白 鴿，王國(guó)超，陳 茹，莊安寧，王 靖，韋 唯，秦鴿鴿，吳奇強(qiáng)*

(1.渭南市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西渭南 714000；2.華州區(qū)畜牧發(fā)展中心，陜西華州 714100；3.蒲城縣畜牧發(fā)展中心，陜西蒲城 715500)

布魯氏菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種可威脅公共衛(wèi)生安全和食品安全的嚴(yán)重人獸共患傳染病[1]，以發(fā)熱和流產(chǎn)為主要特征，流行于170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[2]。布病通常是與感染動(dòng)物密切接觸人群的職業(yè)病，而近年有報(bào)道人的布病通過(guò)食源性傳播途徑感染的比例有上升趨勢(shì)，布病人群由職業(yè)人群向普通人群擴(kuò)散[3]。渭南市近年來(lái)大力發(fā)展奶山羊產(chǎn)業(yè)，布病作為人獸共患傳染病嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全和食品安全，對(duì)奶山羊產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展影響巨大，本實(shí)驗(yàn)室曾開展畜間布病流行病學(xué)調(diào)查顯示陽(yáng)性主要集中于羊[4]，開展奶山羊布病監(jiān)測(cè)凈化是控制布病流行、維護(hù)公共衛(wèi)生安全和產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必要途徑，快速、準(zhǔn)確并符合基層實(shí)際的布病診斷方法對(duì)監(jiān)測(cè)凈化至關(guān)重要。當(dāng)前，布病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要分為病原學(xué)、分子生物學(xué)和血清學(xué)，病原學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法如病原菌分離培養(yǎng)鑒定、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)等，對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備條件及生物安全等級(jí)均有一定要求[5-6]，不適用于基層布病快速檢測(cè)診斷；血清學(xué)檢測(cè)方法較多，主要包括虎紅平板凝集試驗(yàn)(rose bengal plate agglutination test,RBT)、試管凝集試驗(yàn)(serum agglutination test,SAT)、全乳環(huán)狀試驗(yàn)(milk ring test,MRT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test,CFT)、熒光偏振試驗(yàn)(fluorescence polarization immunoassay,FPA)、ELISA等，且各有優(yōu)缺點(diǎn)，在臨床檢測(cè)中，同一份血清樣品用不同方法檢測(cè)，結(jié)果不一給檢驗(yàn)人員帶來(lái)了較大困惑[6-8]，適合基層實(shí)際工作的檢測(cè)方法值得研究探討。本文對(duì)RBT、免疫膠體金層析試驗(yàn)(gold immunochromatography assay,GICA)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(indirect enzyme-linked immunosorbent assay,i-ELISA)、SAT與競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(competitive enzyme-linked immunosorbent assay,c-ELISA)等5種常用檢測(cè)方法進(jìn)行比較分析，探討其特性，為基層奶山羊布病診斷和開展監(jiān)測(cè)凈化工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本 近2年收集的渭南市轄區(qū)內(nèi)奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)戶送檢血清479份(根據(jù)免疫政策規(guī)定未免疫布病疫苗)。

1.1.2 檢測(cè)試劑 RBT和SAT抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清,青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品；GICA檢測(cè)試劑,上?？祆`生物科技有限公司產(chǎn)品；i-ELISA和c-ELISA檢測(cè)試劑盒,青島立見生物科技有限公司產(chǎn)品。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(TECAN-Infinite F50)、自動(dòng)洗板機(jī)(TECAN-HydroSpeed)，瑞士帝肯有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱(LRH-250F)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法 RBT和SAT試驗(yàn)按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646-2018)進(jìn)行操作和結(jié)果判定；GICA、i-ELISA和c-ELISA，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

1.2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇 應(yīng)用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)價(jià)不同檢測(cè)方法時(shí)，待評(píng)價(jià)方法與參比方法結(jié)果比較可形成四格表(表1)。敏感性即靈敏度、真陽(yáng)性率，值為(A/P1)×100%，反映診斷試驗(yàn)正確判定的能力；特異性即特異度、真陰性率，值為(D/N1)×100%，反映診斷試驗(yàn)?zāi)苷_排除的能力；假陰性率是指實(shí)際錯(cuò)判為陰性的百分比，值為(C/P1)×100%，反映漏診情況；假陽(yáng)性率是指實(shí)際錯(cuò)判為陽(yáng)性的百分比，值為(B/N1)×100%，反映誤診情況；符合率即粗一致性，是指待評(píng)價(jià)方法真陽(yáng)性和真陰性樣本占總樣本數(shù)的百分比；Kappa一致性檢驗(yàn)是考核待評(píng)價(jià)方法真實(shí)性和一致性的方法，Kappa值是一致性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，一般認(rèn)為，Kappa值≥0.75，說(shuō)明已經(jīng)取得相當(dāng)滿意的一致程度，若Kappa值<0.4，則說(shuō)明一致程度不夠理想[9]。

表1 待評(píng)價(jià)檢測(cè)方法與參比檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果形成的四格表

2 結(jié)果

2.1 不同檢測(cè)方法檢測(cè)陽(yáng)性率

用RBT、GICA、i-ELISA、SAT與c-ELISA等5種檢測(cè)方法對(duì)479份奶山羊血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，GICA檢出陽(yáng)性最多，陽(yáng)性率為10.02%；i-ELISA次之，陽(yáng)性率為8.35%；SAT檢出陽(yáng)性最少，陽(yáng)性率為6.26%(表2)。

表2 不同檢測(cè)方法檢測(cè)的陽(yáng)性率

2.2 虎紅平板凝集試驗(yàn)與免疫膠體金層析試驗(yàn)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較

RBT與GICA兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較，RBT檢出的36份陽(yáng)性樣品中GICA檢出1份陰性，443份陰性樣品中檢出13份陽(yáng)性，符合率為97.08%，Kappa值為0.818；RBT與i-ELISA檢測(cè)結(jié)果比較，RBT檢出的36份陽(yáng)性樣品中i-ELISA檢出1份陰性，443份陰性樣品中檢出5份陽(yáng)性，符合率為98.75%，Kappa值為0.914(表3)。

表3 RBT與GICA、i-ELISA檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 5種檢測(cè)方法相關(guān)性比較

根據(jù)《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》(農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2007〕12號(hào))及《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646-2018)要求，SAT為傳統(tǒng)的血清學(xué)確診方法，本試驗(yàn)以SAT作為參比檢測(cè)方法，比較5種方法的相關(guān)性。SAT與RBT、GICA、i-ELISA、c-ELISA符合率分別為98.33%、96.24%、97.06%、98.75%；SAT檢出的30份陽(yáng)性樣品，用GICA和c-ELISA全部檢出，敏感性100%，i-ELISA敏感性最低，為93.33%；SAT檢出的449份陰性樣品，c-ELISA檢出443份，特異性最高，為98.66%，GICA特異性最低，為95.99%；GICA假陽(yáng)性率最高，為4.01%；i-ELISA假陰性率最高，為6.67%(表4)。

表4 SAT與RBT、GICA、i-ELISA、c-ELISA檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性比較

利用SPSS 23.0軟件對(duì)表4中5種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，結(jié)果如表5所示，5種方法Kappa值均大于等于0.75，說(shuō)明一致性較好。與SAT相比，c-ELISA一致性最好，Kappa值最大，為0.902；i-ELISA一致性最差，Kappa值最小，為0.750。

表5 5種不同檢測(cè)方法的一致性比較

3 討論

目前，用于布病檢測(cè)的血清學(xué)檢測(cè)方法較多，雖然《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646-2018)中規(guī)定了相關(guān)檢測(cè)方法，但對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度等未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，診斷試劑不同廠家、不同批次之間敏感性、特異性、符合率等都存在差異，因而存在診斷結(jié)果的多樣性和不確定性[8，10]。

本文用不同的布病血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)同一批奶山羊血清樣品進(jìn)行了同步檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較分析。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，GICA、i-ELISA與RBT相比，符合率分別為97.08%和98.75%，Kappa值分別為0.818和0.914，符合率和一致性均比較高。SAT與RBT、GICA、i-ELISA、c-ELISA比較，符合率c-ELISA最高，GICA最低，分別為98.75%和96.24%；Kappa值均大于等于0.75，一致性c-ELISA最好，i-ELISA最差，Kappa值分別為0.902和0.750；GICA和c-ELISA敏感性100%，i-ELISA敏感性最低，為93.33%；特異性c-ELISA最高，GICA最低，分別為98.66%和95.99%；GICA假陽(yáng)性率最高，為4.01%，易出現(xiàn)誤診情況；i-ELISA假陰性率最高，為6.67%，易出現(xiàn)漏診情況。綜上所述，c-ELISA的敏感性、特異性、符合率、假陽(yáng)性率、假陰性率及Kappa檢驗(yàn)一致性均為最好，RBT次之，GICA敏感性高，假陰性率低。

RBT、i-ELISA、SAT和c-ELISA均為GB/T 18646-2018規(guī)定的檢測(cè)方法，通常RBT和i-ELISA用于初篩檢測(cè)，SAT和c-ELISA用于復(fù)核確診。RBT敏感性高、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便且成本低，對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件條件和人員技術(shù)要求相對(duì)不高，但其結(jié)果易受人為主觀判斷和環(huán)境因素影響；i-ELISA敏感性高、樣品用量少、高通量適合大批量樣本篩查，但成本較高，需要相應(yīng)的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員；SAT準(zhǔn)確性高、可以半定量、成本低、不需要專業(yè)儀器設(shè)備，但操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果可因主管判斷因素影響；c-ELISA敏感性高、準(zhǔn)確性好、樣品用量少、適合于大批量樣本確診檢測(cè)，但成本相對(duì)較高，需要相應(yīng)的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員；GICA雖未列入國(guó)標(biāo)，但敏感性高、檢測(cè)快速，不需要專業(yè)儀器設(shè)備，操作和結(jié)果判定簡(jiǎn)便，可用于初篩[11-13]。

因此，基層奶山羊布病監(jiān)測(cè)凈化過(guò)程中，對(duì)于診斷方法的選擇要結(jié)合布病流行率、人員、經(jīng)費(fèi)、實(shí)驗(yàn)室條件等實(shí)際情況。在低流行率區(qū)域大范圍開展監(jiān)測(cè)凈化工作時(shí)，可考慮高敏感性、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便等方法進(jìn)行檢測(cè)，如RBT或GICA；但在高流行率區(qū)域監(jiān)測(cè)凈化時(shí)考慮撲殺成本或在凈化評(píng)估時(shí)，則要綜合考慮檢測(cè)方法的敏感性和特異性，推薦RBT或GICA初篩，c-ELISA復(fù)核確診，通過(guò)兩種及以上方法聯(lián)合診斷較為理想。