■ 王凱 阮鵬飛（ 江門市澳保生物科技有限公司 ； 江門市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ）

圖1 患病大口黑鱸體表病癥

圖2 患病大口黑鱸內(nèi)臟解剖圖（a、頭腎；b、后腎；c、心臟；d、肝臟；e、脾臟；f、果凍狀黃色腹水）

大口黑鱸（Micropterus salmoide），俗稱加州鱸。屬于鱸形目、鱸亞目、太陽(yáng)魚(yú)科，是一種純淡水的廣溫性肉食性魚(yú)類。原產(chǎn)于北美洲的淡水水域，后引入英國(guó)、法國(guó)、西非、巴西、菲律賓等國(guó)及我國(guó)香港、臺(tái)灣等地區(qū)養(yǎng)殖，其養(yǎng)殖水域幾乎遍布全球。20世紀(jì)80年代初引入我國(guó)內(nèi)地，現(xiàn)已推廣到全國(guó)許多省市，成為我國(guó)特種水產(chǎn)品之一。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖密度的不斷擴(kuò)大，病害問(wèn)題不斷增多，其中，作為引起人類感染的重要人畜共患病原微生物，愛(ài)德華氏菌是魚(yú)類中最重要的細(xì)菌性疾病之一，困擾著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，在淡水魚(yú)類養(yǎng)殖中引起敗血癥和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

愛(ài)德華氏菌屬腸桿菌科，2012年以前，世界公認(rèn)的愛(ài)德華氏菌屬分為三個(gè)種，包括遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda, E.tarda）、?？茞?ài)德華氏菌（EdwardsiellaHoshinae, E.hoshinae）和鮰愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictalurid, E.ictaluri），其中，分布和宿主范圍較廣的是遲緩愛(ài)德華氏菌，由于遲緩愛(ài)德華氏菌的不同來(lái)源的分離株在表型和遺傳特征方面存在著很多的差異，自2013年Abayneh等人的研究將異于遲緩愛(ài)德華氏菌的分離株重新命名為殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella piscicida），殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌呈全球性地理分布，宿主范圍也十分廣泛，多為海水和咸淡水魚(yú)類，包括加州鱸、尖吻鱸、白鮭魚(yú)、歐洲鰻鱺、真鯛、斑點(diǎn)叉尾鮰、大菱鲆和黑斑刺魟等，給相關(guān)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，通過(guò)對(duì)該屬細(xì)菌的研究，優(yōu)化診斷方法，提升防控效率，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有著十分重要的意義。

本研究以廣東省佛山市杏壇鎮(zhèn)區(qū)域養(yǎng)殖塘發(fā)病大口黑鱸的細(xì)菌性病原體為研究對(duì)象。通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行分離純化，觀察形態(tài)；將分離純化的菌株進(jìn)行菌種鑒定；以及制作組織印片，觀察各組織中細(xì)菌的形態(tài)及分布情況；通過(guò)組織切片，觀察各組織的病變；結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，記錄病原菌對(duì)各種抗生素的敏感性。文中描述了大口黑鱸感染愛(ài)德華氏菌后引起的癥狀，為大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)提供更多的病害預(yù)防及診斷思路；通過(guò)分析藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷愛(ài)德華氏菌的敏感抗生素藥物，為大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)提供更多的病害防控策略，本文中的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅對(duì)本次采樣的大口黑鱸病魚(yú)，針對(duì)不同的塘養(yǎng)殖的大口黑鱸感染愛(ài)德華氏菌后，應(yīng)再次進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，分析敏感藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI）和革蘭氏染色液購(gòu)自環(huán)凱微生物，藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，超白吸附載玻片和蓋玻片購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集和病原分離及鑒定

2021年11～12月，對(duì)廣東省佛山市杏壇鎮(zhèn)區(qū)域養(yǎng)殖塘大口黑鱸自然發(fā)病病樣進(jìn)行多次采樣，對(duì)發(fā)病情況、病理特征等進(jìn)行檢測(cè)。采用平板劃線法，在BHI 固體培養(yǎng)基上對(duì)瀕死的患病大口黑鱸的后腎、脾臟和皮下膿腫等進(jìn)行接種培養(yǎng)，置于28℃生化培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。選擇呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的單菌落，在BHI 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化分離，從而得到單菌落，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。將純化分離的含有單菌落的平板送至鑒定公司進(jìn)行菌種鑒定。

將菌株的16s rDNA基因擴(kuò)增序列通過(guò)NCBI（National Center for Biotechnology Information）進(jìn)行同源性分析，選取相關(guān)性較高的16s rDNA序列使用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)分析，使用MEGA5.0軟件中的鄰接法（Neighbor Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 組織印片

對(duì)采集樣品的肝臟、脾臟、腎臟和血液進(jìn)行涂片，干燥后進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，在載玻片上均勻滴加瑞氏染液1mL，染色1min，然后在瑞氏染色液中均勻滴加吉姆薩染色液3mL，染色20min。染色完成后，用蒸餾水將染色液沖洗干凈，繼續(xù)沖洗至染色區(qū)域?yàn)榈仙?，注意不要直接沖洗染色部分，干燥后在100倍油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 組織切片

將病魚(yú)的心臟、肝臟、脾臟和腎臟組織切塊使用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，固定1h后更換一次4%多聚甲醛溶液，寄出進(jìn)行組織切片制作。

1.2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

挑選分離純化的單菌落置于BHI液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，28℃下?lián)u床培養(yǎng)24h，吸取100μl菌液滴加在BHI固體培養(yǎng)基上，均勻涂布，將藥敏片貼于培養(yǎng)基上，放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察測(cè)量抑菌圈大小并判定結(jié)果。

1.2.5 人工回感實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)采取 3尾購(gòu)自廣東佛山某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的健康大口黑鱸，取其內(nèi)臟組織進(jìn)行研磨，在BHI平板上進(jìn)行涂布，培養(yǎng)24h后無(wú)優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)。再購(gòu)12尾大口黑鱸暫養(yǎng)3d后進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，人工感染實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組：取已確定健康無(wú)病的加州鱸6尾，使用無(wú)菌水將本文分離的菌種濃度調(diào)整成106，每尾魚(yú)注射0.5mL的菌液。對(duì)照組：取同樣的6尾魚(yú)，每尾魚(yú)注射等量的無(wú)菌水，感染期間每天記錄各組魚(yú)的癥狀及死亡情況，并對(duì)瀕死的魚(yú)進(jìn)行解剖觀察和分離細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病病例臨床癥狀

發(fā)病大口黑鱸主要為1齡大口黑鱸，觀察病魚(yú)體表，發(fā)現(xiàn)體表血點(diǎn)，爛鰓，眼球突出，黃身，解剖后可見(jiàn)果凍狀或血樣腹水，心臟糜爛，心膜炎，尾柄皮下膿腫，頭腎、后腎腫大，空胃，脾臟腫大充血，脾臟大量白點(diǎn)，肝臟腫大，豆腐肝的癥狀。

2.2 細(xì)菌分離及鑒定

通過(guò)平板劃線對(duì)病魚(yú)組織中的細(xì)菌進(jìn)行粗分，28℃培養(yǎng)24h后，平板上長(zhǎng)出優(yōu)勢(shì)菌，將優(yōu)勢(shì)菌劃線，進(jìn)行純化分離，置于28℃培養(yǎng)24h后，獲得單一菌種，菌種在BHI培養(yǎng)基上形成的菌落特征為圓形不透明、淡黃色、表面濕潤(rùn)光滑、邊緣整齊（圖3，b），革蘭氏染色結(jié)果系顯示該菌為革蘭氏陰性菌（圖3，c）。將單一菌種平板寄出進(jìn)行鑒定，進(jìn)行16s rDNA測(cè)序，將測(cè)序所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果該菌與殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌一致性達(dá)99.19%，并將該菌株命名為PB-025。

圖3 菌株的生長(zhǎng)情況和染色形態(tài)（a、后腎及脾臟菌種粗分離；b、純化后菌落的生長(zhǎng)形態(tài)；c、菌種革蘭氏染色呈陰性[紅色]）

利用MEGA5.0軟件采用鄰接法（Neighbor Joining method）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示（圖4），菌株P(guān)B-025與殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌（Edwardella piscicida）聚為一支。

圖4 基于菌株P(guān)B-025 16s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 愛(ài)德華氏菌在各組織中的分布(a、肝臟中的愛(ài)德華氏菌；b、脾臟中的愛(ài)德華氏菌；c、腎臟中的愛(ài)德華氏菌；d、血液中的愛(ài)德華氏菌；標(biāo)尺為20μm)

2.3 組織印片

對(duì)患病大口黑鱸的肝臟、脾臟、腎臟和血液進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，染色后能夠很好的觀察到各組織中的殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的分布情況，可見(jiàn)在肝臟、脾臟、腎臟和血液中均有游離或吞噬的愛(ài)德華氏菌，細(xì)菌長(zhǎng)約3～5μm。

2.4 組織切片

從組織切片結(jié)果中可得，在心膜的致密層中明顯可見(jiàn)大量的愛(ài)德華氏菌（圖6，a），且愛(ài)德華氏菌感染會(huì)引起心膜炎，導(dǎo)致心臟外膜變厚，以及心臟海綿層中會(huì)形成肉芽腫結(jié)構(gòu)（圖6，b）；脾臟造血區(qū)域一直是受影響最嚴(yán)重的組織，脾臟中可見(jiàn)大量的肉芽腫結(jié)構(gòu)（圖6，c）；腎臟中包含多灶性到合并的肉芽腫（圖6，d）；病變?cè)诟闻K中不算嚴(yán)重，但也可見(jiàn)少量的凝固性壞死灶（圖6，e）。肉芽腫性炎癥、壞死灶和細(xì)菌的可變組合是感染愛(ài)德華氏菌病樣組織中常見(jiàn)的組織病理癥狀。

圖6 自然感染的大口黑鱸中愛(ài)德華氏菌相關(guān)病變的顯微照片(a、b：心臟的病變，a：標(biāo)尺為20μm，b：標(biāo)尺為200μm；c：脾臟的病變，標(biāo)尺為500μm；d：腎臟的病變，標(biāo)尺為100μm；e：肝臟的病變，標(biāo)尺為200μm)

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

將擴(kuò)培的愛(ài)德華氏菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示：PB-025菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、丁胺卡那、諾氟沙星、卡那霉素和四環(huán)素呈現(xiàn)高度敏感，對(duì)恩諾沙星、頭孢拉定、阿奇霉素、鏈霉素和慶大霉素呈現(xiàn)中度敏感，對(duì)阿莫西林和紅霉素呈現(xiàn)低度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明和青霉素具有耐藥性。該結(jié)果與加州鱸遲緩愛(ài)德華氏菌的敏感性藥物存在一定的一致性。

表1 各藥物的抑菌圈信息

2.6 人工回感實(shí)驗(yàn)

健康無(wú)病的大口黑鱸在感染第5d后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，發(fā)病病癥與自然發(fā)病的魚(yú)存在相似性，18d內(nèi)累計(jì)死亡率為100%，而對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡情況（圖7），實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本文分離的菌株P(guān)B-025具有較強(qiáng)的致病力。且從人工感染的大口黑鱸組織中再次分離致病菌，菌落形態(tài)及革蘭氏染色與自然發(fā)病的病原菌的一致，結(jié)果表明本文從自然發(fā)病的大口黑鱸所分離的細(xì)菌為此次發(fā)病的致病菌。

圖7 菌株P(guān)B-025的人工感染實(shí)驗(yàn)

3 討論

目前，對(duì)于魚(yú)類愛(ài)德華氏菌的理化特性、致病機(jī)制以及防控手段都有相關(guān)研究，其中，防控手段尤為重要，有研究表明可通過(guò)免疫預(yù)防手段防控愛(ài)德華氏菌，抗E.tarda的單抗可以顯著提高牙鲆抵抗愛(ài)德華氏菌的能力，延長(zhǎng)存活時(shí)間；有研究研制出遲緩愛(ài)德華氏菌的滅活疫苗，能夠?qū)Υ罅怫覑?ài)德華氏菌病起到重要的保護(hù)作用，能夠有效抵御遲緩愛(ài)德華氏菌的強(qiáng)毒株；也有研究研制出針對(duì)感染遲緩愛(ài)德華氏菌的羅非魚(yú)的菌蛻疫苗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該疫苗有較高的免疫保護(hù)率。

由于殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌是自2013年遲緩愛(ài)德華氏菌區(qū)別開(kāi)來(lái)，因此對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的相關(guān)研究還相對(duì)較少，其中，有研究報(bào)道了在患病烏鱧中檢測(cè)到了殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌，并對(duì)該菌株進(jìn)行了藥敏實(shí)驗(yàn)，有研究為構(gòu)建養(yǎng)殖大菱鲆殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌快速檢測(cè)模型提供了思路，也有研究報(bào)道了斑馬魚(yú)和草魚(yú)組蛋白核苷酸的多態(tài)性在殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌感染中的作用，篩選出了能增強(qiáng)魚(yú)類免疫力及對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的抗病力的抗菌組蛋白，同時(shí)也有研究構(gòu)建了殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌的 Δcrp 疫苗候選株，但僅有這些研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，為了防控殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌給魚(yú)類帶來(lái)的危害，減少魚(yú)類養(yǎng)殖過(guò)程中的經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)當(dāng)重視在養(yǎng)殖過(guò)程中遇到的殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌感染。本研究采用的瑞氏-吉姆薩染色法能夠快速簡(jiǎn)便的對(duì)殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌進(jìn)行初步鑒定，并通過(guò)藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行精準(zhǔn)用藥獲得了成功，本次研究也驗(yàn)證了使用吉姆薩染色劑可以更好地觀察細(xì)菌的研究。

首先養(yǎng)殖環(huán)境的好壞與養(yǎng)殖魚(yú)類的健康息息相關(guān)，也是防控愛(ài)德華氏菌病的關(guān)鍵因素。關(guān)于保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境有幾點(diǎn)建議：1、保持良好的水質(zhì)，定期使用環(huán)境友好的益生菌制劑產(chǎn)品，達(dá)到藻相平衡、穩(wěn)水肥水的效果；2、定期改底凈水，達(dá)到分解底部殘餌糞便及有機(jī)污染物，降解毒素，抑制病原菌、寄生蟲(chóng)的滋生，降低養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)一步惡化的風(fēng)險(xiǎn)；3、定期消毒與內(nèi)服保健，抑制有害菌生長(zhǎng)，提高養(yǎng)殖動(dòng)物自身免疫力的同時(shí)促進(jìn)魚(yú)體傷口恢復(fù)；4、根據(jù)養(yǎng)殖病害“三環(huán)”理論做好全面防御。

同時(shí)養(yǎng)殖密度也十分關(guān)鍵，適當(dāng)?shù)酿B(yǎng)殖密度、科學(xué)飼喂，能明顯降低細(xì)菌性疾病的發(fā)生率。定期拌喂中草藥類、維生素類、保肝護(hù)肝類、提高免疫力類的產(chǎn)品，可增強(qiáng)體質(zhì)，提高養(yǎng)殖動(dòng)物自身免疫力，減少應(yīng)激；另外要加強(qiáng)管理，在投放魚(yú)苗前做好魚(yú)塘的清塘和消毒工作，并避免混養(yǎng)不同生長(zhǎng)階段的魚(yú)，其次對(duì)病原菌的出現(xiàn)進(jìn)行密切監(jiān)控也是防控的有效方法。

最后，在魚(yú)類發(fā)生細(xì)菌性病害時(shí)，應(yīng)針對(duì)病癥尋找真正原因，做到有效、精準(zhǔn)用藥。在預(yù)防與治療的同時(shí)，避免濫用藥物導(dǎo)致環(huán)境惡化、病原菌耐藥性產(chǎn)生，而給養(yǎng)殖埋下更大的隱患。 （參考文獻(xiàn)略）