郝昕蕾 金 瑋 王文俊 齊 奇 楊安懷

眼部感染性疾病是世界范圍內(nèi)致盲性眼病的最重要原因。然而，病原體的多樣性給眼部感染性疾病的病因診斷帶來挑戰(zhàn)[1-2]。目前，臨床中病原體培養(yǎng)技術(shù)陽性檢出率低，且分子診斷技術(shù)僅能針對部分已明確的病原體[2-3]。為確定眼內(nèi)微生物感染的種類，提高病原體檢出率，需要更靈敏、無偏倚、全面的診斷技術(shù)。隨著宏基因組測序(mNGS)技術(shù)和微量樣本技術(shù)的發(fā)展[4-5]，眼科微量樣本可提供核酸、抗體、細(xì)胞、細(xì)胞因子等多項(xiàng)信息[6-9]，這使得眼內(nèi)液的臨床診斷價(jià)值大大升高[4-10]。本文就眼內(nèi)液檢測在眼部感染性疾病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 病原學(xué)檢測

病原微生物的檢測方法多種多樣，從傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)到分子診斷技術(shù)，如PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)、多重固相條帶PCR(strip PCR)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增等，以及當(dāng)下最火的高通量測序技術(shù)[1-2,11-13]，其間經(jīng)歷了不斷革新。

1.1 病原體培養(yǎng)傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)技術(shù)陽性檢出率低，不同文獻(xiàn)報(bào)道的陽性檢出率不同，基本在40%～70%[1-2,14-15]。有文獻(xiàn)報(bào)道，玻璃體液病原體培養(yǎng)陽性檢出率高于房水[1,16]，但在繼發(fā)于角膜感染的眼內(nèi)炎患者中，房水受累明顯，陽性檢出率高于玻璃體液[1]。病原體培養(yǎng)僅適用于部分微生物，如細(xì)菌和真菌，耗費(fèi)時(shí)間長，在臨床應(yīng)用中明顯受限[3,16]。與其他檢測方法相比，病原體培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其可以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[17]，對于調(diào)整臨床用藥具有指導(dǎo)意義。

1.2 分子診斷技術(shù)PCR作為最早使用的分子診斷技術(shù)，是大多數(shù)DNA檢測手段的基石[14]。RT-PCR能夠定量分析病原微生物，區(qū)分真實(shí)感染和外源性污染，并可預(yù)測預(yù)后[16]。16S PCR以一組能識(shí)別所有細(xì)菌中均存在的保守16S核糖體DNA作為引物，明確細(xì)菌的存在[15,18]。研究發(fā)現(xiàn)，相比于傳統(tǒng)的培養(yǎng)手段，16S PCR具有較高的靈敏度和特異度[15,17]；靈敏度過高可能造成假陽性，可檢出的微生物僅限于細(xì)菌，對真菌、病毒等無效，臨床應(yīng)用受限[15]。類似地，利用核糖體18S/28S DNA序列能確證真菌的存在[1]。strip PCR將多種病原體組成固定組合，可同時(shí)檢測多種病原微生物。有研究表明，與RT-PCR相比，strip PCR具有更高的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，這兩種方法的檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果具有較高的一致性[12,19]。strip PCR操作簡單，需要更少的樣本、時(shí)間以及金錢。但strip PCR屬于半定量檢測，無法像RT-PCR一樣提供具體數(shù)值；由于DNA擴(kuò)增干擾，如果某一病原體拷貝數(shù)較高，會(huì)影響其他病原體的檢出[12]。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增是由Notomi等[20]首先提出的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)避免了DNA模板初始的熱變性階段和擴(kuò)增中反復(fù)升降溫步驟，操作簡單，耗時(shí)短，但引物設(shè)計(jì)難度大，污染導(dǎo)致的假陽性會(huì)限制該技術(shù)的使用[21]。

1.3 mNGS近年來，mNGS發(fā)展迅速，美國FDA在2016年發(fā)布了二代測序體外診斷的指南草案，指出mNGS不僅可以鑒定病原微生物，也能檢出基因突變和耐藥基因等。在2020年初爆發(fā)的新型冠狀病毒疫情防控中，mNGS也發(fā)揮了重要作用。近期我國學(xué)者發(fā)布多篇有關(guān)mNGS的專家共識(shí)[22-23]。mNGS是對一代測序即Sanger測序技術(shù)的革命性變革，無需克隆即可在一次運(yùn)行中生成和檢測數(shù)百萬個(gè)核酸序列，利用mNGS高通量特性，可以獲取標(biāo)本中人源核酸序列和外源性病原微生物核酸序列信息，與人類和病原微生物基因組序列庫對比，能夠鑒定出病原體[2-3,10,24]。二代測序平臺(tái)眾多[3,24]，不同平臺(tái)檢測流程類似：樣本的提取、運(yùn)輸與處理，提取核酸與建立文庫，自動(dòng)測序，質(zhì)量控制與生物信息學(xué)分析，結(jié)果解讀與報(bào)告出具[24-25]。mNGS是一種無偏倚、無假設(shè)的病原體鑒定技術(shù)，可以獲得有關(guān)物種、血清型、毒力特性和抗生素耐藥性、疾病暴發(fā)等信息，具有快速、覆蓋度廣等特點(diǎn)[8,10,22-26]。mNGS作為一種新技術(shù)，尚缺乏結(jié)果解讀統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，在數(shù)據(jù)解釋方面仍需進(jìn)一步探索和規(guī)范[22,25,27]。操作中任何污染導(dǎo)致的假陽性都會(huì)使結(jié)果分析變得復(fù)雜，檢測成本增高，限制了mNGS的臨床應(yīng)用[24-25,28]。

研究證實(shí)，mNGS在眼部感染性疾病中能夠同時(shí)檢出兩種以上病原體和未知致病微生物[15,29-30]。Lee等[15]利用mNGS檢測所有細(xì)菌培養(yǎng)陰性和部分培養(yǎng)陽性的眼內(nèi)炎患者標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)了Torque Teno病毒，并被RT-PCR所證實(shí)。在一項(xiàng)臨床研究中，印度學(xué)者檢測了34例眼內(nèi)炎患者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，病原體培養(yǎng)陽性15例，mNGS檢出陽性30例，他們認(rèn)為mNGS是感染性眼內(nèi)炎有價(jià)值的檢測手段[8]。Gonzales等[31]利用mNGS檢測眼部淋巴瘤患者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)了合并HHV-4和HHV-8感染的病例。

1.4 抗體和Goldmann-Witmer系數(shù)/Witmer-Desmonts系數(shù)在診斷感染性眼病中，我們還需關(guān)注Goldmann-Witmer系數(shù)(GWC)或Witmer-Desmonts系數(shù)(WDC)的作用[13,32-33]。這些參數(shù)主要用于區(qū)別特異性抗體是眼內(nèi)原位產(chǎn)生還是血-眼屏障破壞滲漏導(dǎo)致的假陽性[4,34]。數(shù)值越高，越支持病原體IgG在眼內(nèi)原位產(chǎn)生，反之則支持滲漏所致[4,35]。這些參數(shù)使用的前提條件是眼內(nèi)液中病原體IgG為陽性[34]。計(jì)算公式如下：GWC=(眼內(nèi)液某種特定IgG濃度/血清某種特定IgG濃度)/(眼內(nèi)總IgG濃度/血清總IgG濃度)[35]；WDC=(眼內(nèi)液某種特定IgG濃度/血清某種特定IgG濃度)/(眼內(nèi)總白蛋白濃度/血清總白蛋白濃度)[13]。

以往研究報(bào)道，血清特異性IgG、IgE、嗜酸性粒細(xì)胞等對眼弓蛔蟲病的檢出率較低[36]。引入GWC后，在72例臨床診斷為眼弓蛔蟲病的病例中60例(60/72，83.33%)患者眼內(nèi)液樣本的GWC為陽性，檢出率明顯升高，眼內(nèi)非特異性IgE還可以作為GWC的補(bǔ)充指標(biāo)[35]；該研究還指出，雖然玻璃體液GWC陽性率(80.00%)稍高于房水(78.85%)，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GWC不僅可以檢出眼內(nèi)寄生蟲，也可檢出病毒。Wang等[13]采集31例前葡萄膜炎并發(fā)繼發(fā)性青光眼患者的房水，發(fā)現(xiàn)WDC聯(lián)合抗體檢出了19例常見病毒感染，敏感性較高。Kang等[7]對32例病毒相關(guān)的Fuchs葡萄膜炎綜合征(FUS)患者房水進(jìn)行分析，證實(shí)所有患者眼內(nèi)液中相應(yīng)病毒的IgG抗體和GWC均為陽性，無關(guān)病毒GWC為陰性。

1.5 細(xì)胞正常情況下，房水中不含細(xì)胞成分，成年人玻璃體除皮質(zhì)層含有少量細(xì)胞外，基本不含細(xì)胞。當(dāng)眼部發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，眼內(nèi)液中出現(xiàn)不同種類的細(xì)胞浸潤，借助流式細(xì)胞術(shù)等細(xì)胞檢測技術(shù)，可以得到眼內(nèi)液細(xì)胞譜[37]，推測眼部感染可能的病原體種類。

研究發(fā)現(xiàn)，前房炎癥反應(yīng)的臨床評分與房水中細(xì)胞計(jì)數(shù)之間存在相關(guān)性，而玻璃體混濁程度與玻璃體液細(xì)胞數(shù)之間并無相關(guān)關(guān)系[37-38]。他們推測后者出現(xiàn)的原因是玻璃體混濁的嚴(yán)重程度與玻璃體液中細(xì)胞數(shù)和蛋白濃度均相關(guān)[37]。急性視網(wǎng)膜壞死患者玻璃體液中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)較高[39]。細(xì)菌性或真菌性眼內(nèi)炎患者的眼內(nèi)液中，中性粒細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)多于其他細(xì)胞，其他類型葡萄膜炎患者中T細(xì)胞升高明顯,不同細(xì)胞譜可作為不同種類病原體的線索指標(biāo)[37]。Carreo等[37]檢測了31份眼內(nèi)液樣本，發(fā)現(xiàn)在14份玻璃體液樣本中，感染性葡萄膜炎患者的CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值高于非感染性眼病患者，而17份房水樣本未發(fā)現(xiàn)該規(guī)律。上述結(jié)論與一項(xiàng)多中心前瞻性研究結(jié)果相矛盾，后者發(fā)現(xiàn)眼結(jié)節(jié)病患者CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值和CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于眼部病毒感染患者，病毒感染患者的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)高于眼結(jié)節(jié)病患者[39]。

2 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白質(zhì)，能介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，分為白細(xì)胞介素(IL)、干擾素、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、生長因子等。在眼部感染性疾病中，細(xì)胞因子能幫助我們評估眼內(nèi)炎性環(huán)境，提示治療終點(diǎn)和預(yù)測預(yù)后等。

2.1 評估眼內(nèi)炎性環(huán)境眼部感染發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，眼內(nèi)液中與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子明顯增加，利用這一特性，可以對眼部炎性環(huán)境進(jìn)行評估。有學(xué)者對32例風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒相關(guān)FUS患者的房水細(xì)胞因子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與單純白內(nèi)障患者相比，F(xiàn)US患者房水中IL-6、IL-8、IL-10、血管細(xì)胞黏附分子等細(xì)胞因子含量顯著高于對照組，與前房炎癥反應(yīng)程度具有一致性[7]。Wang等[6]對38例眼弓蛔蟲病患者眼內(nèi)液進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞因子,如IL-6、IL-8、IL-10、血管細(xì)胞黏附分子和VEGF含量高于健康眼。感染性眼病患者眼內(nèi)液中細(xì)胞因子含量不僅高于正常對照組，與非感染性疾病相比亦有差別。研究發(fā)現(xiàn)，眼內(nèi)炎患者眼內(nèi)液中IL-6含量高于非感染性葡萄膜炎和淋巴瘤[40]。此外，在巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎(CMVR)患者房水中CMV-DNA濃度與IL-6、IL-8兩種細(xì)胞因子含量顯著相關(guān)，玻璃體內(nèi)注射抗病毒藥物后，CMV-DNA載量、IL-8、IL-10含量顯著下降，以IL-8降低最為明顯[41]。

2.2 提示治療終點(diǎn)與預(yù)測預(yù)后對于病毒性視網(wǎng)膜炎或眼內(nèi)炎患者，局部治療多采用玻璃體內(nèi)注藥，何時(shí)停止注藥目前尚無共識(shí)。已有研究證實(shí)，細(xì)胞因子IL-8對骨髓造血干細(xì)胞移植術(shù)后發(fā)生CMVR患者的治療終點(diǎn)有提示作用。有學(xué)者對24例造血干細(xì)胞移植術(shù)后CMVR患者進(jìn)行前瞻性隨機(jī)對照研究，根據(jù)治療終點(diǎn)不同分為兩組，證實(shí)以房水CMV-DNA<1×106copies·L-1或IL-8<30×103pg·L-1為治療終點(diǎn)安全且有效，能減少球內(nèi)注藥次數(shù)[42]。另有研究結(jié)果表明，在HIV陰性的CMVR患者中，盡管停止治療時(shí)CMV-DNA為陽性，但以IL-8<30×103pg·L-1作為治療終點(diǎn)的患者無一復(fù)發(fā)，而所有復(fù)發(fā)患者均是以每升CMV-DNA<1×106copies·L-1為評估指標(biāo)[43]。

細(xì)胞因子對眼部感染性疾病預(yù)后亦有提示作用。在CMVR的治療過程中，IL-8降低是CMVR恢復(fù)良好的實(shí)驗(yàn)室定量指標(biāo)[41,43]；此外，Wang等[6]發(fā)現(xiàn)眼弓蛔蟲病患者前房炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，復(fù)發(fā)的可能性越高。

3 未來與展望

3.1 病原體耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，mNGS不僅可以檢出病原微生物，還可以提供物種進(jìn)化追蹤。菌株鑒定及預(yù)測耐藥性所需的基因組信息[23-25]。研究人員已證實(shí)，廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測與培養(yǎng)菌株的敏感性相關(guān)，表明mNGS可提供病原菌耐藥性信息[24]。國外學(xué)者對感染CMV的5份樣本進(jìn)行mNGS，發(fā)現(xiàn)3份樣本具有更昔洛韋和纈更昔洛韋耐藥性基因突變[11]，提示眼內(nèi)液檢測可幫助我們了解病原體耐藥性或毒力表型。

3.2 疾病模型IL-10/IL-6含量比值大于1提示眼內(nèi)淋巴瘤，該指標(biāo)為診斷淋巴瘤的重要參考[33]。在非感染性葡萄膜炎中，細(xì)胞因子種類及含量各不相同。Behcet葡萄膜炎患者房水IL-10顯著低于FUS患者，而后者房水VEGF含量高[44]；小柳原田綜合征和Behcet葡萄膜炎患者房水細(xì)胞因子種類亦有差別。據(jù)此可建立不同疾病模型[9]。細(xì)胞因子在靶向治療方面亦有應(yīng)用，在TNF-α處于正常范圍的眼病中，抗TNF-α藥物，如英夫利西單抗治療無效；而在VEGF水平升高的眼病中使用抗VEGF治療有效，證明靶向治療的科學(xué)性[45-46]。與非感染性疾病類似，在眼部感染性疾病中，結(jié)合眼內(nèi)液中抗體、細(xì)胞種類和細(xì)胞因子等信息可建立感染性眼病的疾病模型，以區(qū)別不同種類病原微生物感染，給予針對性治療。