【作 者】 婁海芳，章鴻濤，喻梓瑄，王巨鋒，劉偉

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（浙江省中醫(yī)院），杭州市，310006

2 中翰盛泰生物技術(shù)股份有限公司，杭州市，311188

0 引言

隨著后基因組時(shí)代的到來，人類對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)入全新的發(fā)展階段，對(duì)疾病的檢測(cè)也不再僅僅依賴于單一指標(biāo)進(jìn)行診斷，而是將人體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)，利用多種指標(biāo)的組合對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后進(jìn)行更加精準(zhǔn)的檢測(cè)、判斷以及治療指導(dǎo)[1]。因此，多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的方法，特別是面向免疫分析、核酸檢測(cè)、酶學(xué)分析、受體和配體識(shí)別分析的高通量、高速度以及多功能的平臺(tái)技術(shù)對(duì)臨床檢測(cè)越來越重要[2]。

在這種情況下，懸浮芯片應(yīng)運(yùn)而生。懸浮芯片多指標(biāo)檢測(cè)技術(shù)是集微球編碼技術(shù)、液流控制技術(shù)、激光技術(shù)、生物技術(shù)及數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)為一體的新型生物分子檢測(cè)技術(shù)，也稱為液相芯片技術(shù)。相比固相生物芯片，懸浮芯片將平板載體替換為編碼微球，每個(gè)微球都攜帶一種可識(shí)別的編碼信息，以便鑒別固定在其表面的探針。一旦微球表面探針種類被識(shí)別，探針捕獲的靶分子就能夠被定性、定量分析[3-5]。

以微球?yàn)檩d體的最大優(yōu)勢(shì)源自微球可以在三維空間內(nèi)快速運(yùn)動(dòng)，微球上的生物配體與靶分子之間的雜交、結(jié)合近似于液相反應(yīng)機(jī)制，因此反應(yīng)動(dòng)力學(xué)較固相芯片大為提高[6]。同時(shí)，懸浮芯片在熒光編碼方式、檢測(cè)目標(biāo)分子種類等方面具有良好的靈活性，可根據(jù)具體需求更改表面固定有不同探針的編碼微球的種類，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)性化檢測(cè)[7]。

盡管國(guó)內(nèi)目前在懸浮芯片領(lǐng)域已經(jīng)取得一定發(fā)展，但其多指標(biāo)檢測(cè)試劑大都基于美國(guó)Luminex公司的編碼微球發(fā)展而來[8-9]。在懸浮芯片檢測(cè)解碼裝備方面，目前國(guó)內(nèi)尚未有完整的、專門針對(duì)懸浮芯片臨床使用的高通量懸浮芯片檢測(cè)儀器，而Luminex公司提供的設(shè)備，其光學(xué)系統(tǒng)的性能存在較大缺陷，主要表現(xiàn)為光學(xué)系統(tǒng)的抗震性、穩(wěn)定性較差，熒光收集靈敏度需要進(jìn)一步提升。根據(jù)未來市場(chǎng)應(yīng)用需求，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種應(yīng)用于高通量懸浮芯片檢測(cè)儀器的光學(xué)模塊，配合編碼微球可完成對(duì)懸浮芯片的自動(dòng)解碼和分析，為懸浮芯片技術(shù)在臨床的應(yīng)用提供了完整的解決方案。

1 磁球編碼工作原理

為實(shí)現(xiàn)對(duì)編碼微球的解碼和對(duì)目標(biāo)待測(cè)物濃度的探測(cè)，須明確編碼微球的編碼原理及編碼微球工作原理。一般地，編碼微球由粒徑為微米級(jí)的磁性納米微球內(nèi)部裝載2種熒光素組成，通過人為精準(zhǔn)調(diào)控?zé)晒馑氐难b載量，形成結(jié)構(gòu)、性狀完全一致，僅熒光強(qiáng)度存在差異的編碼磁球[10-11]。

圖1展示了二維熒光編碼的30種編碼微球。在1種編碼微球表面偶聯(lián)特定的生物探針，即可捕獲1種特定目標(biāo)待測(cè)物。將標(biāo)記有生物探針的多種編碼微球混合并分散于特定溶液，即形成懸浮芯片，可用于捕獲多種不同的目標(biāo)分析物。多指標(biāo)檢測(cè)原理如圖2所示。

圖1 編碼磁球陣列Fig.1 Coded magnetic ball array

圖2中的過程D展示了懸浮芯片的最終上樣檢測(cè)過程。完成目標(biāo)待測(cè)物捕獲后的編碼微球懸液將在鞘流池內(nèi)被鞘液聚焦，以單個(gè)編碼微球的形式逐個(gè)通過激光激發(fā)區(qū)域，編碼微球上的熒光將被激發(fā)并為對(duì)應(yīng)的探測(cè)器所探測(cè)。

圖2 多指標(biāo)檢測(cè)原理Fig.2 Multi-index detection principle

分析編碼微球工作原理可知，完成生物的每一個(gè)編碼微球都包含3種熒光素，其中兩種為編碼微球自身攜帶的用于識(shí)別編碼微球種類的FL1和FL2熒光素，另一種為前兩種通過捕獲目標(biāo)待測(cè)物后結(jié)合的用于表征目標(biāo)待測(cè)物濃度的FL3熒光素。

編碼微球解碼示意及E1門內(nèi)目標(biāo)待測(cè)物熒光強(qiáng)度如圖3所示。

圖3 編碼微球解碼示意及E1門內(nèi)目標(biāo)待測(cè)物熒光強(qiáng)度Fig.3 Coding decoding diagram and fluorescence intensity of tested target in gate E1

由圖3可知，不同種類的編碼微球解碼后呈現(xiàn)聚類效果，每一個(gè)群落為一種編碼微球，即一個(gè)特定的檢測(cè)指標(biāo)。一般地，每次測(cè)試完成后，一個(gè)群落內(nèi)包含數(shù)百到上千個(gè)編碼微球。對(duì)每一個(gè)群落內(nèi)編碼微球的FL3熒光素進(jìn)行單獨(dú)分析，即可得到不同目標(biāo)待測(cè)物的熒光強(qiáng)度。圖3同時(shí)展示了群落在E1門內(nèi)目標(biāo)待測(cè)物熒光強(qiáng)度分布直方圖。

2 光路設(shè)計(jì)

2.1 光學(xué)模塊設(shè)計(jì)要求

根據(jù)編碼微球工作原理確定儀器光路設(shè)計(jì)需求。懸浮芯片檢測(cè)儀器的光學(xué)模塊須配備光源和探測(cè)器，其中光源要能夠激發(fā)3種熒光素的熒光信號(hào)，其中兩種為編碼微球本身具備的用于識(shí)別編碼微球種類的編碼熒光素，另一種為前兩種生物反應(yīng)過程中結(jié)合的用于表征目標(biāo)待測(cè)物濃度的熒光標(biāo)記抗體。

在光學(xué)模塊中采用488 nm藍(lán)光和638 nm紅光激光器作為激發(fā)光源，所選擇的兩個(gè)激光器均具有良好的單色性和功率穩(wěn)定性。其中488 nm激光器用于激發(fā)FITC和QD605兩種編碼熒光素，分別對(duì)應(yīng)FL1和FL2，638 nm用于激發(fā)熒光二抗標(biāo)記的熒光素APC，對(duì)應(yīng)FL3。

488 nm波長(zhǎng)和638 nm波長(zhǎng)激光從激光器出射后，分別經(jīng)透鏡組1和透鏡組2對(duì)光斑進(jìn)行首次調(diào)整，紅光經(jīng)反射鏡反射穿過二向色分鏡傳輸至聚焦透鏡，藍(lán)光經(jīng)二向色分鏡反射傳輸至聚焦透鏡。兩束激光共同經(jīng)過聚焦透鏡的第二次聚焦，傳輸至鞘流池。通過對(duì)透鏡組1和透鏡組2的優(yōu)化設(shè)計(jì)，在鞘流池的中心的激發(fā)位置488 nm和638 nm具有完全一致的光斑尺寸。光學(xué)模塊的設(shè)計(jì)原理如圖4所示。

圖4 光學(xué)模塊設(shè)計(jì)原理Fig.4 Design principle of optical module

采用3個(gè)光電倍增管（photomultiplier tube,PMT）對(duì)3種不同的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行探測(cè)。此外，光學(xué)模塊還配備了兩個(gè)散射光探測(cè)器，分別為前向散射光和側(cè)向散射光探測(cè)通道，由于散射光信號(hào)相對(duì)于熒光信號(hào)屬于強(qiáng)信號(hào)，采用硅光電二極管即可完成探測(cè)。對(duì)散射光進(jìn)行分析可有效識(shí)別編碼微球是否發(fā)生粘連。

當(dāng)單個(gè)編碼微球通過激發(fā)區(qū)域時(shí)，各個(gè)探測(cè)器捕獲的光信號(hào)經(jīng)光電轉(zhuǎn)換后均呈現(xiàn)為一個(gè)電脈沖信號(hào)。單個(gè)探測(cè)器內(nèi)脈沖信號(hào)的特征值包括信號(hào)高度、脈寬、面積等，對(duì)每個(gè)編碼微球的脈沖信號(hào)進(jìn)行分析并提取信號(hào)特征值，即可實(shí)現(xiàn)編碼微球的解碼和目標(biāo)待測(cè)物濃度檢測(cè)。

2.2 激光光斑空間分離設(shè)計(jì)

當(dāng)紅、藍(lán)兩束激光的激發(fā)點(diǎn)處于同一位置時(shí)，會(huì)造成激發(fā)的熒光信號(hào)形成疊加，如熒光素APC既可被488 nm激發(fā)，也可被638 nm激發(fā)，此時(shí)光電倍增管3（對(duì)應(yīng)FL3）接收到的信號(hào)將是兩個(gè)熒光信號(hào)的疊加。這種熒光信號(hào)的疊加會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)待測(cè)物的濃度測(cè)值不準(zhǔn)確。采用熒光補(bǔ)償?shù)姆绞讲⒉荒苡行@種串?dāng)_，因此，避免報(bào)告通道FL3熒光信號(hào)被串?dāng)_是極其必要的。

為避免熒光串?dāng)_現(xiàn)象，在空間上對(duì)紅、藍(lán)2個(gè)光斑進(jìn)行分離。在豎直方向上，將紅、藍(lán)光斑中心分離數(shù)十微米，在鞘流池中心位置的光斑正視和側(cè)視如圖5所示。

圖5 激光光斑正視及側(cè)視Fig.5 Front and side view of laser spot

當(dāng)編碼微球從下往上通過激光激發(fā)區(qū)域時(shí)將率先被紅光激發(fā)，APC熒光FL3單獨(dú)被638 nm激光激發(fā)并被探測(cè)器探測(cè)到，488 nm激光無法激發(fā)FL3熒光信號(hào)，因此不對(duì)信號(hào)產(chǎn)生干擾。

當(dāng)編碼微球通過紅光激發(fā)區(qū)域后，進(jìn)入藍(lán)光激發(fā)區(qū)域，488 nm信號(hào)將對(duì)編碼信號(hào)FL1和FL2同時(shí)進(jìn)行激發(fā)。

2.3 高效非球面熒光收集透鏡與鞘流池一體化設(shè)計(jì)

當(dāng)熒光信號(hào)被激發(fā)時(shí)，向空間的各個(gè)方向發(fā)散。為對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行收集和探測(cè)，一般采用一個(gè)聚焦透鏡對(duì)一側(cè)的熒光進(jìn)行收集。其熒光收集光路示意如圖6(a)所示。

由圖6(a)可知，鞘流池的中心為激光激發(fā)區(qū)域，當(dāng)熒光被激發(fā)后，熒光向四周空間發(fā)射，部分光線從鞘流池中射出，部分光線從鞘流池光密介質(zhì)傳輸?shù)娇諝夤馐杞橘|(zhì)過程中發(fā)生全反射。

當(dāng)透鏡對(duì)一側(cè)熒光進(jìn)行收集時(shí)，理論上，最高的熒光收集效率可達(dá)25%，但由于光路的損耗和光線全反射的存在，其收集效率必然低于25%。為實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的高效收集，對(duì)熒光收集光路進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。根據(jù)設(shè)計(jì)結(jié)果計(jì)算，采用以上熒光收集光路，在傳輸距離達(dá)150 mm時(shí)，光線仍能保持良好的平行度，其發(fā)散角小于0.5°，滿足實(shí)際使用要求。

在光線傳輸150 mm位置設(shè)置探測(cè)面，對(duì)此處的熒光光強(qiáng)分布進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖6(b)所示。由探測(cè)面的光強(qiáng)分析可知，采用該熒光收集光路，其熒光接收效率高達(dá)19.57%。

圖6 熒光收集光路示意及探測(cè)面熒光光強(qiáng)分布Fig.6 Schematic diagram of collection light path and intensity distribution of detection surface

3 光學(xué)系統(tǒng)性能測(cè)試

3.1 光斑性能測(cè)試

光斑的性能分析采用間接激發(fā)進(jìn)行測(cè)試。已知鞘流池內(nèi)流體的平均流速為V1，根據(jù)層流原理，則編碼微球通過激光光斑時(shí)的速度為2V1。

在測(cè)試過程中，設(shè)定V1為3 m/s，則編碼微球通過激發(fā)區(qū)域的速度為6 m/s。已知激光光斑的縱向尺寸為15 μm，而編碼微球的直徑為3 μm，則理論上，脈沖信號(hào)的寬度應(yīng)為3.5 μs。

采用標(biāo)記熒光素APC的編碼微球進(jìn)行測(cè)試，并采用示波器對(duì)FL3熒光通道進(jìn)行觀測(cè)。根據(jù)理論計(jì)算預(yù)測(cè)，示波器中應(yīng)觀測(cè)到2個(gè)脈沖信號(hào)，其中第一個(gè)信號(hào)為編碼微球通過638 nm激光光斑時(shí)被激發(fā)形成，第二個(gè)信號(hào)為編碼微球通過488 nm激光光斑時(shí)被激發(fā)形成。兩個(gè)信號(hào)的寬度應(yīng)該保持一致，均為3.5 μs。同時(shí)，2個(gè)信號(hào)之間應(yīng)存在一定的間隔，間隔時(shí)間為光斑間隔距離除以編碼微球流動(dòng)速度，約為10 μs。

示波器探測(cè)得到的脈沖信號(hào)形態(tài)如圖7所示。

圖7 示波器中FL3熒光通道信號(hào)形態(tài)Fig.7 Signal form of FL3 fluorescent channel in oscilloscope

由圖7可知，示波器中信號(hào)形態(tài)與理論預(yù)測(cè)保持一致。示波器中橫坐標(biāo)單格為2 μs，兩個(gè)脈沖信號(hào)的寬度均為3.5 μs。同時(shí)，2個(gè)光斑之間存在一定時(shí)間間隔，其間隔時(shí)間約為10 μs。

以上結(jié)果說明光學(xué)系統(tǒng)的光斑尺寸與空間分離距離與理論設(shè)計(jì)值保持一致，表明光學(xué)系統(tǒng)的光斑性能滿足設(shè)計(jì)要求。

3.2 綜合性能評(píng)估

采用6Peaks標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)鈱W(xué)系統(tǒng)的綜合性能進(jìn)行評(píng)估。6Peaks標(biāo)準(zhǔn)微球常被用于評(píng)估流式細(xì)胞儀的各項(xiàng)性能，包括熒光靈敏度、熒光線性等。光學(xué)系統(tǒng)綜合性能評(píng)估結(jié)果如圖8所示。

圖8 光學(xué)系統(tǒng)綜合性能評(píng)估結(jié)果Fig.8 Integrated performance evaluation results of optical system

根據(jù)測(cè)試結(jié)果對(duì)3個(gè)熒光通道的熒光靈敏度進(jìn)行計(jì)算，得到FL1、FL2、FL3的熒光靈敏度分別為40 MESF、28 MESF、13 MESF，熒光線性相關(guān)性R2分別為熒光線性0.999 9、0.998 2、1.000 0。以上性能可滿足液相芯片解碼和目標(biāo)待測(cè)物濃度探測(cè)的需求。

4 結(jié)論

在基于流式熒光分析儀器的基礎(chǔ)上，筆者提出了創(chuàng)新的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)上采用了激光光斑整形模塊、散射光探測(cè)模塊、熒光探測(cè)模塊設(shè)計(jì)。在獲得各編碼微球的各熒光波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度后，高速信號(hào)處理模塊將對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行數(shù)字化處理，轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)后輸送給流式點(diǎn)陣發(fā)光分析儀，應(yīng)用軟件進(jìn)行分析處理。筆者提出的流式點(diǎn)陣儀采用創(chuàng)新性光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，包括在激光光斑整形光路中，采用二次整形透鏡復(fù)用設(shè)計(jì)，保證2個(gè)激光光斑在水平方向和豎直方向上的尺寸和能量分布完全一致，確保不同波長(zhǎng)激發(fā)出的熒光信號(hào)形態(tài)、寬度完全一致。相比于采用完全獨(dú)立透鏡進(jìn)行光斑整形的光路，減少了透鏡的使用個(gè)數(shù)，光路結(jié)構(gòu)更為緊湊；整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的功能區(qū)塊采用一體化設(shè)計(jì)，各模塊安裝可以一次性完成，安裝或更換更為便利；光學(xué)模塊整體集成度高、結(jié)構(gòu)精簡(jiǎn)，通過光路精確計(jì)算和機(jī)械加工來確保安裝位置的準(zhǔn)確性，安裝完成后，無須調(diào)整任何光學(xué)器件，生產(chǎn)安裝和使用更為便捷。本研究可為流式熒光分析技術(shù)的應(yīng)用和推廣提供良好的基礎(chǔ)。