賈義平， 沈俊俊， 姚 靜， 劉 威， 高 靜， 李翠玲*， 樊祜卿

(1.菏澤市動物疫病預防控制中心， 山東 菏澤 274000; 2.菏澤市畜牧工作站， 山東 菏澤 274000)

梨是我國種植范圍最廣的果樹之一，僅次于蘋果、柑橘。據(jù)統(tǒng)計，2017年我國梨樹栽培面積和總產(chǎn)量分別占世界總栽培面積和產(chǎn)量的70%左右，是農(nóng)民經(jīng)濟收入的重要來源之一[1]。近年來，果農(nóng)為增收而盲目追求產(chǎn)量，化肥濫施現(xiàn)象普遍存在，導致土壤生態(tài)破壞、養(yǎng)分失衡、抗逆性下降。

秸稈富含豐富的有機碳以及氮、磷、鉀、硅等農(nóng)作物生長所必需的營養(yǎng)元素，可作為土壤微生物和作物的最初氮源[2]。秸稈還田能夠提高氮磷鉀的有效性和流動性，改善土壤供肥能力，促進作物養(yǎng)分吸收，具有一定增產(chǎn)作用[3]。前人研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，秸稈的添加有利于梨樹果實生長發(fā)育，加速梨樹果實生長，增大果實體積，提高單果質(zhì)量，提升果實品質(zhì)。沼液是畜禽糞便、作物秸稈等厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的終端產(chǎn)物之一，富含果實生長的氮磷鉀、氨基酸、維生素等養(yǎng)分，是一種緩速兼?zhèn)涞囊后w有機肥[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，噴施沼液可提高葉片光合作用，顯著增加梨果葉片長度、葉面積和百葉鮮重，提高產(chǎn)量，改善果實品質(zhì)，增產(chǎn)效果明顯。

探索秸稈配合有機無機肥如沼液來代替全化肥施肥，對當?shù)乩娈a(chǎn)業(yè)合理施肥具有重要意義。而秸稈還田和沼液的施入，是否會給土壤環(huán)境帶來不利影響，是必需關(guān)注的問題。細菌是土壤微生物中數(shù)量最豐富、分布最廣泛的類群，參與氮磷循環(huán)、土壤礦化和養(yǎng)分吸收等過程，對土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、健康狀況、保持土壤肥力與植物的生長發(fā)育具有重要影響[11]。本研究通過設置等氮的不同處理，即麥秸稈與化肥、沼液肥的組合，旨在分析秸稈配施沼液、化肥對梨樹果實質(zhì)量、土壤細菌群落的影響，為秸稈還田、沼液施用、化肥減量等農(nóng)藝措施提供理論基礎，為實現(xiàn)當?shù)乩娈a(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 自然概況

田間試驗地位于菏澤市，黃河沖擊平原，地勢平坦，年平均氣溫13.7℃，年降水量平均625 mm,年平均無霜期210 d。果區(qū)面積0.43 hm2。試驗品種為“黃冠”梨，樹齡15 a，株行距4 m×4 m，梨樹生長基本情況見表1。試驗地土壤為潮土，基本性狀：有機質(zhì)15.42 g·kg-1，堿解氮101.99 mg·kg-1，有效磷23.97 mg·kg-1，速效鉀162.22 mg·kg-1，pH值8.1。

表1 試驗區(qū)梨樹生長基本情況

1.2 試驗設計

挑選生長正常、樹勢一致的梨樹作為試驗材料。供試沼液取自當?shù)仞B(yǎng)殖場，經(jīng)處理后施用[12]。沼液理化性質(zhì)：有機質(zhì)36.50 g·kg-1，全氮0.84 g·kg-1，全磷1.42 g·kg-1，有效鉀1.68 g·kg-1，pH值8.0。麥秸稈經(jīng)收割機打碎處理，并充分腐熟后粉碎，腐熟后麥秸稈理化性質(zhì)(質(zhì)量分數(shù))總碳46.37%，總氮1.63%，碳氮比28.45，總磷0.89%，總鉀1.03%。當?shù)爻Ｒ?guī)施化肥為15%-15%-15%的NPK 酸性復合肥，施氮量(230 kg·hm-2，以N計)。試驗共設置5個處理，每個處理3次重復，每次重復區(qū)挑選10顆樹，各處理的施氮量一致，完全隨機區(qū)組排列。各處理如下： 1)對照組(不秸稈還田，不施沼液，不施化肥，記為CK)； 2)化肥處理組(100%化肥N，記為CF)； 3)秸稈+化肥處理(30%秸稈N，70%化肥N，記為S-CF)； 4)秸稈+沼液處理(30%秸稈N，70%沼液N，記為S-BS)； 5)沼液組(100%沼液N，記為BS)。所有處理分3次同時期施入樹冠周圍：萌芽期、第1次果實膨大期、第2次果實膨大期，各時期施氮量分別是總量的30%、40%、30%。其他田間管理措施參照當?shù)爻Ｒ?guī)農(nóng)藝管理措施。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 果實樣品測定

在各重復處理區(qū)隨機采集梨樹的4個方向25個果實，組成混合樣帶回，用電子天平測定單果質(zhì)量，用游標卡尺測量果實的橫縱徑，計算果形指數(shù)。

1.3.2 土壤總DNA提取

在各重復處理區(qū)選取10個樣點，采集土壤，去除其中的雜物、砂礫等，混勻，過2 mm篩。使用MoBio PowerSoil?DNA isolation kit試劑盒提取樣本總DNA，各混合樣品DNA提取物放于-20℃保存以備后續(xù)使用[13-14]。

1.3.3 特異區(qū)域擴增及測序

微生物多樣性檢測選取細菌 16S rDNA V3-V4區(qū)，DNA 樣本送至南京集思慧遠生物科技有限公司，正向擴增引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反應體系：總體系25 μl：10 μl 2×EasyTaq PCR SuperMix(Transgen Bio, Inc)、正反向引物各1 μl 、土壤微生物DNA 10 ng，最后加dd H2O補至25 μl。反應參數(shù)：94℃5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸8 min。利用 Illumina Novaseq PE250高通量測序平臺測序[13-14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，對各處理組各項指標結(jié)果進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，使用鄧肯(Duncan)新復極差來分析各相關(guān)變量，顯著水平p<0.05。微生物群落分析中，數(shù)據(jù)采用 QIIME(v1.8.0)軟件進行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)。然后基于有效數(shù)據(jù)進行OTUs(Operational Taxonomic Units，OTU相似性97%)聚類和物種分類分析。對比silva數(shù)據(jù)庫(細菌)，得到物種分類信息，利用QIIME軟件(v1.8.0)進行阿爾法(Alpha)多樣性分析[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥秸稈配施沼液和化肥對梨果產(chǎn)量及果形指數(shù)的影響

由表2可知。與對照CK組相比，施肥處理組單果質(zhì)量和實際產(chǎn)量均增加。單果質(zhì)量和實際產(chǎn)量CF組增加最高分別為11.67%、10.18%，其次為S-CF組10.06%、9.46%，S-BS組8.03%、8.37%，差異顯著(p<0.05)。含化肥組CF、S-CF單果質(zhì)量均高于含沼液組S-BS、BS，均無顯著差異(p>0.05)。各處理組果形指數(shù)無顯著差異(p>0.05)。

表2 不同處理對梨果產(chǎn)量及果形指數(shù)的影響

2.2 麥秸稈配施沼液和化肥對土壤中細菌群落多樣性的影響

由表3可知，各處理樣本中細菌覆蓋率(Coverage)指數(shù)均接近100%，說明樣本序列中未被檢測出的概率低，可反映出所測樣本中細菌的真實情況。不同施肥處理土壤樣品中細菌數(shù)為4572～5426，大小依次為CF>S-BS>S-CF>CK>BS(p<0.05)。使用α多樣性指數(shù)(Chao1、Shannon、Simpson)來評估各處理土壤樣本中細菌群落的物種多樣性和豐富度的差異。chao1指數(shù)表明：S-CF>S-BS>CF>CK>BS(p<0.05)。shannon指數(shù)表明：S-CF>S-BS>CF>CK>BS(p<0.05)。simpson指數(shù)表明：BS>CK>CF>S-CF>S-BS(p>0.05)。α多樣性分析結(jié)果表明，秸稈配施沼液或化肥可提高土壤細菌的生物多樣性。

表3 不同處理對土壤細菌多樣性指數(shù)的影響

2.3 麥秸稈配施沼液和化肥對土壤細菌群落組成的影響

在綱水平上，將相對豐度<0.1% 的類群歸類為其他。由圖1可知，共得到20個類群，有7個主要的細菌種群占所有序列的多數(shù)(64.14%～70.67%)。其中α、γ和δ-變形菌綱(Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria，Deltaproteobacteria)占38.18%～46.45%，是土壤中豐度最大的優(yōu)勢菌綱，在BS處理相對豐度最高為46.45%，CK處理相對豐度最低為38.14%。擬桿菌綱(Bacteroidia)在BS處理相對豐度最高為13.03%，S-CF處理最低為7.27%。厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、放線桿菌綱(Actinobacteria)在S-CF處理相對豐度最高，分別為7.99%、4.81%，在BS處理組最低，分別為5.09%、3.76%。酸桿菌綱(Subgroup 6)在CK處理相對豐度最高為7.31%，BS處理相對豐度最低為2.34%(見表4)。

圖1 土壤樣品中細菌類群綱水平分布圖

表4 土壤樣品中主要細菌類群綱水平相對豐度

3 討論

3.1 麥秸稈配施沼液和化肥對梨果產(chǎn)量的影響

秸稈還田腐解可以改善土壤結(jié)構(gòu)、保持土壤水分、促進氮素礦化、提高氮素利用率[15-16]。前人研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，秸稈添加可以促進梨果實生長、增大果實體積、提升果實品質(zhì)。沼液被視為是一種良好的有機肥料，合理施用能顯著改良土壤，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)[9]，噴施沼液可提高葉片光合作用，提高產(chǎn)量，改善果實品質(zhì)。還有研究結(jié)果表明[10]，根施沼液能顯著增加梨果葉片長度、葉面積和百葉鮮重，增產(chǎn)效果明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，全化肥處理提升梨果產(chǎn)量效果最為明顯，其次為秸稈配施化肥處理、秸稈配施沼液處理，三者之間無明顯差異。這說明了秸稈配施沼液和化肥能夠改良土壤、提高土壤肥力，達到全化肥的增產(chǎn)效果。全沼液處理對梨果產(chǎn)量的提高作用稍低于其他施肥處理，這可能與沼液富含的砷、汞、鎘等重金屬含量對植物生長及土壤環(huán)境產(chǎn)生了不利影響有關(guān)[17]。

3.2 麥秸稈配施沼液和化肥對土壤細菌群落的影響

土壤中細菌是土壤微生物種數(shù)量豐富、分布廣泛的微生物類群，是驅(qū)動土壤有機物質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的主要動力，反映了土壤質(zhì)量、肥力及作物生長的情況[18]。絕大多數(shù)土壤中細菌種類基本相同，從綱水平分析來看，本研究各處理組土壤中變形菌綱、擬桿菌綱、放線菌綱、厭氧蠅菌綱、酸桿菌綱豐度均相對較高，占細菌種類的64.14%～70.67%。

變形菌被視為有機質(zhì)分解轉(zhuǎn)化的主要功能細菌，在綱水平上主要包括α-變形菌綱、δ-變形菌綱和γ-變形菌綱[19]。α-變形菌綱富含大量的固氮細菌，δ-變形菌綱具有促進土壤中氮、磷、硫和有機質(zhì)循環(huán)的作用，γ-變形菌綱是所知的細菌中種類最多的一綱，具有突出的抗菌拮抗作用[20]。本研究結(jié)果表明，α、γ和δ-變形菌綱占所有序列的38.18%～46.45%，占主要細菌類群的一半以上。各施肥處理提高了土壤中變形菌綱的相對豐度，其中沼液處理組提高最為顯著，這可能和沼液肥所含的有害物質(zhì)如重金屬、有害病原菌有關(guān)，致使土壤對沼液肥的不良影響產(chǎn)生代償性提高作用[21]。從產(chǎn)量提升來看，全化肥處理組提升作用顯著，其次是秸稈配施化肥和沼液，這與變形菌綱的相對豐度變化相一致。值得一提的是沼液處理組提升產(chǎn)量與對照組比較效果最低，而秸稈配施沼液處理組提升產(chǎn)量與對照組比較效果顯著，這可能與秸稈的添加減緩了沼液中的有害物質(zhì)對土壤環(huán)境的不利影響有關(guān)。

本研究中各施肥處理土壤中擬桿菌綱的相對豐度僅次于變形菌綱。本研究發(fā)現(xiàn)越是提高梨果產(chǎn)量的處理如全化肥、秸稈配施化肥處理，其擬桿菌綱的相對豐度越低，與產(chǎn)量呈現(xiàn)相反的變化。在其他作物如水稻研究中也同樣發(fā)現(xiàn)，土壤細菌多樣性越高，作物產(chǎn)量越高，擬桿菌門相對豐度越低[13,22]。綠彎菌門厭氧蠅菌綱已被證明可水解纖維素為葡萄糖[23]，本研究中秸稈配施沼液和化肥處理組厭氧蠅菌綱顯著增加，這可能與秸稈中含有的纖維素相關(guān)。

研究表明向土壤中增施氮肥可降低酸桿菌的相對豐度，這與施氮可降低土壤pH值有關(guān)[24]。本研究中，各施肥處理均顯著降低土壤中酸桿菌門的相對豐度，尤其是秸稈和沼液的含量越多，土壤酸桿菌相對豐度越低，其中全沼液處理中的土壤酸桿菌相對豐度僅為對照組的1/3，這可能和秸稈與沼液所富含的有機物質(zhì)有關(guān)，也可能和沼液所含的有害物質(zhì)有關(guān)，還需要做進一步的深入研究。另有研究表明，酸桿菌可降解植物殘體多聚物，具有光合能力，同時還參與鐵循環(huán)、單碳化合物代謝[25]，這進一步解釋了單施沼液肥降低酸桿菌含量對梨果生長發(fā)育不利。

研究表明，保護性微生物放線菌可產(chǎn)生抗生素和酶來提高植物的抗逆性，如耐金屬毒性和拮抗病原菌，具有促進植物生長發(fā)育、調(diào)節(jié)土壤理化特性、活化土壤養(yǎng)分而改善土壤健康狀況的作用[26]。本研究中，單施化肥和沼液處理組土壤中放線菌綱相對豐度顯著降低，秸稈處理組土壤中放線菌綱的相對豐度顯著升高，表明了單純施化肥和沼液降低了梨樹的抵抗性，秸稈的添加提升了梨樹對外界環(huán)境的抗逆能力。

3.3 麥秸稈配施沼液和化肥對土壤細菌群落多樣性的影響

土壤微生物在促進土壤質(zhì)量和植物健康方面發(fā)揮著重要的作用，土壤微生物群落多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤質(zhì)量，多樣性指數(shù)越高表明土壤微生物群落的豐富度和多樣性越高，土壤健康狀況越好[27]。本研究中秸稈添加處理顯著升高土壤細菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。說明秸稈配施沼液和化肥與全化肥或全沼液相比有利于提高土壤細菌群落多樣性，提高了土壤生態(tài)功能的穩(wěn)定性。單施沼液或化肥處理中土壤細菌群落多樣性指數(shù)偏低，這可能與單施沼液或化肥致使某些土壤細菌富集增多，土壤質(zhì)量降低有關(guān)，在本研究中主要優(yōu)勢菌綱的占比在全化肥和沼液處理組顯著升高。

綜上，秸稈配施沼液或化肥等量代替全化肥不會導致梨果產(chǎn)量降低，但要低于全化肥處理。秸稈的添加與單施化肥或沼液相比降低了優(yōu)勢菌綱的相對豐度，提升了其他菌綱如厭氧蠅菌綱、酸桿菌綱和放線桿菌綱的相對豐度，更有利于提高土壤細菌群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性，提升了土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和梨樹生長抗逆性。

4 結(jié)論

(1)秸稈配施沼液或化肥等量代替全化肥可顯著提升梨果產(chǎn)量，但要低于全化肥處理。

(2)秸稈的添加與單施化肥或沼液相比降低了優(yōu)勢菌綱的相對豐度，提升了其他菌綱如厭氧蠅菌綱、酸桿菌綱和放線桿菌綱的相對豐度，更有利于提高土壤細菌群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性，提升了土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和梨樹生長抗逆性。