尿病患者臨床前期視網(wǎng)膜病變進(jìn)行及早地定期檢查,這可以更好地了解DR的發(fā)病機(jī)制,預(yù)測(cè)DR的發(fā)展,更有助于及早地進(jìn)行DR干預(yù)治療,延緩病情進(jìn)展。
目前,視網(wǎng)膜氬激光光凝術(shù)、玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物和玻璃體切割術(shù)是現(xiàn)階段較成熟的DR治療方式,但在延緩DR進(jìn)展方面存在一定的缺點(diǎn),如增加患者的不適感和藥物的不良反應(yīng)、經(jīng)濟(jì)成本高、療效易反復(fù)等。因此,需要新的靶點(diǎn)和療法來預(yù)防或延緩DR的發(fā)展。
氧化應(yīng)激在DR發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用,抗氧化酶表達(dá)降低導(dǎo)致抗氧化防御能力下降、氧化損傷增加是影響DR嚴(yán)重程度與病情進(jìn)展的重要因素??寡趸冈谘趸瘧?yīng)激引起的損傷中具有重要保護(hù)作用,如何增加糖尿病患者抗氧化酶水平,并促進(jìn)抗氧化平衡可能是防治DR的新方向。有研究發(fā)現(xiàn),多種膳食補(bǔ)充劑、微量元素等在DR防治方面顯示出積極的效果,可能作為今后DR的輔助療法[38]。多酚是飲食中豐富的抗氧化劑,主要來源于水果、蔬菜和谷物等,白藜蘆醇是被研究最多的多酚,也是超氧陰離子或單線態(tài)氧的良好清除劑。有研究顯示,白藜蘆醇可上調(diào)糖尿病大鼠眼內(nèi)GSH水平并抑制血液和視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶活性,減少ROS產(chǎn)生,同時(shí)白藜蘆醇還能抑制NF-κB促炎通路,減少炎癥因子分泌,抑制炎癥反應(yīng)[39]。姜黃素是來源于中藥姜黃的植物多酚,具有抗氧化、抗炎和降血糖活性,在糖尿病及其慢性并發(fā)癥的預(yù)防和治療中顯示出良好的應(yīng)用潛力。在糖尿病大鼠模型中,姜黃素可改善糖尿病引起的視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)變化,如視網(wǎng)膜變薄、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)核層細(xì)胞凋亡以及視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜增厚。此外,它還通過降低視網(wǎng)膜中VEGF的表達(dá)發(fā)揮抗新生血管作用[40]。葉黃素和玉米黃素是視網(wǎng)膜中兩種特別的抗氧化色素,主要集中于黃斑區(qū),可以保護(hù)黃斑和感光細(xì)胞免受光毒性和氧化損傷。研究表明,補(bǔ)充葉黃素和玉米黃素能改善視網(wǎng)膜內(nèi)層缺血再灌注損傷,并有效抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞凋亡,在減輕視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞損傷的同時(shí)為視網(wǎng)膜非血管細(xì)胞提供保護(hù),預(yù)防早期糖尿病引起的視網(wǎng)膜組織功能改變[41-42]。維生素D是機(jī)體必需的微量元素,也是一種有效的抗氧化劑,維生素D缺乏可能參與DR的發(fā)病機(jī)制。以往研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充維生素D后,Nrf2/Keap1通路可上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD),并促進(jìn)GSH和谷胱甘肽還原酶的產(chǎn)生,保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷和ROS引起的細(xì)胞凋亡,維持細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原環(huán)境[43-44]。這些抗氧化劑可能有助于改善DR早期微血管病變,并抑制DR早期階段的進(jìn)展。
中藥活性成分的抗氧化功能在DR防治方面的作用正在受到關(guān)注,楊梅苷是一種天然黃酮,具有抗氧化、抗病毒、細(xì)胞保護(hù)等作用。研究發(fā)現(xiàn),楊梅苷對(duì)糖尿病大鼠具有良好的降血糖功能,還可減輕糖尿病引起的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮抗凋亡活性,是DR的潛在治療分子[45]。另一種天然黃酮類化合物,燈盞花乙素,也具有相似的作用,可減少高血糖引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,抑制視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激進(jìn)而減輕血-視網(wǎng)膜屏障損傷[46]。此外,從龍膽屬植物中提取的糖苷——龍膽苦苷,也被證明具有抗炎、抗氧化作用,可能在DR的治療中具有一定功效[47]。有研究發(fā)現(xiàn),龍膽苦苷可以抑制糖尿病大鼠中NF-κB、TNF-α、IL-1β和ICAM-1等炎癥細(xì)胞因子表達(dá),并上調(diào)抗氧化標(biāo)志物GSH、SOD和過氧化氫酶水平,發(fā)揮其治療作用[48]。中藥富含天然的抗氧化活性成分,是發(fā)掘抗氧化劑的重要途徑之一,深入研究中藥抗氧化的有效成分、作用機(jī)制和相關(guān)分子機(jī)制將會(huì)為DR的治療帶來新的靶點(diǎn)。
目前,DR的治療方法多側(cè)重于糖尿病黃斑水腫和晚期DR,通過暫時(shí)阻止異常視網(wǎng)膜血管的形成來延遲視力喪失,但對(duì)于早期DR甚至是臨床前期DR仍缺乏有效的防治方法,因此,應(yīng)提議將阻止或減少DR從早期階段向更嚴(yán)重階段的進(jìn)展作為對(duì)抗DR的主要目標(biāo),重視對(duì)臨床前期DR及時(shí)地定期篩查,并及早進(jìn)行干預(yù)治療。DR作為一種多因素疾病,其病理生理學(xué)涉及的多種復(fù)雜的生化途徑異常,它們與高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和視網(wǎng)膜微血管損傷密切相關(guān)??寡趸委熓荄R防治的一個(gè)重要方向,但如何從眾多抗氧化劑中發(fā)掘?qū)R有顯著療效的成分,如何平衡其治療劑量與副作用以及如何確定抗氧化治療的時(shí)機(jī)等方面仍需要更多、更進(jìn)一步的研究來探討。